포스포단백질 포스파타제와 그 상호작용자를 확인하기 위한 질량분석법 기반 접근법

요약

여기에서, 우리는 세포 및 조직으로부터 내인성 포스포단백질 포스파타제와 이들의 상호작용하는 단백질의 농축과 질량 분광법 기반 프로테오믹스에 의한 이들의 확인 및 정량화를 위한 프로토콜을 제시한다.

초록

대부분의 세포 과정은 동적 단백질 인산화에 의해 조절된다. 단백질의 삼분의 일 이상이 인산화되고, 포스포단백질 포스파타제(PPPs)는 모든 세포 세린/트레오닌 탈인산화의 90% 이상을 배위한다. 단백질 인산화의 탈조절은 암 및 신경변성을 비롯한 다양한 질병의 병태생리학에 연루되어 왔다. 그들의 광범위한 활동에도 불구하고, PPP를 통제하는 분자 메커니즘과 PPP에 의해 제어되는 메커니즘은 저조한 특성화되어 있습니다. 여기에서, 포스파타제 억제제 비드 및 질량 분광분석법 (PIB-MS)이라고 불리는 프로테오믹 접근법은 임의의 세포주 또는 조직을 사용하여 12 시간만큼 적은 시간에 PPPs, 이의 번역 후 변형, 및 이들의 상호작용자를 확인하고 정량화하기 위해 기술된다. PIB-MS는 내인성 PPP 및 이들의 관련 단백질(PPPome이라고 함)을 포획하고 풍부하게하기 위해 세파로스 비드에 고정화된 비선택적 PPP 억제제인 마이크로시스틴-LR(MCLR)을 이용한다. 이 방법은 PPPs의 태그된 버전의 외인성 발현 또는 특정 항체의 사용을 필요로 하지 않는다. PIB-MS는 진화적으로 보존된 PPP를 연구하고 탈인산화 신호전달에 대한 현재의 이해를 넓힐 수 있는 혁신적인 방법을 제공합니다.

서론

단백질 인산화는 DNA 손상에 대한 반응, 성장 인자 신호전달, 및 유사분열 ^1,2,3을 통한 통과를 포함하나 이에 한정되지 않는 대부분의 세포 과정을 조절한다. 포유동물 세포에서, 단백질의 대부분은 특정 시점에서 하나 이상의 세린, 트레오닌 또는 티로신 잔기에서 인산화되며, 포스포세린 및 포스포트레오닌은 모든 인산화 부위 ^2,3의 약 98%를 포함한다. 키나아제는 세포 신호전달에서 광범위하게 연구되어 왔지만, 동적 세포 과정의 조절에서 PPP의 역할은 여전히 대두되고 있다.

인산화 역학은 키나아제와 포스파타제 사이의 동적 상호 작용에 의해 제어됩니다. 포유류 세포에는 세린 / 트레오닌 인산화를 촉매하는 400 개 이상의 단백질 키나아제가 있습니다. 이 부위의 90 % 이상이 포스포 단백질 포스파타제 (PPPs)에 의해 탈인산화되며, PP1, PP2A, PP2B, PP4-7, PPT 및 PPZ ^2,3으로 구성된 효소의 작은 군입니다. PP1 및 PP2A는 세포 ^2,3,4 내에서 포스포세린 및 포스포트레오닌 탈인산화의 대부분을 담당한다. 키나아제와 포스파타제 사이의 수의 현저한 차이와 시험관 내에서 PPP 촉매 서브유닛의 특이성의 결여는 키나아제가 인산화 ^2,3의 주요 결정인자라는 믿음을 가져왔다. 그러나, 다수의 연구는 포스파타제가 다량체 홀 로효소 5,6,7,8,9의 형성을 통해 기질 특이성을 확립하는 것으로 나타났다. 예를 들어, PP1은 촉매 서브유닛으로 구성되고, 주어진 시간에, 150개 이상의 조절^{서브유닛 중} 하나 ^6,7,8로 구성되는 이종이량체이다. 반대로, PP2A는 스캐폴딩 (A), 조절 (B), 및 촉매 (C) 서브유닛 ^2,3,9로 형성되는 헤테로삼량체이다. PP2A 조절 서브유닛(B55, B56, PR72 및 스트리아틴)의 네 개의 별개의 패밀리가 있으며, 각각은 다중 유전자, 스플라이스 변이체 및 국소화 패턴 ^2,3,9를 갖는다. PPP의 다량체 성질은 키나제 및 PPP 촉매 서브유닛의 수의 갭을 메운다. 그러나 PPP 신호 분석을 연구하기위한 분석적 과제가 발생합니다. PPP 신호 전달을 종합적으로 분석하려면 세포 또는 조직 내의 다양한 홀로효소를 조사하는 것이 중요합니다. 키나제 억제제 비드, 멀티플렉스 억제제 비드 또는 키노비드라고 불리는 키나제 억제제 비드의 사용을 통해 인간 키노메를 연구하는 데 큰 진보가 이루어졌으며, 키나제 억제제가 비드에 고정화되고 질량 분광법이 농축된 키나아제와 그 상호작용자^10,11,12,13을 확인하기 위해 사용되는 화학적 프로테오믹 전략이다.

