우리는 엽록소 형광을 사용하여 낮은CO2 로 처리 한 후 식물에서 광합성 효율의 변화를 측정하는 접근법을 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
광합성과 광호흡은 식물의 1차 대사에서 가장 큰 탄소 플럭스를 나타내며 식물 생존에 필요합니다. 광합성과 광호흡에 중요한 많은 효소와 유전자는 수십 년 동안 잘 연구되어 왔지만 이러한 생화학 적 경로의 일부 측면과 여러 세포 하 과정과의 혼선은 아직 완전히 이해되지 않았습니다. 식물 대사에 중요한 유전자와 단백질을 확인한 많은 작업은 자연 및 농업 환경에서 광합성과 광호흡이 어떻게 기능하는지 가장 잘 나타내지 않을 수있는 고도로 통제 된 환경에서 수행되었습니다. 비생물적 스트레스가 광합성 효율을 손상시킨다는 점을 고려할 때, 비생물적 스트레스와 광합성에 미치는 영향을 모두 모니터링할 수 있는 고처리량 스크린의 개발이 필요합니다.
따라서, 우리는 엽록소 형광 분석 및 낮은CO2 스크리닝을 사용하여 광호흡에서 역할을 하는 특성화되지 않은 유전자를 식별할 수 있는 비생물적 스트레스로 인한 광합성 효율의 변화를 스크리닝하는 비교적 빠른 방법을 개발했습니다. 이 논문은 애기장대 탈리아나에서 전달된 DNA(T-DNA) 녹아웃 돌연변이체의 광합성 효율 변화를 연구하는 방법을 설명합니다. 동일한 방법을 에틸 메탄술포네이트(EMS) 유도 돌연변이체 스크리닝 또는 억제기 스크리닝에 사용할 수 있습니다. 이 방법을 활용하면 식물 1 차 대사 및 비 생물 적 스트레스 반응에 대한 추가 연구를위한 유전자 후보를 식별 할 수 있습니다. 이 방법의 데이터는 증가 된 스트레스 환경에 노출 될 때까지 인식되지 않을 수있는 유전자 기능에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다.
서론
농부의 밭에서 흔히 볼 수있는 비 생물 적 스트레스 조건은 광합성 효율을 감소시켜 작물 수확량에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다. 열파, 기후 변화, 가뭄 및 토양 염분과 같은 해로운 환경 조건은 CO2 가용성을 변경하고 높은 빛 스트레스에 대한 식물의 반응을 감소시키는 비 생물 적 스트레스를 유발할 수 있습니다. 가장 큰 두 개의 육상 탄소 플럭스는 식물 성장과 작물 수확량에 필수적인 광합성과 광호흡입니다. 이러한 과정에 관여하는 많은 중요한 단백질과 효소는 실험실 조건에서 특성화되었으며 유전 수준1에서 확인되었습니다. 광합성과 광호흡을 이해하는 데 많은 진전이 있었지만 식물 세포 기관 간의 수송을 포함한 많은 단계가 특성화되지 않은 상태로 남아 있습니다 2,3.
광합성 후 식물에서 두 번째로 큰 탄소 플럭스 인 광호흡은 효소 Rubisco가 이산화탄소 대신 산소를 리불 로스 1,5 비스 포스페이트 (RuBP)에 고정시켜 억제 화합물 2- 포스 포 글리콜 레이트 (2PG)1. 2PG의 억제 효과를 최소화하고 이전에 고정 된 탄소를 ....
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프로토콜
1. 종자 준비 및 살균
알림: 종자 준비는 종자 흡수와 종자 살균으로 구성됩니다. 이러한 모든 단계는 멸균 상태를 유지하기 위해 층류 후드에서 수행되어야한다는 점에 유의해야합니다. 필요한 모든 재료, 시약 및 성장 배지는 오토클레이브되어야 합니다( 재료 표 참조).
- 종자 흡수 및 층화
참고: 사용된 시드 라인은 plgg1-1 (salk_053463), abcb26 (salk_085232) 및 와일드형(WT, Col-0)입니다.- 씨앗을 1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브에 분주합니다. 층류 후드의 멸균 된 물에 씨앗을 흡수하고 어둠 속에서 4 ° C에서 2 일 동안 층화합니다.
- 종자 살균
- 멸균 조건에서 50%(v/v) 표백제 용액 10mL를 준비하고 트윈 20 약 20μL를 추가합니다. 종자 살균을 위해 흡수 된 종자에서 물을 제거하고 표백제 용액 1mL를 미세 원심 분리기 튜브에 넣고 실온에서 5 분 동안 배양합니다.
- 피펫으로 표백제를 제거하십시오.
- 씨앗을 멸균수 1mL로 헹구어 재현탁합니다. 씨앗이 바닥에 가라 앉으면 물을....
