여러 형광 염색 및 조직 제거 접근법을 사용하여 3D 패턴으로 털이 많고 글래브러스 한 피부 신경을 보여줍니다.

요약

조직 절편의 두께는 피부 신경과민의 형태학적 연구를 제한하였다. 본 프로토콜은 공초점 현미경 검사 하에서 두꺼운 300 μm 조직 절편에서 피부 신경 섬유를 시각화하는 독특한 조직 제거 기술을 기술한다.

초록

피부 신경은 말초 신경계의 중요한 부분입니다. 피부 신경 섬유에 대한 연구가 빠르게 진행되었지만, 분포 및 화학적 특성에 대한 대부분의 이해는 얇은 조직 절편에 대한 기존의 조직 화학 및 면역 조직 화학 염색에서 비롯됩니다. 조직 제거 기술의 발달로, 더 두꺼운 조직 절편에서 피부 신경 섬유를 볼 수있게되었습니다. 본 프로토콜은 쥐 뒷발의 발바닥 및 등쪽 피부로부터 300 μm의 두께로 조직 절편에 대한 다중 형광 염색을 기술하며, 두 개의 전형적인 털이 많고 윤곽이 있는 피부 부위이다. 여기서, 칼시토닌 유전자 관련 펩타이드는 감각신경섬유를 표지하는 반면, 팔로이드인과 림프관내피히알루로난 수용체 1은 혈액과 림프관을 각각 표지한다. 공초점 현미경 하에서, 라벨이 붙은 감각 신경 섬유는 더 먼 거리에서 완전히 추적되었고, 깊은 피부 층의 번들과 피상층의 자유형으로 달렸다. 이 신경 섬유는 혈관과 평행하거나 혈관을 둘러싸고 있었고, 림프관은 털이 많고 윤기가 나는 피부에 3차원(3D) 네트워크를 형성했다. 현재의 프로토콜은 방법론 관점에서 기존의 기존의 방법보다 피부 신경을 연구하는 데보다 효과적인 접근법을 제공합니다.

서론

신체에서 가장 큰 기관인 피부는 환경에 대한 핵심 인터페이스 역할을하며 많은 신경 섬유 ^1,2,3에 의해 조밀하게 신경을 씁니다. 피부 신경과민은 이전에 전체 탑재 피부 및 조직 절편 4,5,6에 대한 염색과 같은 다양한 조직학적 방법으로 널리 연구되었지만, 피부 신경 섬유의 상세한 효과적인 입증은 여전히 과제입니다 ^7,8. 이를 감안할 때, 본 프로토콜은 두꺼운 조직 절편에서 피부 신경 섬유를 보다 명확하게 나타낼 수 있는 독특한 기술을 개발하였다.

절편의 두께에 의한 한계 때문에, 신경과민된 피부 신경 섬유의 관찰은 획득된 이미지 정보로부터 칼시토닌 유전자 관련 펩티드(CGRP) 신경 섬유와 국소 조직 및 기관 사이의 관계를 정확하게 묘사하기에 충분히 정확하지 않다. 3D 조직 제거 기술의 출현은 이러한 문제(^9,10)를 해결할 수 있는 실현 가능한 방법을 제공한다. 조직 제거 접근법의 빠른 개발은 최근¹¹ 시간 동안 조직 구조, 전체 장기, 신경 세포 돌기 및 전체 동물을 연구하기위한 많은 도구를 제공했습니다. 투명한 피부 조직은 공초점 현미경으로 훨씬 더 두꺼운 단면에서 이미징되어 피부 신경 섬유를 시각화하는 데이터를 얻을 수 있습니다.