우리는 PPP 생물학을 연구하기 위해 비슷한 접근법을 수립했습니다. 이 기술은 포스파타제 억제제 비드(PIBs)^14,15로 불리는 마이크로시스틴-LR(MCLR)이라고 불리는 고정화된 비선택적 PPP 억제제와 함께 비드를 사용하여 PPP 촉매 서브유닛의 친화성 포획을 포함한다. 단백질 활성 또는 국소화를 변경할 수 있는 외인성 PPP 서브유닛의 내인성 태깅 또는 발현을 필요로 하는 다른 방법과는 달리, PIB-MS는 내인성 PPP 촉매 서브유닛, 이들의 관련 조절 및 스캐폴딩 서브유닛, 및 주어진 시점 또는 특정 치료 조건 하에서 세포 및 조직으로부터 상호작용하는 단백질(PPPome이라고 함)의 농축을 허용한다. MCLR은 나노몰 농도에서 PP1, PP2A, PP4-6, PPT 및 PPZ를 억제하여 PIB를 PPPome¹⁶의 농축에 매우 효과적으로 만듭니다. 이 방법은 세포로부터 임상 샘플까지 임의의 출발 물질에 사용하기 위해 스케일링될 수 있다. 여기에서는 내인성 PPPome 및 그 변형 상태를 효율적으로 포착, 식별 및 정량화하기 위해 PIB 및 질량 분광법 (PIB-MS)의 사용을 자세히 설명합니다.

그림 1: PIB-MS 프로토콜의 시각적 요약. PIB-MS 실험에서, 샘플은 세포에서 종양에 이르기까지 다양한 형태로 수득될 수 있다. 샘플은 PPP 농축 전에 수집, 용해 및 균질화된다. PPPs를 풍부하게하기 위해, 용해물은 MCLR과 같은 PPP 억제제가 있거나 없는 PIBs와 함께 인큐베이션된다. 그런 다음 PIB를 세척하고 PPP는 변성 조건에서 용출됩니다. 샘플은 SP3 단백질 농축, 트립틱 소화 및 탈염을 통한 세제 제거에 의한 질량 분광법 분석을 위해 준비됩니다. 이어서, 샘플은 질량 분광법 분석 전에 선택적으로 TMT 표지될 수 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

PIB-MS는 세포 또는 조직의 용해 및 명확화, PIBs를 사용한 용해물의 인큐베이션, 용출, 및 웨스턴 블롯팅 또는 질량 분광법 기반 접근법을 통한 용출액의 분석을 포함한다(도 1). 유리 MCLR의 첨가는 특정 PIB 결합제를 비특이적 인터랙터와 구별하기 위한 대조군으로서 사용될 수 있다. 대부분의 응용 분야에서 라벨이 없는 접근법을 사용하여 용출액에서 단백질을 직접 확인할 수 있습니다. 정량화의 정밀도 향상 또는 저풍부 종의 식별이 필요한 경우, 탠덤 질량 태그(TMT) 라벨링을 사용한 추가 처리를 사용하여 적용 범위를 늘리고 입력을 줄일 수 있습니다.

프로토콜

참고 : PIB의 생성은 Moorhead et al.에 의해 설명 된대로 수행되며, 여기서 1mg의 마이크로 시스틴과 약 6mL의 세파로스가 결합되어 최대 5mg / mL의 결합 능력을 가진 PIB를 생성합니다¹⁷.

1. 시료 준비

참고: PIB-MS의 전형적인 출발량은 조건당 총 단백질 1mg이다. 이 실험을 위해, 대략 2.5 x 10⁶ HeLa 세포를 사용하여 단백질 1 mg을 추출하였다. 이러한 계산은 실험¹⁸에서 사용되는 각 세포주 또는 조직에 대해 수행되어야 한다. 샘플이 제한되고 1mg을 얻을 수 없는 경우, PPP 서브유닛 검출의 경미한 손실로 투입량을 줄일 수 있습니다. 대안적으로, TMT 표지는 하나의 샘플에서 모든 조건의 혼합을 허용하고, 단계 9에 나타낸 바와 같이 검출의 민감도를 증가시키기 위해 채용될 수 있다.

