방법 논문

SCAD 분석을 사용한 흉터 발달 시각화 - 전 계내 피부 흉터 분석

DOI:

10.3791/63808

⸱

2022년 4월 28일

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1Institute of Regenerative Biology and Medicine, Helmholtz Zentrum München, 2School of Medicine, Klinikum Rechts der Isar, Department of Plastic and Hand Surgery, Technical University of Munich

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 "A Dish의 조직과 같은 SCar"또는 SCAD라고 불리는 피부 근막 외래 식물의 생성을 설명합니다. 이 모델은 흉터 형성 동안 단일 섬유 아세포의 전례없는 시각화를 허용합니다.

초록

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깊은 조직 상처 밀봉에 대한 포유류의 세계적인 반응은 흉터 형성 및 조직 수축을 통해 이루어지며, 이는 전문화된 근막 섬유아세포에 의해 매개된다. 흉터 형성 및 손상된 상처 치유의 임상 적 중요성에도 불구하고, 상처 치유에서 근막 섬유 아세포 역학에 대한 우리의 이해는 피부 상처와 같은 복잡한 환경에서 섬유 아세포 안무 및 역학의 직접적인 시각화를 가능하게하는 관련 분석이 부족하기 때문에 까다 롭습니다. 이 논문은 피부 상처의 복잡한 환경을 모방하는 SCAD 또는 "접시의 SCar-유사 조직"을 사용하여 ex-situ 피부 흉터를 생성하는 프로토콜을 제시합니다. 이 분석에서, 2mm 전체 두께의 피부를 적출하고 5 일 동안 배지에서 거꾸로 배양하여 흉터와 피부 수축이 균일하게 발생합니다. 섬유아세포-계보 특이적 트랜스제닉 마우스 모델과 결합된 이 방법론은 전체 상처 복구 과정에 걸쳐 개별 섬유아세포 혈통을 시각화할 수 있게 한다. 전반적으로,이 프로토콜은 연구자가 상처 복구의 기본 과정과 메커니즘을 이해하고 상처 치유 결과에 대한 조절제의 효과를 직접 탐구하는 데 도움을줍니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

상처 치유는 침해 된 상처의 회복 과정입니다. 무척추 동물의 조직 손상은 부분적 또는 완전한 재생을 초래합니다. 대조적으로, 포유류는 흉터에 의한 깊은 부상에 반응하는데, 이는 침범 부위를 최소화 하고 동시에 부상당한 부위 1,2,3을 영구적으로 변형시키는 매트릭스 섬유의 조밀 한 플러그로 상처를 신속하게 봉인하도록 맞춤화 된 과정입니다. 포유류의 큰 피부 화상이나 깊은 열린 상처는 비후성 또는 켈로이드 흉터 4,5와 같은 병리학 적 표현형을 초래합니다. 이러한 풍부한 흉터는 임상 및 글로벌 의료 시스템에 엄청난 부담을 안겨줍니다. 미국에서만 흉터 관리 비용은 연간 약 100 억 달러 6,7입니다. 따라서 흉터 형성과 관련된 기금 과정과 메커니즘을 더 잘 이해하기 위해서는 관련 방법론의 개발이 필요합니다.

최근 몇 년 동안, 마우스에 대한 광범위한 연구는 특정 피부 위치 8,9,10에서 기원에 따라 뚜렷한 기능적 효능을 가진 이질적인 섬유 아세포 집단을 밝혀 냈습니다. 허리 피부에서, Rinkevich et al., 2015는 EPF (Engrailed positive fibroblast)라고 불리는 Engrailed-1 (En1)의 초기 배아 발현을 가진 특정 섬유 아세포 집단이 상처시 피부 흉터에 기여한다는 것을 확인했습니다. 반대로, 엥레일 발현의 이력이 없는 또 다른 섬유아세포 계통인 Engrailed negative fibroblast (ENF)는 흉터 형성에 기여하지 않는다8. R26 mTmG (En1Cre x R26mTmG)와 같은 형광 리포터 마우스 라인으로 교차된 Cre 구동 트랜스제닉 마우스 라인을 사용하여 이들 En1 계통의 운명 매핑은 EPF 및 ENF 집단의 시각화를 가능하게 한다.