본 연구에서, 쥐 뒷발의 발바닥 및 등쪽 피부는 털이 많고 윤곽이 있는 피부 3,4,7의 두 가지 표적 부위로서 선택되었다. 피부 신경 섬유를 더 먼 거리에서 추적하기 위해, 피부 조직을 면역조직화학 및 조직화학적 염색을 위해 300 μm의 두께로 슬라이스하고, 이어서 조직 소거 처리를 하였다. CGRP는 감각 신경 섬유^12,13을 라벨링하는데 사용되었다. 또한, 조직 배경에 피부 신경 섬유를 강조하기 위해, 팔로이드인 및 림프관 내피 히알루로난 수용체 1(LYVE1)을 혈관과 림프관을 각각^14,15로 표지하기 위해 추가로 사용하였다.

이러한 접근법은 피부 신경 섬유의 고해상도 뷰를 입증하고 또한 피부의 신경 섬유, 혈관 및 림프관 간의 공간적 상관 관계를 시각화하기 위해 적용 할 수있는 간단한 방법을 제공했으며, 이는 병리학 적 조건 하에서 정상 피부의 항상성 및 피부 변화를 이해하는 데 훨씬 더 많은 정보를 제공 할 수 있습니다.

프로토콜

본 연구는 중국 의학 아카데미 침술 및 Moxibustion 연구소의 윤리위원회에 의해 승인되었습니다 (참조 번호 D2018-04-13-1). 모든 절차는 실험실 동물의 관리 및 사용을위한 국립 보건원 가이드 (National Academy Press, Washington, D.C., 1996)에 따라 수행되었습니다. 세 마리의 성인 수컷 래트 (Sprague-Dawley, 체중 230 ± 15 g)를 본 연구에 사용하였다. 모든 동물은 온도와 습도가 조절 된 12 시간의 빛 / 어둠주기에 수용되었으며 음식과 물에 자유롭게 접근 할 수있었습니다.

1. 관류 및 샘플 준비

1. 안락사를 유도하기 위해 250 mg / kg의 트리브로모 에탄올 용액 ( 물질 표 참조)을 쥐에 복강내 주사하십시오.
2. 호흡이 멈추면 스테인레스 스틸 외과 용 가위를 사용하여 쥐의 흉강을 엽니 다. 20G 바늘을 사용하여 좌심실¹³을 0.9% 정상 식염수 100mL와 함께 3mL/min의 속도로 관류시킨 다음 0.1M 인산염 완충액(PB, pH 7.4)에서 4% 파라포름알데히드 250-300mL를 사용합니다(그림 1A, B).
3. 관류 후, 메스를 사용하여 뒷발에서 등받이와 발바닥의 피부를 제거하십시오.
   1. 냉동 절편을 필요로 하는 샘플의 경우, 조직을 2시간 동안 0.1 M PB 중의 4% 파라포름알데히드에 고정시킨 후; 이어서 조직을 4°C에서 24시간 이상 동안 0.1 M PB 중의 25% 수크로오스로 보호한다.
   2. 조직 제거를 필요로 하는 두꺼운 절편을 갖는 샘플의 경우, 조직을 1x 포스페이트 완충 식염수(1x PBS) 중의 4% 파라포름알데히드에 2시간 동안 고정시킨 후; 그런 다음 조직을 4°C에서 1x PBS로 동결 보호한다(그림 1C–E).

2. CGRP, phalloidin 및 LYVE1로 삼중 형광 염색을 한 후 조직 제거 처리

참고: CGRP, phalloidin 및 LYVE1을 사용한 삼중 형광 염색을 적용하여 조직 제거 처리 후 두께가 300 μm인 조직 절편에 털이 많고 글래브러스 피부의 신경 섬유, 혈관 및 림프관을 밝혔습니다.