1. 조직 샘플 또는 세포 펠릿을 수집합니다. 세포 펠릿의 경우, 실온(RT)에서 2분 동안 277 x g 에서 원심분리하여 세포를 수집하고, 배지를 제거하고, 세포를 5 mL의 인산완충 식염수(PBS)로 세척한다. 세포 펠릿은 수개월 동안 -80°C에서 저장될 수 있다.
2. 용해 완충액 (500 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 0.5 % 트리톤 X-100 (vol / vol), 5 mM 베타 글리세로 인산 이나트륨 염 오수화물, 1:500 (vol / vol) 프로테아제 억제제 칵테일 III)을 준비하고 얼음 위에 보관하십시오. 모든 샘플을 용해시키고 씻을 수있을만큼 충분히 만드십시오. 조건 당 단백질 1mg으로 시작하는 경우, 용해 및 세척을 위해 샘플 당 약 3 mL의 완충액을 만드십시오.
   참고: 이 단계에서 언급된 용해 완충액은 불용성 막 또는 세포골격-관련 단백질을 가용화하기에 충분하지 않을 수 있는 온화한 세제 용액이다. 가용화를 개선하기 위해 다른 세제를 탐구 할 수 있습니다. 다양한 NaCl 및 Triton-X-100 농도를 테스트하고, 상기 농도는 낮은 배경 및 높은 포스파타제 서브유닛 결합에 최적인 것으로 밝혀졌다.
3. 차가운 용해 완충액을 샘플에 첨가하십시오. 단백질 1mg을 용해시키려면 완충액 1mL를 사용하십시오. 샘플이 얼어 붙으면 용해 버퍼를 추가하고 샘플이 버퍼의 얼음에서 해동되도록하십시오.
   1. 세포의 경우, 음향화를 통해 샘플을 균질화하여 세포를 펄스 사이의 얼음 위에 유지합니다. 세 개의 15 s 펄스로 15 % 진폭에서 샘플을 초음파 처리하십시오. 이것은 사용 된 초음파 처리기에 따라 다를 수 있습니다 ( 재료 표 참조).
   2. 조직의 경우, 먼저 Dounce 조직 분쇄기를 사용하여 샘플을 균질화하여 단계 1.3.1에 설명된 대로 초음파 처리 전에 액화될 때까지 조직을 분쇄한다.
4. 불용성 파편의 균질화된 샘플을 4°C에서 15분 동안 21,130 x g 에서 원심분리하여 명확히 하였다. 이어서, 튜브의 측면에 수집된 형성된 펠릿 또는 지질을 방해하지 않고, 용해물을 새로운 튜브로 옮긴다. 원하는 경우 정화된 용해물의 예비 농축 샘플 중 100 μL를 제거하고 -20°C에서 보관한다. 용해물을 얼음 위에 보관하십시오.
5. 제조업체의 지시에 따라 각 샘플의 작은 분취량에 대해 비친코닌산 분석(BCA)과 같은 단백질 정량 분석을 수행하여 각 샘플의 총 단백질 함량을 결정합니다. 용해물이 BCA 분석 동안 얼음 위에 보관되는지 확인하십시오.
6. BCA 분석을 수행 한 후 동등한 양의 단백질을 새로운 튜브로 옮기고 용해 완충액으로 희석하여 각 튜브의 단백질 농도가 동일한지 확인하십시오 (예 : 1mg / mL). 실험에 PPP 억제제 대조군이 필요한 경우, 동일한 단백질 함량을 갖는 각 샘플의 두 분취량을 준비하고 단계 1.7로 진행한다. PPP 억제제 조절이 필요하지 않은 경우 단계 2로 건너뜁니다. 샘플이 얼음 위에 보관되는지 확인하십시오.
   참고: PIB-MS 분석에서 조건당 동일한 단백질 농도를 사용하는 것이 중요합니다. PPP 억제제 대조군은 PIBs에 대한 특정 결합제를 비특이적 배경으로부터 구별하는데 사용된다.
7. PPP 억제제 대조군의 경우, 하나의 샘플을 유리 MCLR (1 μM)로 처리하고 다른 샘플을 대조군으로서 동일한 부피의 DMSO로 처리하십시오. 샘플을 부드럽게 볼텍스하고 15분 동안 얼음 상에서 인큐베이션한다.
   참고: 용해물의 MCLR 처리는 PPP 촉매 서브유닛의 결합을 차단하지만 샘플에서 PIB에 비특이적으로 결합하는 단백질은 차단하지 않는다. MCLR은 독성이 있으므로 취급할 때는 주의해야 합니다. 재료 표의 취급 주의 사항을 참조하십시오.

2. PIB의 제조

1. 실험에 필요한 PIB의 양을 결정합니다. 단백질 1mg의 경우, 1-3 μg의 PPP와 상호작용하는 단백질을 얻을 수 있습니다. 비드 손실을 최소화하기 위해 샘플당 최소 10μL의 고체 PIB 수지를 사용하십시오. PIB의 결합 용량은 3-5 mg / mL^14,17입니다.
2. 적절한 양의 PIB를 1.5 mL 튜브로 옮기고 부드럽게 볼텍싱한 다음 RT에서 30초 동안 376 x g 에서 원심분리하여 0.5 mL의 용해 완충액으로 3x 세척한다. 세척 사이에 용해 완충액을 제거 할 때 구슬을 피펫팅하지 마십시오.
3. 세척된 PIB에 적절한 양의 용해 버퍼를 추가하여 50% PIB/버퍼 용액(vol/vol)을 만듭니다. 부드럽게 위아래로 피펫을 하고 슬러리의 피펫 팁을 소용돌이 치며 PIB를 재현탁시킵니다.
4. 슬러리 20 μL를 이미 0.5 mL의 용해 완충액을 함유하는 새로운 1.5 mL 튜브로 옮긴다. 튜브의 용해 버퍼는 피펫 팁에서 구슬을 배출하는 데 도움이됩니다. 각 샘플에 대해 동일한 양의 PIB를 포함하는 튜브가 충분할 때까지 이 작업을 수행합니다.
5. RT에서 튜브를 30초 동안 376 x g 로 돌립니다. 모든 튜브에 동일한 양의 비드 수지가 포함되어 있는지 확인하십시오. 모든 상청액을 버리고 고체 수지와 최대 50μL의 용해 완충액만 각 튜브에 남겨 둡니다.