수일에 걸쳐 생체 내에서 섬유아세포 이동을 연구하는 것은 윤리적 및 기술적 제약에 의해 제한된다. 더욱이, 화합물, 바이러스 및 중화 항체 라이브러리 스크린은 흉터에 관여하는 경로를 조절하기 위해 기술적으로 도전적이다. 이전에 사용된 시험관내 또는 생체외 모델은 진정한 피부 미세환경에서의 섬유아세포 이동 및 흉터 형성, 흉터 발달에서의 균일성, 생체내 피부 환경을 에뮬레이트하는 조직 복잡성을 시각화하는 능력이 부족하다(11,12). 상기 한계를 극복하기 위해, 우리는 SCAD (A Dish의 SCar 유사 조직)13,14로 불리는 생체외 흉터 분석 방법을 개발하였다. 이 간단한 분석은 표피, 진피 및 피하 근막 영역을 함유하는 2mm 전두께의 피부를 절제하고 이를 혈청이 보충된 DMSO 배지에서 최대 5일 동안 배양함으로써 수행될 수 있다. SCAD로부터 생성된 흉터는 생체내 흉터의 전사체 및 프로테오믹 특징을 신뢰성 있게 복제한다. 또한, 형광 리포터 마우스 라인과 교차된 관련 트랜스제닉 마우스 라인(예를 들어, En1 마우스)으로부터 생성된 SCADs는 전례 없는 해상도에서 섬유아세포 이동 역학 및 흉터 발달의 시각화를 허용한다. 또한, 이 모델은 임의의 높은 처리량 응용(예를 들어, 화합물 라이브러리, 항체 라이브러리, 또는 바이러스 스크리닝)13,14)에 용이하게 적응될 수 있다. 이 기사에서는 SCAD를 생성하는 최적화된 프로토콜 및 흉터 개발에서 세포 및 매트릭스 역학을 연구하기 위한 후속 다운스트림 처리 응용 프로그램에 대해 설명합니다.

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프로토콜

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아래에 제시된 모델은 Jiang et al., 202013에 간략하게 기재된 바와 같이 SCAD 분석의 생성에 대한 상세한 단계별 설명을 제공한다. SCAD 샘플 준비는 국제 및 어퍼 바이에른 정부 지침에 따라 동물을 희생시킨 후에 수행되었다. 동물들은 헬름홀츠 센터 뮌헨의 동물 시설에 수용되었다. 객실은 최적의 습도와 일정한 온도로 12 시간 빛주기로 유지되었습니다. 동물에게 음식 및 광고 리비툼 물을 공급하였다.

1. SCAD 조직 준비

  1. 신생아 새끼를 출생 후 0 일 또는 1 일째 (P0 또는 P1)에 희생하십시오.
  2. 멸균 수술용 메스를 이용하여 골격근층이 될 때까지 적어도 1.5 cm x 1.5 cm 전체 두께의 등쪽 등 피부를 조심스럽게 절제한다.
  3. 멸균 곡선 포셉을 사용하여 피부를 벗겨 내고 표면 근막이 기본 panniculus carnosus 근육과 손상되지 않도록하십시오.
  4. 적출된 조직을 50-100 mL의 차가운 DMEM/F-12 배지로 세척하여 오염된 혈액을 제거하십시오.
  5. 행크스의 균형 잡힌 소금 용액 (HBSS)으로 한 번 씻어 조직과 세포 생존력을 유지하십시오.
  6. DMEM / F12 배지가 들어있는 10cm 페트리 접시에 피부를 거꾸로 뒤집어 놓습니다 (상단의 표면 근막).
  7. 일회용 2mm 생검 펀치를 사용하여 전체 두께의 둥근 피부 조각을 절제하여 표피가 SCAD 조직을 생성 할 때까지 표면 근막이 기본 panniculus carnosus 근육과 손상되지 않도록하십시오.
  8. 10% FBS, 1x GlutaMAX, 1x MEM 비필수 아미노산 및 1x 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 DMEM/F12 배지 200μL(페놀 레드 제외) 완전 배지 200μL를 준비하여 96웰 플레이트의 개별 웰에 채웁니다.
  9. 멸균 포셉을 사용하여 개별 SCAD 조직을 거꾸로 (위쪽을 향한 근막) 조심스럽게 옮기고 완전히 가라 앉히고 96 웰 플레이트의 웰로 옮깁니다.
  10. 플레이트를 표준 조건(37°C, 21%(v/v) 산소, 5%(v/v)C02 및 95% 습도) 하에 유지된 세포 배양 배양기로 옮긴다.

