SCAD 분석을 사용한 흉터 발달 시각화 - 전 계내 피부 흉터 분석

요약

이 프로토콜은 "A Dish의 조직과 같은 SCar"또는 SCAD라고 불리는 피부 근막 외래 식물의 생성을 설명합니다. 이 모델은 흉터 형성 동안 단일 섬유 아세포의 전례없는 시각화를 허용합니다.

초록

깊은 조직 상처 밀봉에 대한 포유류의 세계적인 반응은 흉터 형성 및 조직 수축을 통해 이루어지며, 이는 전문화된 근막 섬유아세포에 의해 매개된다. 흉터 형성 및 손상된 상처 치유의 임상 적 중요성에도 불구하고, 상처 치유에서 근막 섬유 아세포 역학에 대한 우리의 이해는 피부 상처와 같은 복잡한 환경에서 섬유 아세포 안무 및 역학의 직접적인 시각화를 가능하게하는 관련 분석이 부족하기 때문에 까다 롭습니다. 이 논문은 피부 상처의 복잡한 환경을 모방하는 SCAD 또는 "접시의 SCar-유사 조직"을 사용하여 ex-situ 피부 흉터를 생성하는 프로토콜을 제시합니다. 이 분석에서, 2mm 전체 두께의 피부를 적출하고 5 일 동안 배지에서 거꾸로 배양하여 흉터와 피부 수축이 균일하게 발생합니다. 섬유아세포-계보 특이적 트랜스제닉 마우스 모델과 결합된 이 방법론은 전체 상처 복구 과정에 걸쳐 개별 섬유아세포 혈통을 시각화할 수 있게 한다. 전반적으로,이 프로토콜은 연구자가 상처 복구의 기본 과정과 메커니즘을 이해하고 상처 치유 결과에 대한 조절제의 효과를 직접 탐구하는 데 도움을줍니다.

서론

상처 치유는 침해 된 상처의 회복 과정입니다. 무척추 동물의 조직 손상은 부분적 또는 완전한 재생을 초래합니다. 대조적으로, 포유류는 흉터에 의한 깊은 부상에 반응하는데, 이는 침범 부위를 최소화 하고 동시에 부상당한 부위 1,2,3을 영구적으로 변형시키는 매트릭스 섬유의 조밀 한 플러그로 상처를 신속하게 봉인하도록 맞춤화 된 과정입니다. 포유류의 큰 피부 화상이나 깊은 열린 상처는 비후성 또는 켈로이드 흉터 ^4,5와 같은 병리학 적 표현형을 초래합니다. 이러한 풍부한 흉터는 임상 및 글로벌 의료 시스템에 엄청난 부담을 안겨줍니다. 미국에서만 흉터 관리 비용은 연간 약 100 억 달러 ^6,7입니다. 따라서 흉터 형성과 관련된 기금 과정과 메커니즘을 더 잘 이해하기 위해서는 관련 방법론의 개발이 필요합니다.

최근 몇 년 동안, 마우스에 대한 광범위한 연구는 특정 피부 위....

프로토콜

아래에 제시된 모델은 Jiang et al., 2020¹³에 간략하게 기재된 바와 같이 SCAD 분석의 생성에 대한 상세한 단계별 설명을 제공한다. SCAD 샘플 준비는 국제 및 어퍼 바이에른 정부 지침에 따라 동물을 희생시킨 후에 수행되었다. 동물들은 헬름홀츠 센터 뮌헨의 동물 시설에 수용되었다. 객실은 최적의 습도와 일정한 온도로 12 시간 빛주기로 유지되었습니다. 동물에게 음식 및 광고 리비툼 물을 공급하였다.

1. SCAD 조직 준비

1. 신생아 새끼를 출생 후 0 일 또는 1 일째 (P0 또는 P1)에 희생하십시오.
2. 멸균 수술용 메스를 이용하여 골격근층이 될 때까지 적어도 1.5 cm x 1.5 cm 전체 두께의 등쪽 등 피부를 조심스럽게 절제한다.
3. 멸균 곡선 포셉을 사용하여 피부를 벗겨 내고 표면 근막이 기본 panniculus carnosus 근육과 손상되지 않도록하십시오.
4. 적출된 조직을 50-100 mL의 차가운 DMEM/F-12 배지로 세척하여 오염된 혈액을 제거하십시오.
5. 행크스의 균형 잡힌 소금 용액 (HBSS)으로 한 번 씻어 조직과 세포 생존력을 유지....

