이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.

방법 논문

3D 프린팅된 스탬프와 같은 장치를 통한 조직 스페로이드 생성

2.7K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/63814

⸱

2022년 10월 6일

 ,  , 
1Nanotechnology Engineering Program, Alberto Luiz Coimbra Institute for Graduate Studies and Research in Engineering, COPPE, Federal University of Rio de Janeiro (UFRJ), 23D Biofabrication Training and Innovation Center, BioEdtech

이 논문에서

요약

본 프로토콜은 3D 프린팅된 스탬프와 같은 장치를 사용하여 비용 효율적으로 조직 스페로이드를 대규모로 생산하는 기술을 설명합니다.

초록

3D 세포 배양의 발전으로 조직 스페로이드와 같이 생리학적으로 관련성이 높은 in vitro 모델이 개발되었습니다. 스페로이드로 배양된 세포는 in vivo 환경과 유사한 보다 현실적인 생물학적 반응을 보입니다. 이러한 장점으로 인해 조직 스페로이드는 광범위한 생명공학적 적용 가능성을 갖춘 우수하고 신뢰할 수 있으며 예측력이 뛰어난 연구 모델을 향한 새로운 추세를 나타냅니다. 그러나 조직 스페로이드의 대규모 생산을 달성할 수 있는 재현 가능한 플랫폼은 그 잠재력을 완전히 탐구하고 향상시키는 데 있어 충족되지 않은 요구 사항이 되었습니다. 여기에서, 균질한 조직 스페로이드의 대규모 생산은 저비용 및 시간 효율적인 방법론을 사용하여 보고됩니다. 3D 프린팅된 스탬프와 같은 장치는 6웰 플레이트당 최대 4,716개의 스페로이드를 생성하도록 개발되었습니다. 이 장치는 광경화성 수지를 사용하는 광조형법으로 제작됩니다. 최종 장치는 높이 1.3mm, 너비 650μm의 원통형 마이크로핀으로 구성됩니다. 이 접근법을 사용하면 모양과 크기가 균일하고 세포 생존율이 >95%인 균질 스페로이드 및 공동 배양 스페로이드를 빠르게 생성할 수 있습니다. 또한, 스탬프와 같은 장치는 다양한 크기의 웰 플레이트와 페트리 접시에 대해 조정할 수 있습니다. 쉽게 살균할 수 있으며 장기간 재사용할 수 있습니다. 균질 조직 스페로이드의 효율적인 대량 생산은 조직 공학, 약물 개발, 질병 모델링 및 주문형 맞춤형 의학과 같은 여러 산업 분야에서 스페로이드의 번역을 활용하는 데 필수적입니다.

서론

조직 스페로이드는 세포 현탁액에 의해 형성된 3D 미세 조직으로, 외력 없이 자가 조립을 거칩니다1. 이러한 스페로이드는 인간 생리학적 시스템 2,3의 주요 특징과 유사하기 때문에 생체 제조 프로토콜에 널리 사용되었습니다. 조직 스페로이드는 기존의 단층 세포 배양보다 더 유사한 대사, 세포골격 역학, 세포 생존력, 대사 및 분비 활성을 제공합니다1. 융합 능력으로 인해 생물학적 관련성이 향상된 복잡한 조직 공학 구조를 형성하기 위한 빌딩 블록(예: 바이오프린팅 프로토콜)으로도 사용할 수 있습니다 4,5.

생물학적 관련성으로 인해 조직 스페로이드는 조직 공학, 약물 개발, 질병 모델링 및 나노 독성 평가에 이르는 프로토콜의 생명 공학 도구로 사용되어 시간, 공간 비용 및 동물 실험을 줄였습니다 3,6,7,8. 그럼에도 불구하고 조직 스페로이드의 잠재력을 완전히 탐구하고 활용하기 위해서는 대규모 생산을 목표로 하는 신뢰할 수 있고 재현 가능한 방법이 매우 필요하며, 이는 여전히 지속적인 과제로 남아 있습니다.

여러 방법론은 행잉 드롭, 코팅된 U자형 바닥 웰, 미세 유체 공학 및 고분자 매트릭스 9,10 사용과 같은 스페로이드를 생산합니다. 이러한 방법론은 스페로이드 생산 시장에서 길을 열었지만 여전히 복잡하고 시간이 많이 걸리며 노동 집약적이거나 비용이 많이 듭니다10.