3. 용해물을 사용한 PIB의 인큐베이션

1. 용해물을 단계 1.6으로부터 옮긴다. 또는 1.7 단계. 단계 2로부터의 PIB를 함유하는 적절하게 표지된 튜브에. 용해물을 4°C에서 1시간 동안 PIBs와 함께 8 rpm으로 회전시킨다.

4. PIB의 세척

1. PIBs를 4°C에서 30초 동안 376 x g 에서 원심분리하여 비드를 수집한다. 상청액을 제거하고 버리고, 원하는 경우 농축 후 분석을 위해 100 μL 분취량을 절약한다.
2. 비드에 0.5 mL의 용해 완충액을 첨가하여 PIBs 3x를 세척하고, 튜브를 반전시키고(볼텍싱하지 않음), 4°C에서 30초 동안 376 x g 에서 원심분리하여 비드를 수집하고, 침전된 비드로부터 용해 완충액을 제거하고, 비드 펠릿을 파괴하지 않도록 주의한다.

5. PIB에서 PPP의 용출

1. 최종 세척 후, 임의의 PIB를 피펫팅하지 않고 가능한 한 많은 용해 완충액을 제거한다. 2% SDS(vol/vol)를 포함하는 용출 버퍼를 만들고 용출 버퍼의 충분한 부피를 추가하여 PIB 부피의 4x-5배가 되도록 PPP를 PIB에서 용출시킵니다. 예를 들어, 10μL의 PIB가 사용되는 경우 50μL의 용출 완충액을 사용하십시오. PIBs를 용출 완충액과 함께 65°C에서 1시간 동안 인큐베이션하여 PIBs로부터 PPPs를 용출시킨다.
2. 용출 후, RT에서 30초 동안 튜브를 376 x g 로 원심분리하고 용출액을 별도의 튜브로 피펫팅하여 용출액을 수집하고, PIB를 전달하지 않도록 주의한다. 용출액을 웨스턴 블롯 분석 또는 질량 분광법 분석에 사용하십시오. 용출액은 -20°C에서 최대 수개월 동안 저장될 수 있다.
3. 추가 사용을 위해 PIB를 재생성시키려면, 비드를 2% SDS(vol/vol)에서 인큐베이션하고, RT에서 8rpm으로 1시간 동안 회전시킨다. 세척 당 30분 동안 회전하면서 25 mM Tris-HCl (pH 7.5)로 3x-5x 세척한다. 모든 세척 후, PIB를 아지드 나트륨 (0.05% wt/vol)과 함께 25 mM Tris-HCl (pH 7.5) 저장 완충액에 보관하십시오.
4. 웨스턴 블롯팅 또는 질량 분광법에 의해 용출액을 분석하십시오. PIB 용출액의 질량 분광법 분석은 하기에 기술되어 있다.

6. 세제의 제거

참고: MS 분석을 위해 용출액 샘플에서 세제를 제거하기 위해 다양한 접근법을 사용할 수 있습니다. 우리는 Hughes et al.에 의해 설명 된 단일 냄비, 고체상 강화 샘플 준비 (SP3)가 잘 작동한다는 것을 발견했습니다¹⁹.

1. 0.5 μL의 SP3 비드를 상기 단계 5.2로부터의 용출액 50 μL에 첨가한다. SP3 비드를 10:1(μg:μg) 또는 최소 0.5μg/μL(원액은 50μg/μL)의 비율로 사용하십시오. 부드럽게 구슬을 와류하고 용출하십시오.
2. 비드 용출액 혼합물에 100% 에탄올의 1개의 용출 부피를 첨가한다(예를 들어, 50 μL의 용출액이 사용된 경우, 50 μL의 100% 에탄올을 사용함). 샘플을 24°C에서 1000 rpm으로 진탕하도록 설정된 열믹서에서 5분 동안 인큐베이션한다.
3. 모든 구슬을 수집하려면 마그네틱 튜브 랙에 넣으십시오. 비드가 수집되면 상층액을 버리고 0.5 mL의 80 % 에탄올 (vol / vol) 3x로 비드를 씻으십시오. 세척을 위해, 볼텍싱에 의해 비드를 재현탁시키고, 비드를 마그네틱 튜브 랙에 위치시켜 수집하고, 세척 사이에 상층액을 버린다.
4. 비드를 0.5 mL의 100% 아세토니트릴(ACN)로 한 번 더 세척하여 에탄올의 모든 흔적을 제거하고 가능한 한 많은 ACN을 제거한다.