1. 2% 아가로오스를 1x PBS에서 2분 동안 마이크로오븐에서 가열하여 아가로오스가 용해될 때까지 제조하였다(표 참조).
2. 세척 후, 피부 조직을 37°C에서 2% 아가로오스에 집어넣고, 이를 아이스박스 내부에 넣어 냉각시킨다(그림 1F,G).
3. 장착된 조직을 빙수로 진동 마이크로톰에 고정시키고 횡단 방향으로 500 μm의 두께로 슬라이스한다. 진동 슬라이서 및 마무리 슬라이싱을 설정하려면 속도, 0.50mm/s, 진폭 1.5mm(그림 1H-K)를 설정합니다.
4. 슬라이스 후, 절편으로부터 아가로스를 제거하고, 이를 1x PBS(pH 7.4)로 6웰 플레이트에 저장한다(도 1L).
5. 조직 절편을 4°C에서 하룻밤 동안 1x PBS(TriX-PB) 중의 2% 트리톤 X-100의 용액으로 인큐베이션한다. 다음 절차는 그림 2 를 참조하십시오.
6. 조직 절편을 블로킹 완충액에 넣고 4°C에서 하룻밤 동안 진탕기 상에서 72 rpm으로 회전시킨다.
   참고: 블로킹 완충액 조성물은 1x PBS 중 10% 정상 당나귀 혈청, 1% 트리톤-X 100, 및 0.2% 아지드 나트륨이다( 표 참조).
7. 조직 절편을 마이크로원심분리 튜브 내의 희석 완충액에 마우스 모노클로날 항-CGRP (1:500) 및 양 폴리클로날 항-LYVE1 항체 (1:500)의 1차 항체를 함유하는 용액 ( 표 문헌 참조)에 넣고, 4°C에서 2일 동안 진탕기 상에서 회전시킨다.
   참고: 희석 완충액 조성물은 1x PBS 중의 1% 정상 당나귀 혈청, 0.2% 트리톤-X 100, 및 0.2% 아지드 나트륨이다.
8. 조직 절편을 실온에서 세척 완충액으로 두 번 세척한 다음, 세척 완충액 중에서 4°C에서 밤새 진탕기 상에 보관한다.
   주: 세척 완충액 조성물은 0.1 M PB (pH 7.4) 중 0.2% 트리톤-X 100이다.
9. 다음날, 조직 절편을 당나귀 항-마우스 IgG H&L Alexa-Flour488 (1:500) 및 당나귀 항-양 IgG H&L Alexa-Flour405 (1:500) 및 Alexa-Flour594 phalloidin (1:1000) ( 물질표 참조)의 2차 항체를 포함하는 혼합 용액으로 옮기고 마이크로원심분리 튜브에서 72 rpm으로 회전시키고 4°C에서 5시간 동안 진탕기에서 회전시킨다.
10. 여섯 웰 플레이트에서 조직 절편을 실온에서 1 시간, 두 번 세척 완충액으로 세척하십시오. 조직 절편을 4°C에서 하룻밤 동안 진탕기 상의 세척 완충액에 보관한다.
11. 조직 절편을 조직 클리어링 시약 내로 옮기고( 표 참조, 그의 부피는 샘플 부피보다 다섯 배 더 컸다) 진탕기 상에서 60 rpm으로 실온에서 1 h 동안 부드럽게 회전시킨다.
    참고: 이 치료 후 조직 절편이 명확해집니다(그림 2B).
12. 클리어 티슈를 슬라이드에 장착하고, 스페이서로 조직을 동그라미로 돌린 다음, 신선한 조직 제거 시약과 커버슬립으로 틈새를 붙입니다.

3. 통상적인 접근법에 따른 CGRP, 팔로이딘 및 LYVE1을 이용한 삼중 형광 염색

참고: 비교로서, 통상적인 기술에 따라 30 μm의 두께로 조직 절편에 대해 동일한 염색을 수행하였다.