본 프로토콜은 저비용 및 시간 효율적인 방법론을 사용하여 균질한 조직 스페로이드의 대규모 생산을 보고합니다. 당사는 6웰 플레이트당 최대 4,716개의 스페로이드를 생성할 수 있는 3D 프린팅 스탬프와 같은 장치를 개발했습니다. 또한, 스탬프와 같은 장치는 웰당 더 많은 스페로이드를 생산하도록 맞춤화할 수 있으며, 이는 다양한 세포 배양 플레이트에 적합합니다. 쉽게 살균할 수 있으며 장기간 재사용할 수 있습니다. 균질 조직 스페로이드의 효율적인 대량 생산은 조직 공학, 약물 개발, 질병 모델링 및 주문형 맞춤형 의학과 같은 여러 산업 분야에 기여하여 임상에 사용을 전환하는 데 필수적입니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

본 연구에는 L929 세포주인 마우스 섬유아세포(mouse fibroblasts)가 사용되었습니다. 스탬프와 같은 3D 프린팅 바이오 디바이스는 상업적 출처에서 획득했습니다( 재료 표 참조). 임상시험계획서 전반에 걸쳐 우수한 세포 배양 관행과 멸균 기법을 따랐습니다. 제작된 장치는 70% 알코올로 닦고 15분 동안 자외선에 노출시켜 살균했습니다. 세포 배양 배지 및 용액을 세포 또는 조직 스페로이드와 접촉하기 전에 37°C로 가온하였다. 프로토콜의 개략도는 그림 1에 나와 있습니다.

1. 스탬프와 같은 장치에서 비접착 금형 준비

  1. 아래 단계에 따라 2%(w/v) 아가로스 겔을 준비합니다.
    1. 아가로스 분말을 인산염 완충 식염수(1x PBS)에 희석하고 생성된 현탁액을 원형 운동으로 균질화합니다.
      알림: 이 용액은 유리병에 넣을 수 있습니다. 이 단계에서 아가로스 용액은 반투명하지 않습니다.
    2. 유리병을 전자레인지에 넣고 30초 동안 굳힙니다. 5초마다 전자레인지를 중지하고 유리병을 제거한 다음 원을 그리며 용액을 수동으로 균질화합니다. 용액이 액체 림피드 상태에 도달할 때까지 가열 공정을 수행해야 합니다.
      알림: 핫 플레이트는 전자레인지 대체품으로도 사용할 수 있습니다. 가열 과정이 끝나면 용액은 반투명/림프여야 합니다.
    3. 실험을 위해 계획된 6-웰 플레이트의 각 웰에 1mL의 아가로스 용액을 추가합니다.
    4. ~15분 동안 또는 아가로스가 응고될 때까지 기다립니다.
      알림: 냉각판을 사용하여 응고 시간을 줄일 수 있습니다.
    5. 아가로스 용액 1-2mL를 추가하고 액체 아가로스 위에 장치를 부드럽게 삽입합니다.
      알림: agarose 장치 인터페이스에 기포가 발생하지 않도록 장치를 조심스럽게 배치해야 합니다.
    6. ~30분 동안 또는 아가로스가 응고될 때까지 기다립니다.
      알림: 냉각판을 사용하여 응고 시간을 줄일 수 있습니다.
    7. 아가로스에서 장치를 부드럽게 제거합니다.
      참고: 제거가 중요합니다. 아가로스 기능을 그대로 유지하기 위해 조심스럽게 제거해야 합니다. 그렇지 않으면 아가로스가 중단될 수 있습니다.
    8. DMEM 배지 2mL를 넣고 10분 동안 기다린 후 배지를 버리고 새 DMEM으로 교체합니다. 우물을 제대로 씻으려면 이것을 세 번 반복하십시오.
    9. 2mL의 DMEM을 추가하고 세포 파종(그림 2A-F, 보충 비디오 1)이 이루어질 때까지 6웰 플레이트를 인큐베이터(5% CO2 및 80% 습도에서 37°C)에 놓습니다.