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결과
결과는 WT 및 시험 돌연변이체의 주변 및 낮은CO2 스크리닝으로부터의 원시 및 형광 이미지의 플레이트 이미지를 보여준다. 각 묘목은 면적 번호로 표시되어 있으며 해당 형광 판독값은 QY로 제공됩니다. 데이터는 텍스트 파일로 내보내지고 분석을 위해 스프레드시트에서 열 수 있습니다(보충 표 S1 참조). 돌연변이 라인 plgg1-1 및 abcb26은 광호흡 스트레스와 관련된 유전자의 양성 및 음성 동정을 입증하기 위해 선택되었습니다. PLGG1은 RuBP6의 산소화 후 경로의 첫 번째 수송 체를 코딩하는 반면, ABCB26은 광호흡11에 관여하는 것으로 알려지지 않은 항원 수송 체를 코딩하는 것으로 생각됩니다. WT 및 돌연변이체의 어두운 적응 Fv/Fm QY 효율은 상자 및 수염 플롯으로 시각화됩니다. WT와 검정 돌연변이체 간의 통계적 차이를 검정하기 위해, p.......
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토론
이 백서에 설명된 실험 방법에는 몇 가지 장점과 한계가 있습니다. 한 가지 장점은이 방법이 많은 식물 묘목을 스크리닝 할 수 있다는 것입니다., 도금 및 성장 과정에서 식물 매체 플레이트의 오염을 방지하기 위해 몇 가지 예방 조치를 취해야합니다. 따라서 애기장대 판을 수술 용 테이프로 밀봉하는 것이 중요합니다. 이 실험의 또 다른 장점은 이전에 발표 된 작업8에 비해 12 시간의 광호흡 스트레스 기간이 짧다는 것입니다. 치료 시간의 감소는 WT와 선택된 돌연변이체 사이의 Fv/Fm의 차이를 더 잘 구별하기 위한 것이었다. 치료 시간은 돌연변이 균주에서의 표현형의 중증도 및 실험 셋업에서의CO2 의 수준에 따라 변화될 필요가 있을 수 있다. 그러나 한 가지 제한 사항은 이 방법을 사용하려면 형광계가 측정하고 Fv/Fm 값을 계산할 수 있을 만큼 충분히 큰 잎 영역이 필요하다는 것입니다. 테스트된 묘목의 초기 성장 시간을 조정하면 형광계 이미저가 이미징 중에 잎이 겹치지.......
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공개 사항
저자는 경쟁하는 재정적 이해 관계나 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 루이지애나 이사회 (AWD-AM210544)의 자금 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 종자 살균용 | 1.5mL 미세 원심분리기 튜브 | VWR | 10810-070 |
| 아가로스 | VWR | 9012-36-6 | 분말 도금의 용이성을 위해 종자를 현탁하는 데 사용되는 화학 물질 |
| <abcb26>)종자(abcb26/em) | ABRC, TAIR www.arabidopsis.org 를 통해 주문 | SALK_085232 | 실험 그룹으로 |
| 사용되는 애기장대 종자Arabidopsis thaliana 씨앗 (plgg1-1) | ABRC, TAIR www.arabidopsis.org 를 통해 주문됨 | SALK_053469C 부모 애기장대 씨앗 | |
| Arabidopsis thaliana seeds (WT) | ABRC, TAIR www.arabidopsis.org | Col-0 | 애기장대 야생형 종자를 통해 주문, 대조군으로 사용 |
| 표백제 | Clorox | 일반 표백제 | 종자를 살균하는 데 사용되는 화학 물질 |
| Carbolime absorbent | Medline products | S232-104-001 | CO2 absorbent |
| Closed FluorCam | Photon Systems Instruments | FC 800-C | Fluorescence Imager |
| FluoroCam FC 800-C | Photon Systems Instruments | Closed FluorCam FC 800-C/1010-S | Fluorescence Imager |
| FluoroCam7 | Photon Systems Instruments | Closed FluorCam FC 800-C/1010- S | 형광 이미지 분석 소프트웨어 |
| Gelzan (식물 한천) | Phytotech labs | 71010-52-1 | 화학 물질은 MS 매체를 플레이트로 고형화하는 데 사용됩니다 |
| 유리 플라스크 1 L | Fisherbrand | FB5011000 | 만들고 오토 클레이브하기위한 용기 |
| Skoog Basal Medium with 비타민 & 1.0 g/L MES(MS) | 파이토텍 랩스 | M5531 | 애기장대 묘목을 위한 성장 배지 |
| 수산화칼륨 (KOH) | Phytotech labs | 1310-58-3 | 를 위한 1M 솔루션으로 제조 |
| Mean Well Enterprises | XLG-100-H-AB | 라이트를 의미합니다 | |
| 그리드가 있는 사각 페트리 접시, 멸균 | Simport Scientific | D21016 | 아라비도시스 묘목용 MS 미디어를 보관하는 데 사용되며, |
| 수술 테이프 | 3M | 1530-1 | 테이프로 플레이트를 밀봉하는 데 사용됩니다 |
| 20 | biorad | 9005-64-5 | 종자 살균을 돕는 데 사용되는 계면 활성제 |
참고문헌
- Peterhansel, C., et al. Photorespiration. Arabidopsis Book. 8, 0130(2010).
- Bordych, C., Eisenhut, M., Pick, T. R., Kuelahoglu, C., Weber, A. P. Co-expression analysis as tool for the discovery of transport proteins in photorespiration. Plant Biology. 15 (4), 686-693 ....
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재인쇄 및 허가