1. 조직 절편을 횡단 방향으로 마이크로톰에서 30μm로 슬라이스하여 슬라이드에 장착합니다.
2. 0.1 M PB 중 3% 정상 당나귀 혈청 및 0.3% 트리톤 X-100으로 블로킹 용액을 첨가하고, 절편을 실온에서 30분 동안 인큐베이션한다.
3. 블로킹 용액을 제거하고, 절편을 마우스 모노클로날 항-CGRP (1:500) 및 양 폴리클로날 항-LYVE1 항체 (1:500)의 1차 항체를 함유하는 용액과 함께 4°C에서 하룻밤 동안 희석 완충액에서 인큐베이션한다.
4. 다음날, 조직 절편을 0.1 M PB (pH 7.4)로 세 번 세척하고, 당나귀 항-마우스 IgG H&L Alexa-Flour488 (1:500) 및 당나귀 항양 IgG H&L Alexa-Flour405 (1:500) 및 Alexa-Flour594 phalloidin (1:1000)의 2차 항체를 포함하는 혼합 용액을 절편에 첨가하고, 실온에서 1 h 동안 인큐베이션한다.
5. 현미경 관찰 전에, 절편을 0.1 M PB (pH 7.4)로 세 번 세척한 다음, 50% 글리세린의 커버슬립으로 덮는다.

4. 이미징 및 분석

1. 염색된 시료를 형광현미경으로 관찰한 다음, 공초점 현미경을 이용하여 영상을 촬영하였다.
2. 각 300 μm 두께의 섹션으로부터 각각 10 μm 프레임에서 30개의 이미지(Z-스택)를 캡처하고 공초점 현미경 시스템의 이미지 프로세서를 사용하여 단일 인-포커스 이미지를 통합합니다( 자료 표 참조).
   1. 3차원(3D) 분석을 위한 공초점 설정의 이미지 처리 소프트웨어에서 다음 단계를 수행합니다: 초점면 시작 | 설정 초점 평면 끝 | 설정 단계 크기를 |으로 설정 깊이 패턴 | 선택 이미지 캡처 | Z 시리즈.
      참고: 청색 형광 신호의 여기 및 방출 파장은 각각 401nm 및 421nm였다. 녹색 형광 신호의 여기 및 방출 파장은 각각 499 nm 및 519 nm였다. 적색 형광 신호의 여기 및 방출 파장은 각각 591 nm 및 618 nm였다. 152 μm는 공초점 핀홀의 직경이다(10x 대물렌즈, NA: 0.4). 이미지 캡처 해상도는 1024 × 1024 픽셀이었습니다.
3. 종래의 샘플의 경우(단계 3), 각 30 μm 두께의 섹션으로부터 1 μm 프레임에서 30개의 이미지(Z-스택)를 캡처하고, 이들 이미지를 상기 언급된 바와 같이 추가로 처리한다(단계 4.1-4.2).
4. 이미지 처리 시스템을 사용하여 3D 재구성 패턴의 이미지를 시연합니다.
5. Z-스택 공초점 이미지를 Imaris 9.0(셀 이미징 소프트웨어, 재질 표 참조)으로 가져와 3D 재구성을 수행하고 얼룩 강도를 기반으로 표면 렌더링을 생성: 새 서피스 추가 | 소스 채널 | 선택 서피스 세부 정보 |의 부드러운 옵션에서 매개변수 결정 절대 강도 |의 임계값 옵션에서 매개변수 결정 서피스 | 분류 마침.
6. 세포 이미징 소프트웨어를 사용하여 양성 신경 섬유의 표면적에 대한 데이터를 수집합니다. 렌더링된 이미지 |을 선택합니다. 통계 | 자세한 | 특정 값 | 볼륨.

결과

삼중 형광 염색 후, 신경 섬유, 혈관 및 림프관을 털이 많은 피부와 글래브러스 피부에서 각각 CGRP, phalloidin 및 LYVE1로 명확하게 표지하였다(도 3,4). 클리어링 처리를 통해 CGRP 양성 신경 섬유, 팔로이드 양성 혈관 및 LYVE1 양성 림프관을 더 깊이 이미지화하여 피부의 완전한 구조 정보를 얻을 수 있습니다 (그림 3). 이러한 조직 구조가 3D 패턴으로 더 재구성되었을 때, 그 분포는 추적하기가 더 쉬워졌습니다. CGRP 양성 신경섬유가 피하조직과 진피를 통과하여 표피까지 통과한 것으로 나타났다. 이러한 신경 섬유는 피하 조직에서 다발로 실행되고, 진피 내에서 분지되고, 표피에서 종결되었다(그림 3). 대조적으로, 팔로이드 양성 혈관 및 LYVE1 양성 림프관은 피하 조직 및 진피에 분포한다(