2. 조직 스페로이드의 생성

참고: 서로 다른 세포 계통은 서로 다른 접착 특성을 가지고 있습니다. 따라서 이 방법을 사용하면 일부 유형의 세포가 조직 스페로이드를 제대로 형성하지 못할 수 있습니다.

  1. 전통적인 단층 배양에 따라 세포를 성장시킵니다(즉, 10% 소 태아 혈청(FBS), 100μg/mL 페니실린 및 100μg/mL 스트렙토마이신이 보충된 저포도당이 있는 DMEM을 사용하여 세포 배양 플라스크에서 세포를 성장시킵니다( 재료 표 참조). 5% CO2 인큐베이터에서 세포를 37°C로 유지하고 합류도의 80%에 도달할 때까지 모니터링합니다.
  2. 원하는 합류점에 도달한 후 1x PBS로 세포를 세척합니다.
    참고: 25cm플라 스크의 경우 5mL, 75cm플라 스크의 경우 10mL, 150cm플라 스크의 경우 15mL를 사용하는 것이 좋습니다.
  3. 해리 효소를 첨가하고 5 % CO2 및 80 % 습도에서 37 ° C에서 2-5 분 동안 세포를 배양합니다.
    참고: 본 연구는 0.78mM 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA)과 함께 0.125% 트립신을 해리 효소로 사용했습니다( 재료 표 참조).
  4. 세포 배양 플라스크에서 세포가 분리되는 것을 관찰하고 세포 해리 효소를 중화하기 위해 FBS가 보충된 성장 배지를 추가합니다.
    참고: 본 연구를 위해 저포도당( 재료 표 참조)의 DMEM에 10% FBS를 보충했습니다.
  5. 셀 현탁액을 실온에서 400 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 셀을 수동으로 계산합니다.
  6. 튜브당 50 x 105 세포를 취하고 5mL의 1x PBS를 추가합니다.
    참고: 파종된 세포의 수는 최종 조직 스페로이드 직경에 영향을 미칩니다. 따라서 세포 수를 증가시켜 더 큰 직경을 가진 조직 스페로이드를 생성할 수 있습니다.
  7. 셀 현탁액을 실온에서 400 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다.
  8. 피펫을 사용하여 상층액을 제거하고 세포 배양 배지 1mL를 첨가하고 용액을 균질화합니다.
    참고: 본 연구에서는 10% FBS, 100μg/mL 페니실린 및 100μg/mL 스트렙토마이신이 보충된 저포도당의 DMEM의 완전한 배양 배지를 사용했습니다.
  9. 6웰 플레이트에서 2mL의 배지를 제거하고(단계 1.1.9) 3D 프린팅 바이오디바이스(단계 1.1.7)로 형성된 아가로스 몰드의 중앙에 세포 현탁액 1mL를 추가합니다. 미세 절제술에서 세포가 침전될 때까지 기다렸다가(~20-30분) 1mL의 세포 배양 배지를 웰에 조심스럽게 추가합니다.
    참고: 이 단계에서는 각별히 주의해야 합니다. 배지를 부드럽게 추가하고 피펫 팁을 웰 벽 가까이에 놓고 소량으로 분주하는 것이 좋습니다.
  10. 조직 스페로이드가 형성되도록 인큐베이터(37°C에서 5% CO2 및 80% 습도)에 6웰 플레이트를 놓습니다(세포 유형에 따라 약 24-48시간)(그림 3).
    참고: 다른 세포 유형(예: 암세포, 일차 세포)은 서로 다른 자기 조립 역학을 가지고 있습니다11.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

3D 프린팅된 스탬프와 같은 장치를 사용한 균일한 미세 절제 생성
3D 프린팅된 스탬프와 같은 장치는 광경화성 수지를 사용하여 광조형 방법(12)으로 성공적으로 제조되었습니다(그림 2A). 최종 장치는 높이 1.3mm, 너비 650μm의 원통형 마이크로핀으로 구성되었습니다(그림 2A). 비접착 미세 절제를 생성하기 위한 마스터 몰드로 사용하는 것은 형상을 유지함으로써 달성되었습니다(그림 2B-F 및 보충 비디오 1). 이 장치는 사용이 간편하고 살균이 쉬우며 장기적으로 재사용할 수 있었습니다. 또한 다양한 크기의 웰 플레이트(즉, 6웰, 12웰, 24웰, 96웰) 및 페트리 접시(즉, 30mm, 50mm...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