2. SCAD - 조직 배양

  1. SCAD를 인큐베이터에서 최대 5일 동안 배양합니다.
  2. 배양 2일째와 4일째에 배지를 200μl의 신선한 사전 가온된 DMEM/F12 완전 배지로 교체하여 지속적인 세포 및 조직 생존 조건을 보장합니다. 각 배지 변경 중에 처리 화합물을 교체하십시오.
    참고: 조직이 웰에 달라붙지 않도록 웰에 10μL의 배지를 남겨 두십시오.
  3. 라이브 이미징 (섹션 3) 및 조직 수확 및 2D / 3D 면역 형광 염색 (섹션 4)과 같은 실험을 위해 SCAD를 준비하십시오.

3. SCAD의 라이브 이미징

  1. PBS의 최소 30 mL의 2%-3%(w/v) 저융점 아가로스 용액을 유리 병에 넣고 끓을 때까지 마이크로파로 가열하여 준비한다.
  2. 즉시 병을 옮기고 액체 아가로스 용액을 40°C 수조에서 냉각시킨다.
  3. 근막/흉터가 위쪽을 향하도록 SCAD 조직을 35mm 접시의 중앙으로 옮깁니다.
  4. 파스퇴르 피펫을 이용하여 40°C 액체 아가로스를 35 mm 디쉬 상에 천천히 이송하여 실온(RT)에서 SCAD를 임베드한다. 아가로스는 2분 이내에 중합한다.
  5. 미리 예열된 DMEM/F12 완전 배지 2mL를 추가합니다(페놀 빨간색 표시기 제외).
  6. 37°C, 21%(v/v) 산소, 5%(v/v) C02 및 95% 습도로 설정된 적합한 인큐베이션 시스템이 장착된 공초점 또는 다중 광자 현미경을 사용하여 0일차 SCAD의 타임랩스 이미지를 최대 48시간까지 획득할 수 있습니다.

4. 조직 채취 및 2D/3D 면역형광염색

  1. 배지를 멸균 PBS로 대체하여 관련 시점에서 조직을 세척한다.
  2. 멸균 포셉을 사용하여 개별 SCAD를 2% 파라포름알데히드 500μL를 함유하는 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브로 조심스럽게 옮겨 4°C에서 하룻밤 사이에 조직을 고정시켰다.
  3. PBS로 조직을 3회 세척하고 2D/3D 면역형광염색을 진행한다.
  4. 3D 면역형광염색
    1. 0.2% 젤라틴, 0.5% 트리톤-X100, 및 0.01% 티메로살(PBSGT)이 보충된 PBS 500 μL를 함유하는 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브에서 24시간 동안 RT에서 인큐베이션함으로써 조직을 투과화시킨다.
    2. 제조자의 지시에 따라 적절한 양의 일차 항체를 준비하고 SCAD 조직을 RT에서 24시간 동안 PBSGT 용액 150μL에 인큐베이션한다.
      참고: 면역 형광에 대한 최적의 항체 농도가 제조업체에 의해 보고되지 않은 경우, 다양한 농도(예: 1:50, 1:200, 1:500, 1:1000)를 사용하는 대조군 조직에서 사전 항체 적정을 수행해야 합니다.
    3. SCADs를 PBS로 세 번 부드럽게 세척하여 결합되지 않은 일차 항체를 제거하였다.
    4. RT에서 하룻밤 동안 PBS 중의 1:1000 관련 Alexa Fluor 이차 항체로 조직을 인큐베이션한다.
    5. PBS로 30분 동안 조직을 3회 부드럽게 세척하여 과량의 결합되지 않은 이차 항체를 제거하였다.
    6. 공초점 또는 다중 광자 이미징을 위해 조직을 35mm 유리 바닥 접시에 옮깁니다.
      참고: 수침 목표를 사용할 때는 SCAD를 2% 낮은 융점 아가로스에 내장하여 이미지를 획득하는 동안 표류하는 것을 방지하기 위해 조직을 고정시킵니다.
  5. 2D 면역형광염색
    1. 조직을 냉동 금형으로 옮기고 최적의 절단 온도 (OCT) 화합물로 부드럽게 채워 조직을 완전히 침지시킵니다.
    2. 조직의 방향을 부드럽게 조정하여 단면 또는 수직 단면을 얻기 위해 기포가 없는지 확인하십시오.
    3. 주형을 드라이아이스 상에 20-30분 동안 놓고 밤새 -80°C에서 블록을 인큐베이션한다.
    4. 블레이드 온도를 -25°C로 설정하고 시편 블록 온도를 -17°C로 설정합니다. 냉동 스탯을 사용하여 6 μm 냉동 섹션을 제조하고, 절편을 접착 슬라이드 상으로 옮기고, 슬라이드를 -20°C 냉동고에 보관한다.
    5. 슬라이드를 PBS로 세 번 헹구고, 슬라이드를 PBST(0.05% 트윈으로 보충된 PBS) 중 5% 소 혈청 알부민(BSA) w/v에서 1시간 동안 인큐베이션한다.
    6. 적절한 양의 일차 항체 150μl를 PGST에 첨가하고, 4°C에서 밤새 인큐베이션한다.
      참고: 면역 형광에 대한 최적의 항체 농도가 제조업체에 의해 보고되지 않은 경우, 다양한 농도(예: 1:50, 1:200, 1:500, 1:1000)를 사용하는 대조군 섹션에서 사전 항체 적정을 수행해야 합니다.
    7. 절편을 PBS로 세 번 부드럽게 세척하여 결합되지 않은 일차 항체를 제거하였다.
    8. 조직을 PBS 중의 1:1000 관련 알렉사 플루오르 이차 항체로 2시간 동안 RT에서 하룻밤 동안 인큐베이션한다.
    9. PBS로 5분 동안 조직을 세 번 부드럽게 세척하여 과량의 결합되지 않은 이차 항체를 제거하였다.
    10. DAPI가 들어있는 장착 매체로 슬라이드를 장착하고 RT에서 어두운 곳에서 슬라이드를 건조시킵니다.
    11. 형광 현미경을 사용하여 절편을 이미지화하십시오.