토론

본 연구는 클리어링 처리와 함께 두꺼운 조직 절편에 대한 면역 형광을 사용하여 털이 많고 글래브러스 피부에서 피부 신경 섬유의 상세한 시연을 제공하고 피부 신경을 더 잘 이해하기 위한 3D 뷰를 제공합니다. 최대 1-2일의 항체 인큐베이션 시간 및 하룻밤 세척 과정이 중요하다. 이 두 가지 주요 단계는 두꺼운 절편의 면역 형광 염색 효과에 직접적인 영향을 미칩니다. 항체의 선택으로부터 또 다른 문제가 제기되었는데, 이들 모두가 두꺼운 부분에 적합한 것은 아니다. 우리는 더 작은 분자량을 가진 항체가 두꺼운 절편의 면역 형광 염색에 이상적 일 수 있다고 추측합니다. 따라서, 항체 선택의 어려움은 이러한 접근법의 주요 한계이다. 본 연구는 쥐의 털이 많고 털이없는 피부에서 혈관, 림프관 및 신경의 분포의 차이를 관찰했다. 인간의 경우 피부 구조는 설치류의 피부 구조와 매우 다릅니다. 우리는 조직 제거 기술을 사용하여 다음 단계에서 인간의 피부를 관찰하고 연구하기를 기대합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1x 인산염 완충 식염수	Solarbio Life Sciences	P1020	pH 7.2-7.4, 0.01 Mol
2,2,2-Tribromoethanol	Sigma Life Science	T48402-5G
컨포칼 형광 현미경 Olympus	Corporation	Fluoview FV1200
당나귀 안티 마우스 IgG H& L 알렉사 - 밀가루 488	Abcam plc.	ab150105
당나귀 안티 양 IgG H& L 알렉사 - 밀가루 405	Abcam plc.	ab175676
EP 튜브	무석 NEST 생명 공학 Co.	615001	1.5 mL
동결 단계 슬라이딩 마이크로톰 시스템	Leica Biosystems	CM1860
Imaris 소프트웨어	Oxford Instruments	v.9.0.1
IRIS 표준 가위	WPI (World Precision Instruments Inc.)
iSpacer	선진연구소	IS005
마이크로 집게 -Str	RWD	F11020-11
마우스 단클론 항 CGRP 항체	Santa cruz biotechnology, Inc.	sc-57053
중성 완충 포르말린	Solarbio Life Sciences	G2161	10%
일반 당나귀 혈청	Jackson ImmunoResearch Laboratories	017-000-12	10 mL
연동 펌프	Longer Precision Pump Co., Ltd	BT300-2J
Phalloidin Alexa-Fluor 594	Thermo Fisher Scientific	A12381
RapiClear 1.52 솔루션	SunJin Lab co.	RC152001	10 mL
일반 아가로스	Gene Company Limited	G-10
SEMKEN 1 x 2 치아 조직 집게-Str	RWD	F13038-12
양 다클론 항 LYVE1 항체	R& 주식회사 디 시스템즈	AF7939
6웰 플레이트	Corning Incorporated	3335
아지드화나트륨	시그마 생명과학	S2002	25g
자당	시그마 생명과학	V900116	500g
Super Glue	Henkel AG & Co.	Pattex 502
수술용 핸들	RWD	S32003-12
Triton X-100	Solarbio Life Sciences	9002-93-1	100mL
우레탄	시그마 생명 과학	U2500	500g
VANNAS 스프링 가위	RWD	S1014-12
진동 마이크로톰	Leica Biosystems	VT1200S