7. 단백질의 소화

1. 166 mM HEPES (pH 8.5)에서 트립신 (최종 농도 0.004 μg / μL)을 1:100 희석하고이 트립신 용액 30 μL를 비드가있는 각 튜브에 첨가하고 볼텍싱하여 재현탁시킵니다.
2. SP3-트립신 비드 혼합물을 30°C에서 5시간 동안 또는 30°C에서 하룻밤 동안 37°C에서 1000 rpm으로 열믹서에서 인큐베이션한다. 튜브를 마그네틱 랙에 넣어 비드를 모으고 다이제스트를 새 튜브로 제거하십시오.
3. 라벨이 없는 분석을 위해, 20% 트리플루오로아세트산(TFA)(vol/vol)을 0.2% TFA(vol/vol)의 최종 농도에 첨가하여 반응을 켄칭한다. 각 샘플의 pH가 pH 종이로 2-3 사이인지 확인하십시오. 그렇지 않은 경우 달성 될 때까지 20 % TFA의 작은 추가 분취량을 추가하십시오. 샘플은 탈염 전에 적절하게 산성화되어야합니다. 8단계를 계속 진행합니다.
4. 샘플의 TMT 라벨링을 위해, 산성화하지 말고 단계 9로 계속하십시오.

8. 다이제스트 탈염

1. Rappsilber et al.20에 의해 기재된 바와 같이 200 μL의 MS 용매 상용성 팁을 C18 수지로 패킹함으로써 각 샘플에 대한 스테이지 팁을 ^{제조하였다.} 무딘 끝 바늘을 사용하여 두 개의 C18 재료 디스크를 눌러 디스크가 바늘에 남아 있는지 확인합니다. 디스크를 얇은 와이어 플런저를 사용하여 MS 솔벤트 호환 팁으로 전송하여 바늘에서 디스크를 배출합니다.
   참고 : 다른 피펫 팁이 질량 분광법을 통해 검출 될 수있는 샘플에 화학 물질을 침출 할 수 있기 때문에 프로토콜의이 시점부터 MS 용매 호환 팁을 사용하는 것이 중요합니다.
2. 각 단계 팁을 30μL의 100% MeOH로 평형화한 다음, 30μL의 60% MeOH(vol/vol)로 평형을 유지한 다음, 0.1% TFA(vol/vol)의 30μL로 평형을 이룬다. 주사기로 각 용액을 스테이지 팁을 통해 밀어 넣습니다. 필요한 경우 주사기와 스테이지 팁 사이의 접촉을 늘리기 위해 투명 필름으로 주사기 끝에 피펫 팁을 부착하십시오. 스테이지 팁 내부의 C18 재료가 마르지 않도록 하십시오.
3. 단계 7.3에서 산성화된 펩티드 소화물을 표지된 단계 팁에 첨가하고, 주사기로 스테이지 팁을 통해 밀어 넣고, 다시 스테이지 팁이 완전히 건조되지 않도록 주의한다.
4. 각 샘플을 30μL의 0.1% TFA(vol/vol)로 2x 세척한다. 각 단계 팁에 30μL의 60% MeOH(vol/vol)를 첨가하고 주사기 압력으로 팁에서 라벨이 부착된 새로운 튜브로 모든 것을 배출하여 각 단계 팁에서 펩티드를 떼어냅니다. 이것은 C18 재료가 완전히 건조되는 유일한 단계입니다.
5. 진공 원심분리로 각 샘플을 건조시킨다. 건조된 펩티드는 -20°C에서 수개월 동안 저장될 수 있다. 샘플은 이제 라벨이 없는 질량 분광법 분석을 위해 준비되었습니다. 필요한 경우 질량 분광계에서 분석하기 위해 샘플의 절반 만 사용하고 나머지 절반은 재주입에 사용하십시오. 분석을 위해 적절한 질량 분광계 방법을 사용하십시오.

9. TMT 라벨링

참고: 탠덤 질량 태그 라벨링은 정량 분석을 위해 샘플을 멀티플렉싱하는 데 사용됩니다. TMT 시약의 0.8 mg 바이알은 최대 0.8 mg의 단백질²¹을 표지하기에 충분하다. 1mg의 단백질로 시작하는 PIB 풀다운 실험에서, 1-3 μg의 포스포단백질 서브유닛이 얻어진다. 아래의 프로토콜은 최대 10μg의 단백질에 최적입니다.