본 프로토콜은 조직 스페로이드의 대규모 생산을 위한 간단하고 빠르며 저렴한 방법을 설명합니다. 스탬프와 같은 3D 프린팅 장치를 마스터 몰드로 사용하여 6웰 플레이트당 최대 4,716개의 스페로이드를 생성했습니다. 스페로이드로 배양된 세포는 in vivo 환경1과 매우 유사한 보다 현실적인 생물학적 반응을 갖는 것으로 나타났습니다. 이러한 장점으로 인해 조직 스페로이드는 우수하고 신뢰할 수 있으며 예측이 더 많은 연구 모델을 향한 새로운 추세를 나타냅니다13,14. 따라서 대규모 생산을 달성하기 위한 새로운 방법론을 개발하는 것은 해당 응용 프로그램을 활용하는 데 매우 중요합니다.

이 방법론을 사용하여 조직 스페로이드를 성공적으로 생성하려면 장치를 액체 아가...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

3D 프린팅된 스탬프와 같은 장치는 Janaína Dernovsek이 공동 창립자이자 혁신 이사인 스타트업 Bioedtech에서 제공했습니다. 저자는 경쟁하는 재정적 이익이 없음을 선언합니다.

감사의 글

이 연구는 리우데자네이루 주 연구 지원 재단(FAPERJ, 브라질), 고등교육 인력 향상을 위한 조정(CAPES, 브라질) 및 브라질 국가 과학 기술 개발 위원회(CNPq, 브라질)의 지원을 받았습니다. 이 연구에 사용된 스탬프와 같은 장치를 제공한 Bioedtech와 세포 배양 시설을 사용해 준 면역약리학 실험실의 Bartira Bergmann 교수에게 감사드립니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
6 웰 플레이트MerckCLS3516
AgarosePromegaV3121
Biodevice Bioedtech
생물 안전 캐비닛ThermoFisher 
원심분리기ThermoFisher 
Corning 50 mL 원심분리기 튜브MerckCLS430829-500EA
Corning 세포 배양 플라스크 표면적 75 cm2MerckCLS430641
드래프트 레진 FormLabsFLDRBL01
Dulbecco′ s 수정된 독수리&프라임; S 중간 - 저포도MerckD6046
소태아 세럼 (FBS)ThermoFisher 
Form 2FormLabs
인큐베이터ThermoFisher 
L929 세포주실험실에 안정화됨 
페니실린 및 스트렙토마이신(PS)ThermoFisher 
인산염 완충 식염수(PBS)머크806552
트립신과 EDTA머크T3924
5102970175004031당 1600004451033782가 15140122