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결과

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SCAD의 생성은 세 가지 필수 단계로 분리 될 수 있습니다 : P0-P1 마우스에서 피부를 다시 수확하고, 전체 두께 생검 펀치를 생성하고, 96 웰 플레이트에서 최대 5 일까지 개별 스캐드를 배양하십시오. 판독으로서, 이러한 분석은 흉터의 공간적 및 시간적 측면을 분석하기 위해 추가로 적용될 수 있다. 공간 분석은 조직의 2D 및 3D 면역 표지를 사용하여 개발 흉터 조직 내에서 세포 및 매트릭스 구성 요소의 공간적 국소화를 연구합니다. 시공간 연구는 관련 3D 타임랩스 이미징 양식을 사용하여 시각화할 수 있는 조직 내재적 또는 외인성 형광 단백질을 사용하여 이러한 전 계내 흉터를 시각화할 수 있도록 합니다.

이 분석의 중추적 인 단계는 전두께 생검 펀치를 신중하게 생성하고, 근막 "젤리"층의 존재를 보장하고, 완전히 침수 된 조직을 거꾸로 배양함으로써 실험을 설정하는 것입니다 (표피는 96 웰 플레이트의 바닥을 향하고 있음). 이를 통해 균일 한 흉터, 관련...

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토론

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부상 후 흉터 형성을 이해하기 위해 이미 여러 모델이 개발되었습니다. 이와 관련하여 많은 발전이 이루어졌지만 실제 메커니즘은 여전히 명확하지 않습니다. 이전의 기술과는 달리, SCAD 모델은 모든 세포 유형 및 피부 층을 통합하여, 천연 피부(18,19)의 복잡성을 유지한다. 이 방법론은 흉터 형성을 유도하는 분자 메커니즘을 이해하는 데 중요한 기본 데이터 세트를 생성 할 수 있습니다. 이 분석은 간단하고 최소한이지만 섬유아세포 이동, ECM 침착, 표피/근육 수축13,14를 이해하는 데 중요한 기본적이고 기능적인 판독값을 생성할 수 있는 방식으로 설계되었습니다. 생체내 설정보다 상대적으로 덜 복잡하며, 샘플에 대한 편차를 최소화할 수 있다. 또한, 이 분석은 높은 처리량의 분석 파이프라인과 쉽게 결합될 ...

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공개 사항

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모든 저자는 경쟁 이익을 선언하지 않습니다.