1. 0.8 mg 바이알의 TMT 시약 중 80 μL의 무수 ACN을 재구성한다.
2. 7.4단계의 각 샘플에 최대 18개 채널에 대해 서로 다른 TMT 레이블로 레이블을 지정합니다. 각 샘플에 어떤 TMT 라벨이 추가되는지 확인하십시오. 펩티드 다이제스트에 2 μL의 TMT 시약 및 2 μL의 ACN을 첨가하고, 부드럽게 와류하여 혼합하고, RT에서 30 s 동안 376 x g 에서 원심분리하여 샘플을 수집하고, 샘플을 라벨링하기 위해 1 h 동안 RT에서 인큐베이션한다.
3. TMT 라벨링 효율을 시험하기 위해, 9 μL의 LC-MS 등급 물과 10% 하이드록실아민(vol/vol) 1 μL가 들어있는 0.5 mL 튜브에서 각 라벨링 반응의 1 μL를 조합하여 라벨 확인 샘플을 만들어 반응을 켄칭한다. 나머지 켄칭되지 않은 표지된 샘플을 -80°C 냉동고에 넣는다. 샘플은 라벨링 효율을 평가하는 동안 며칠 동안 보관할 수 있습니다.
4. 0.1% TFA(vol/vol)의 30μL를 첨가하여 TMT 라벨 검사 샘플을 산성화시킨다. pH가 2-3 사이인지 확인하십시오. 그렇지 않은 경우이 pH가 달성 될 때까지 20 % TFA (vol / vol)를 첨가하십시오. 단계 8.1.-8.5에 설명된 대로 단계 팁핑을 통해 레이블 확인 샘플을 분리합니다.
5. 질량 분석기에서 TMT 라벨 검사 샘플을 분석하여 라벨링 효율을 평가합니다. 검색 결과를 펩티드 수준에서 1% 위발견률(FDR)로 필터링하고 라벨링 효율^21,22를 결정한다.
6. 완전히 TMT 표지된 펩티드는 N 말단 및 모든 리신에 TMT 시약을 갖는다. TMT 리포터 이온 강도를 정량화하고 모든 채널에서 총 합계를 비교합니다. 샘플은 모든 펩티드의 >95%가 표지되고 TMT 리포터 이온 합 강도가 필적할 때 충분히 표지된다.
   참고: 불완전한 라벨링 외에도, 합산된 TMT 리포터 이온 강도의 차이는 1μL 시험 샘플의 부정확한 피펫팅의 결과일 수 있습니다. 또한 진정한 생물학적 관찰을 반영 할 수 있으며,이 경우 모든 반복실험은 동일한 행동을 표시해야합니다.
7. 켄칭되지 않은 샘플을 -80°C 저장소에서 제거하고 이를 해동시킨다. 이들이 완전히 라벨링되지 않은 경우, 상기 언급된 바와 같이 샘플에 적절한 TMT 시약 1 μL를 첨가하고, 1시간 동안 인큐베이션하고, TMT 라벨 체크를 반복한다. 샘플에 완전히 레이블이 지정되어 있으면 9.8단계를 계속 진행합니다.
8. 완전히 라벨링되었을 때, 2 μL의 10% 하이드록실아민 (vol/vol)을 TMT 반응에 첨가하여 라벨링을 켄칭시킨다. 샘플을 RT에서 15분 동안 인큐베이션한다. 일단 담금질되면, 샘플은 수개월 동안 -80°C에서 저장될 수 있다.
9. 모든 담금질된 TMT 채널을 결합하고 2μL의 20% TFA(vol/vol)를 첨가하여 반응을 산성화시킨다. 결합 반응의 pH를 확인하고 pH 2-3 사이에 있는지 확인하십시오. 그렇지 않은 경우 원하는 pH에 도달 할 때까지 20 % TFA의 작은 분취량을 추가하십시오. 이것은 적절한 탈염에 중요합니다.
10. 30분 동안 진공 원심분리에 의해 ACN을 제거하고 샘플을 하기에 기재된 바와 같이 탈염시킨다.

10. TMT 표지된 결합 시료를 탈염

1. 결합된 TMT 시약을 탈염시키기 위해 적절한 단백질 용량(2mg 흡착제는 일반적으로 이 용도에 충분함)을 갖는 SPE C18 탈염 플레이트를 사용하십시오. 웰을 60% MeOH(vol/vol)의 200μL 및 200μL의 10% MeOH/0.1% TFA(vol/vol)로 평형화시킨다.
2. 단계 9.10으로부터 산성화된 TMT 표지된 펩티드를 로딩한다. 탈염 플레이트에. 샘플 웰을 200 μL의 10% MeOH/0.1% TFA (vol/vol)로 2x 세척한다.
3. 펩티드를 60% MeOH (vol/vol)의 100 μL로 희석한다. 샘플을 진공 원심분리로 건조시킨다. 건조된, TMT 표지된 샘플은 수개월 동안 -80°C에서 저장될 수 있다.
4. TMT 표지된 샘플의 질량 분광법 분석을 위해, 샘플의 절반을 주입하고 재주입이 필요한 경우 나머지 절반을 저장합니다.
   참고: 질량 분석기의 주입량은 특정 컬럼, 계측기 설정 및 샘플 유형에 따라 달라집니다.

11. 데이터 분석

참고: 데이터 필터링 및 분석 방법은 다양하며 이 프로토콜의 범위를 벗어나지만 이 프로토콜로 인해 발생하는 데이터 유형에 대한 지침을 제공하기 위해 분석에 대한 다음 참고 사항이 포함되어 있습니다.