결과

SCAD의 생성은 세 가지 필수 단계로 분리 될 수 있습니다 : P0-P1 마우스에서 피부를 다시 수확하고, 전체 두께 생검 펀치를 생성하고, 96 웰 플레이트에서 최대 5 일까지 개별 스캐드를 배양하십시오. 판독으로서, 이러한 분석은 흉터의 공간적 및 시간적 측면을 분석하기 위해 추가로 적용될 수 있다. 공간 분석은 조직의 2D 및 3D 면역 표지를 사용하여 개발 흉터 조직 내에서 세포 및 매트릭스 구성 요소의 공간적 국소화를 연구합니다. 시공간 연구는 관련 3D 타임랩스 이미징 양식을 사용하여 시각화할 수 있는 조직 내재적 또는 외인성 형광 단백질을 사용하여 이러한 전 계내 흉터를 시각화할 수 있도록 합니다.

이 분석의 중추적 인 단계는 전두께 생검 펀치를 신중하게 생성하고, 근막 "젤리"층의 존재를 보장하고, 완전히 침수 된 조직을 거꾸로 배양함으로써 실험을 설정하는 것입니다 (표피는 96 웰 플레이트의 바닥을 향하고 있음). 이를 통해 균일 한 흉터, 관련.......

토론

부상 후 흉터 형성을 이해하기 위해 이미 여러 모델이 개발되었습니다. 이와 관련하여 많은 발전이 이루어졌지만 실제 메커니즘은 여전히 명확하지 않습니다. 이전의 기술과는 달리, SCAD 모델은 모든 세포 유형 및 피부 층을 통합하여, 천연 피부(^18,19)의 복잡성을 유지한다. 이 방법론은 흉터 형성을 유도하는 분자 메커니즘을 이해하는 데 중요한 기본 데이터 세트를 생성 할 수 있습니다. 이 분석은 간단하고 최소한이지만 섬유아세포 이동, ECM 침착, 표피/근육 수축^13,14를 이해하는 데 중요한 기본적이고 기능적인 판독값을 생성할 수 있는 방식으로 설계되었습니다. 생체내 설정보다 상대적으로 덜 복잡하며, 샘플에 대한 편차를 최소화할 수 있다. 또한, 이 분석은 높은 처리량의 분석 파이프라인과 쉽게 결합될 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
10% 트윈 20, 비이온성 세제	Biorad Laboratories	1610781
소 혈청 알부민, 콜드 에탄올 프랙트	Sigma	A4503-50G
DMEM/F-12, HEPES, 페놀 레드 없음-500mL	LIFE Technologies	11039021
DPBS, 칼슘 없음, 마그네슘 없음	Gibco	14190169
Epredia Cryostar NX70 Cryostat	Thermo 과학적인
Epredia SuperFrost Plus 접착 슬라이드	Fisher 과학적	J1800AMNZ	접착 슬라이드
Fetal Bovine Serum, 인증, 열 비활성화, E.U. 승인, 남미 원산지-500 mL	LIFE Technologies
Life Technologies	가 있는 Fluoromount-G	00 4959 52
가이드핀스테인리스 스틸(핀셋)이 있는 미세한 점으로 구부러진 DAPI 집게가 있는 장착 매체125mm 길이	Fisher	12381369
돼지 껍질의 젤라	Sigma	G2500-100G
GlutaMAX Supplement-100mL	LIFE Technologies	35050038
HBSS, 칼슘, 마그네슘, 페놀 레드 없음-500 mL	LIFE Technologies	14025092
Ibidi CO2 및 O2	Ibidi	11922
Ibidi 난방 시스템	Ibidi	10915
Leica SP8 수직 현미경 - 다광자 여기 680– 1300 nm	Leica		25x 물 담그기 대렌즈 (HC IRAPO L 25x/1.00  W)를 조정 가능한 레이저(Spectra-Physics, InSight DS +  단일)
비필수 아미노산	LIFE Technologies	11140035
NuSieve GTG Agarose, 25 g	Biozym /Lonza	859081
OCT 임베딩 매트릭스	Carlroth	6478.1
파라포름알데히드, 16% W/V AQ. 10 x10 mL	VWR International	43368.9M
Pen-Strep	Gibco	15140122
Stiefel Biopsy-Punch 2 mm	Stiefel	270130
직선 날카롭고 날카로운 해부 가위 11.4 cm	Fisher Scientific	15654444
Thimerosal Bioxtra, 97%– 101%	Sigma-Aldrich	T8784-1G
Zeiss Axioimager M2 정립 현미경	Zeiss

10500064DAPI Scientific틴