참고문헌

  1. Laschke, M., Menger, M. Life is 3D: Boosting spheroid function for tissue engineering. Trends in Biotechnology. 35 (2), 133-144 (2017).
  2. Mekhileri, N., et al. Automated 3D bioassembly of micro-tissues for biofabrication of hybrid tissue engineered constructs. Biofabrication. 10 (2), 024103(2018).
  3. Itoh, M., et al. Scaffold-free tubular tissues created by a bio-3D printer undergo remodeling and endothelialization when implanted in rat aortae. PLoS One. 10 (12), 0145971(2015).
  4. Kronemberger, G., et al. The hypertrophic cartilage induction influences the building-block capacity of human adipose stem/stromal cell spheroids for biofabrication. Artificial Organs. 45 (10), 1208-1218 (2021).
  5. Mironov, V., et al. Organ printing: Tissue spheroids as building blocks. Biomaterials. 30 (12), 2164-2174 (2009).
  6. Skardal, A., Shupe, T., Atala, A. Organoid-on-a-chip and body-on-a-chip systems for drug screening and disease modeling. Drug Discovery Today. 21 (9), 1399-1411 (2016).
  7. Garcez, P., et al. Zika virus impairs growth in human neurospheres and brain organoids. Science. 352 (6287), 816-818 (2016).
  8. Charelli, L., et al. Biologically produced silver chloride nanoparticles from B. megaterium modulate interleukin secretion by human adipose stem cell spheroids. Cytotechnology. 70 (6), 1655-1669 (2018).
  9. Cui, X., Hartanto, Y., Zhang, H. Advances in multicellular spheroids formation. Journal of the Royal Society Interface. 14 (127), 20160877(2017).
  10. Achilli, T., Meyer, J., Morgan, J. Advances in the formation, use and understanding of multi-cellular spheroids. Expert Opinion on Biological Therapy. 12 (10), 1347-1360 (2012).
  11. Rolver, M., Elingaard-Larsen, L., Pedersen, S. Assessing cell viability and death in 3D spheroid cultures of cancer cells. Journal of Visualized Experiments. (148), e59714(2019).
  12. Quan, H., et al. Photo-curing 3D printing technique and its challenges. Bioactive Materials. 5 (1), 110-115 (2020).
  13. Rodriguez-Salvador, M., Perez-Benitez, B., Padilla-Aguirre, K. Discovering the latest scientific pathways on tissue spheroids: Opportunities to innovate. International Journal of Bioprinting. 7 (1), 331(2021).
  14. Baptista, L., et al. Adult stem cells spheroids to optimize cell colonization in scaffolds for cartilage and bone tissue engineering. International Journal of Molecular Sciences. 19 (5), 1285(2018).
  15. Shakeri, A., Khan, S., Didar, T. Conventional and emerging strategies for the fabrication and functionalization of PDMS-based microfluidic devices. Lab on a Chip. 21 (16), 3053-3075 (2021).
  16. vander Valk, J. Fetal bovine serum (FBS): Past - present - future. ALTEX. 35 (1), 99-118 (2018).
  17. vander Valk, J., Brunner, D., et al. Optimization of chemically defined cell culture media - Replacing fetal bovine serum in mammalian in vitro methods. Toxicology in Vitro. 24 (4), 1053-1063 (2010).
  18. Smyrek, I., et al. microtubules and FAK dominate different spheroid formation phases and important elements of tissue integrity. Biology Open. 8 (1), 037051(2018).
  19. McMillen, P., Holley, S. Integration of cell-cell and cell-ECM adhesion in vertebrate morphogenesis. Current Opinion in Cell Biology. 36, 48-53 (2015).
  20. Tung, Y., et al. High-throughput 3D spheroid culture and drug testing using a 384 hanging drop array. The Analyst. 136 (3), 473-478 (2011).
  21. Guo, X., Li, S., Ji, Q., Lian, R., Chen, J. Enhanced viability and neural differential potential in poor post-thaw hADSCs by agarose multi-well dishes and spheroid culture. Human Cell. 28 (4), 175-189 (2015).
  22. Andréa Dernowsek, J., Rezende, R., Lopes daSilva, J. The role of information technology in the future of 3D biofabrication. Journal of 3D Printing in Medicine. 1 (1), 63-74 (2017).
  23. Garcez, P., et al. Zika virus impairs growth in human neurospheres and brain organoids. Science. 352 (6287), 816-818 (2016).
  24. Skardal, A., et al. Multi-tissue interactions in an integrated three-tissue organ-on-a-chip platform. Scientific Reports. 7, 8837(2017).
  25. Armoiry, X., et al. Autologous chondrocyte implantation with chondrosphere for treating articular cartilage defects in the knee: An evidence review group perspective of a NICE single technology appraisal. PharmacoEconomics. 37 (7), 879-886 (2018).
  26. Nakamura, A., et al. Bio-3D printing iPSC-derived human chondrocytes for articular cartilage regeneration. Biofabrication. 13 (4), 044103(2021).
  27. Mesquita, C., Charelli, L., Baptista, L., Naveira-Cotta, C., Balbino, T. Continuous-mode encapsulation of human stem cell spheroids using droplet-based glass-capillary microfluidic device for 3D bioprinting technology. Biochemical Engineering Journal. 174, 108122(2021).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

태그

3D 세포 배양대규모 스페로이드 생산3D 프린팅 장치광경화 성형법아가로스 몰드세포 파종조직 공학약물 개발질환 모델링
3D 프린팅된 스탬프와 같은 장치를 통한 조직 스페로이드 생성
문의하기
도서관에 추천하기

개인정보 처리방침

이용 약관

정책

저작권 © 2026 MyJoVE Corporation. 모든 권리 보유.