1. 사용된 샘플 세포 또는 조직의 기원에 기초한 종별 프로테옴 데이터베이스에 대한 원시 질량 분광분석 데이터를 검색한다. 여기서, 혜성은 검색 알고리즘(²³)으로서 사용되었다.
2. 검색 알고리즘 특정 파라미터(²²)를 조정함으로써 검색 결과를 1% FDR로 필터링한다. 라벨이 없는 정량화의 경우 MS1 피크 면적 측정을 사용하여 데이터를 정량화합니다. TMT 표지된 샘플의 경우, 정량화를 위해 MSn 유래 리포터 이온 강도를 사용하십시오. 통계적 유의성을 위해, 생물학적 삼중항에서 샘플을 분석한다.
3. PPP 서브유닛 및 이들의 상호작용자를 식별하기 위해, MCLR 억제 및 DMSO 처리된 샘플의 삼중 생물학적 샘플이 비교되도록 보장한다. 상이한 조건 하에서 또는 약물 치료시 PPPome을 비교하기 위해, 각 조건 또는 약물 치료의 생물학적 삼중항이 생성되었는지 확인하십시오.
4. 세 개의 DMSO 대조군 처리된 샘플 중 적어도 두 개 중에 총 펩티드 카운트>1을 갖는 단백질만이 존재하도록 데이터를 필터링한다. MCLR 경쟁이 항상 모든 촉매 서브유닛 결합으로부터 경쟁하는 것은 아니다. 또한, 일부 PPP 촉매 서브유닛은 비특이적으로 세파로스 수지에 달라붙을 수 있다. 수지에 특이적으로 결합하는 단백질을 걸러내면서 어느 하나의 가능성을 고려하기 위해, MCLR 처리 조건에서 총 펩티드 카운트가 임의의 PPP 촉매 서브유닛에 대한 것보다 더 높은 단백질을 제거한다.
5. 케라틴, 콜라겐, 40S 및 60S 리보솜 단백질, PPP 서브유닛이 아닌 이종 핵 리보뉴클레오단백질과 같은 일반적인 오염물질을 분석¹⁴에서 제외한다.
6. 로드 섹션^24,25에서 일반 매트릭스 업로드를 클릭하여 필터링된 데이터를 페르세우스로 가져옵니다. Log_2는 기본 > 변환으로 이동하여 데이터를 선택하고 변환 함수(이 경우 log2(x))를 지정하여 데이터를 변환합니다.
7. 정규 분포에서 누락된 값 바꾸기 > 전가법으로 이동하여 데이터를 선택하고 계산을 위해 너비(기본값 0.3) 및 아래쪽 시프트(기본값 1.8)를 지정하여 정규 분포에서 누락된 값을 함축합니다. > 정규화 Quantile 정규화로 이동하여 분위수 정규화를 수행합니다.
8. 각 조건에 대한 로그₂ 비율과 스튜던트 T-검정 p-값을 계산합니다. 먼저 범주형 주석 행> 행으로 이동하여 데이터에 주석을 추가합니다. 두 표본 테스트 > 테스트로 이동하고 비교할 그룹, 수행할 테스트 및 절단에 사용되는 여러 가설 테스트 수정 방법을 선택하여 T-테스트를 수행합니다.
   참고: de novo 식별을 위해, 단백질은 MCLR 처리 대 DMSO 조건에서 그 풍부도가 통계적으로 유의한 경우, 구체적으로 결합된 것으로 알려진 PPP 서브유닛의 최소 폴드 변화보다 2배 더 큰 로그₂배 변화와 함께 PPP 상호작용 단백질로 간주된다.

결과

도 2: 특정 PIBs 결합제의 확인 . (A) PIB-MS를 통해 다양한 조직 유형 또는 세포를 분석할 수 있다. 생물학적 삼중항 내의 HeLa 세포를 DMSO 또는 PPP 억제제 MCLR로 처리하고, PIB와 함께 인큐베이션하고, LC-MS/MS. (B) DMSO 및 MCLR 처리된 HeLa 세포 용해물에서 PIB-MS 분석의 화산 플롯을 통해 분석하였으며, 특정 PIB 결합제는 적색으로 표시되었다. PPP 촉매 서브유닛은 표지되고 파란색으로 표시된다. 새로운 후보 PPP 서브유닛 또는 상호작용 단백질은 검정으로 표시된...