감사의 글

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우리는 SCAD 방법론13의 개발에 기여한 Jiang et al. 2020의 모든 공동 저자를 인정합니다. Multiphoton 시스템에 대한 액세스를 위해 Steffen Dietzel 박사와 Ludwig-Maximilans-Universität의 Bioimaging 핵심 시설에 감사드립니다. Y.R.은 Else-Kröner-Fresenius-Stiftung (2016_A21), ERC-CoG 819933 European Research Council Consolidator Grant 및 LEO Foundation (LF-OC-21-000835)의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
10% 트윈 20, 비이온성 세제Biorad Laboratories1610781
소 혈청 알부민, 콜드 에탄올 프랙트SigmaA4503-50G
DMEM/F-12, HEPES, 페놀 레드 없음-500mLLIFE Technologies11039021
DPBS, 칼슘 없음, 마그네슘 없음Gibco14190169
Epredia Cryostar NX70 CryostatThermo 과학적인
Epredia SuperFrost Plus 접착 슬라이드Fisher 과학적J1800AMNZ접착 슬라이드
Fetal Bovine Serum, 인증, 열 비활성화, E.U. 승인, 남미 원산지-500 mLLIFE Technologies 
Life Technologies가 있는 Fluoromount-G00 4959 52
가이드핀스테인리스 스틸(핀셋)이 있는 미세한 점으로 구부러진 DAPI 집게가 있는 장착 매체125mm 길이Fisher12381369
돼지 껍질의 젤라SigmaG2500-100G
GlutaMAX Supplement-100mLLIFE Technologies35050038
HBSS, 칼슘, 마그네슘, 페놀 레드 없음-500 mLLIFE Technologies14025092
Ibidi CO2 및 O2Ibidi11922
Ibidi 난방 시스템Ibidi10915
Leica SP8 수직 현미경 - 다광자 여기 680– 1300 nmLeica25x 물 담그기 대렌즈 (HC IRAPO L 25x/1.00  W)를 조정 가능한 레이저(Spectra-Physics, InSight DS +  단일)
비필수 아미노산LIFE Technologies11140035
NuSieve GTG Agarose, 25 gBiozym /Lonza859081
OCT 임베딩 매트릭스Carlroth6478.1
파라포름알데히드, 16% W/V AQ. 10 x10 mLVWR International43368.9M
Pen-StrepGibco15140122
Stiefel Biopsy-Punch 2 mmStiefel270130
직선 날카롭고 날카로운 해부 가위 11.4 cmFisher Scientific15654444
Thimerosal Bioxtra, 97%– 101%Sigma-AldrichT8784-1G
Zeiss Axioimager M2 정립 현미경Zeiss
10500064DAPI Scientific틴

참고문헌

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  11. Walmsley, G. G., et al. Live fibroblast harvest reveals surface marker shift in vitro. Tissue Engineering. Part C, Methods. 21 (3), 314-321 (2015).
  12. Hakkinen, K. M., Harunaga, J. S., Doyle, A. D., Yamada, K. M. Direct comparisons of the morphology, migration, cell adhesions, and actin cytoskeleton of fibroblasts in four different three-dimensional extracellular matrices. Tissue Engineering. Part A. 17 (5-6), 713-724 (2011).
  13. Jiang, D., et al. Injury triggers fascia fibroblast collective cell migration to drive scar formation through N-cadherin. Nature Communications. 11 (1), 5653(2020).
  14. Wan, L., et al. Connexin43 gap junction drives fascia mobilization and repair of deep skin wounds. Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 97, 58-71 (2021).
  15. Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T. -L., Ertürk, A. A guidebook for DISCO tissue clearing. Molecular Systems Biology. 17 (3), 9807(2021).
  16. Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).
  17. Ertürk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
  18. Wilhelm, K. -P., Wilhelm, D., Bielfeldt, S. Models of wound healing: an emphasis on clinical studies. Skin Research and Technology: Official Journal of International Society for Bioengineering and the Skin (ISBS) [and] International Society for Digital Imaging of Skin (ISDIS) [and] International Society for Skin Imaging (ISSI). 23 (1), 3-12 (2017).
  19. Grada, A., Mervis, J., Falanga, V. Research techniques made simple: Animal models of wound healing). The Journal of Investigative Dermatology. 138 (10), 2095-2105 (2018).

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