토론

PIB-MS는 단일 분석에서 다양한 샘플 소스로부터 PPPome을 정량적으로 프로파일링하는 데 사용되는 화학적 프로테오믹스 접근법입니다. 키나제 억제제 비드를 사용하여 키노메를 연구하고 암 및 기타 질병 상태^10,11,12,13에서 어떻게 변화하는지 연구하기 위해 많은 연구가 수행되었습니다. 그러나 PPPome에 대한 연구는 뒤쳐져 있습니다. 우리는이 접근법이이 격차를 메우고 세포 탈인산화의 조절에 빛을 비출 수있을 것으로 기대합니다. 여기서 우리는 PIB를 사용하여 PP1, PP2A, PP4, PP5 및 PP6의 촉매 및 비촉매 성분을 풍부하게 할 수 있음을 보여줍니다. 우리는 또한 다양한 세포주, 조직 유형 및 유기체에서 새로운 후보 PPP 인터랙터를 확인할 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
아세토니트릴(ACN)	Honeywell	AH015-4	주의: ACN은 가연성이며 독성이 있습니다. 장갑을 착용하고 화학 흄 후드에서 작업하십시오.
무수 아세토니트릴	시그마-알드리치	271004-100ML	주의: ACN은 가연성이며 독성이 있습니다. 장갑을 착용하고 화학 연기 후드에서 작업하십시오.
실험대용 원심분리기	Eppendorf	모델 번호 5424
베타-글리세로인산, 다이소듐 염, 5수화물	Acros Organics	410991000
Centrifuge	, Eppendorf	모델 번호 5810 R, 15 amp version
증류수
DMSO	Fisher Scientific	BP231-100
Dounce tissue 그라인더	Fisherbrand Pellet Pestles	12-141-363
Empore 고체상 추출 디스크, C18	CDS Analytical	76333-132
Eppendorf tubes, 1.5 mL	Eppendorf	22363204	CRITICAL: 다른 tube는 폴리머를 시료로 침출시켜 분석을 오염시킬 수 있습니다.
Eppendorf tubes, 2 mL	Eppendorf	22363352	CRITICAL: 다른 튜브가 폴리머를 시료에 침출시켜 분석을 오염시킬 수 있습니다.
추출 플레이트 매니폴드	Waters	WAT097944
Falcon 튜브, 50 mL	VWR	21008
일반 무딘 끝 바늘 및 플런저
일반 자기 분리 랙
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
염화수소(HCl)	VWR 화학 물질 BDH	BDH3028	주의 : HCl은 부식성입니다. 장갑을 착용하고 화학 연기 후드에서 작업하십시오.
하이드록실아민 용액 50% (wt/vol)	Sigma-Aldrich	467804
인큐베이터, 65 ° C	VWR	모델 번호 1380FM
Koptec 순수 에탄올, 200 Proof	Decon Labs	V1001
HPLC (MeOH) 용 메탄올	Sigma-Aldrich	34860-4L-R	주의: MeOH는 가연성 및 독성이 있습니다. 장갑을 착용하고 화학 연기 후드에서 작업하십시오.
Microcystin LR (MCLR)	Cayman Chemical	10007188	주의: MCLR은 독성이 있습니다. 취급 시 장갑을 착용하고 피부 접촉을 피하십시오.
PBS, 1× 칼슘과 마그네슘 없음, pH 7.4 > 0.1	코닝	21-040-CV
pH 테스트 스트립(예: MilliporeSigma MColorpHast pH 테스트 스트립 및 지표 종이	Fisher Scientific	M1095310001
PIB PIB			생성을 위한 프로토콜은 Moorhead et al., 2007을 참조하십시오.
Pierce BCA 단백질 분석 키트	Thermo Scientific	23225
피펫 팁, 10 μ L	Eppendorf	22491504	CRITICAL: 다른 팁으로 인해 폴리머가 샘플에 침출되어 분석이 오염될 수 있습니다.
피펫 팁, 1000 μ L	Eppendorf	22491555	위험: 다른 팁으로 인해 폴리머가 샘플에 침출되어 분석이 오염될 수 있습니다.
피펫 팁, 200 μ L	Eppendorf	22491539	위험: 다른 팁으로 인해 폴리머가 샘플에 침출되어 분석이 오염될 수 있습니다.
플라스틱 주사기, 10 mL	BD	309604
프로테아제 억제제 칵테일 III	Research Products International	P50700-1
Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap 질량분석기, Oribtrap Fusion, Orbitrap Fusion Lumos, 또는 Orbitrap Eclipse Tribrid 질량분석기	Thermo Scientific
냉장 벤치탑 원심분리기	Eppendorf	모델 번호 5424 R
Rotator (Labquake Shaker Rotisserie)	Thermo Scientific	13-687-12Q	8 rpm 회전
시료 채취 플레이트, 96- 웰, 1 mL	Waters	WAT058957
SDS	Fisher Scientific	BP1311-1
염기서열분석 등급 수정된 트립신	Promega	V511C
아지드화나트륨	EMD 화학물질	SX0299-1	주의: 아지드화나트륨은 폭발성과 독성이 있습니다. 장갑을 착용하고, 화학 흄 후드에서 작업하며, 금속과의 접촉을 피하십시오.
염화나트륨 (NaCl)	Fisher Chemical	S27110
Sonicator (Branson digital sonifier)		모델 번호. SFX 250
SPE C18 탈염 플레이트	Waters	186001828BA
SpeedBeads 자기 카르복실레이트 수정 입자 (SP3 비드)	Cytiva	6.51521E+13
Thermomixer	Eppendorf	모델 번호. 5350
TMT10plex Isobaric Label Reagent Set plus TMT11-131C Label Reagent, 3 × 0.8 mg per tag	ThermoFisher	A37725
트리플루오로아세트산(TFA)	Honeywell	T6508-25ML	주의: TFA는 부식성이 있으며 접촉 시 피부를 자극합니다. 장갑과 보안경을 착용하고 화학 연기 후드에서 작업하십시오.
Tris Base	Research Products International	T60040
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
진공 원심 분리기 및 증기 트랩	Thermo Scientific	모델 번호 SpeedVac SPD120 및 RVT5105
Vortexer(Vortex-Genie 2)	과학 산업
물 LC-MS	Honeywell	LC365-4