여기에 제시된 것은 인간 유도 만능 줄기 세포에서 분화 된 유 전적으로 일치하는 상피 및 혈관 내피 세포를 통합하여 신장 사구체 여과 장벽의 구조와 기능을 요약하는 개인화 된 장기 온 칩 시스템을 설계하는 프로토콜입니다. 이 생체 공학 시스템은 신장 정밀 의학 및 관련 응용 분야를 발전시킬 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
만성 신장 질환(CKD)은 미국 성인 인구의 15%에 영향을 미치지만 인간의 생물학적 반응과 신독성을 정확하게 예측할 수 있는 기능 모델이 부족하여 표적 치료법의 확립이 제한되었습니다. 신장 정밀 의학의 발전은 이러한 한계를 극복하는 데 도움이 될 수 있습니다. 그러나, 이전에 확립된 인간 신장 사구체의 시험관내 모델(혈액 여과를 위한 주요 부위이자 많은 질병 및 약물 독성의 주요 표적)은 일반적으로 제한된 기능적 특성과 타의 추종을 불허하는 유전적 배경을 가진 이질적인 세포 집단을 사용합니다. 이러한 특성은 환자 특정 질병 모델링 및 치료 발견에 대한 적용을 크게 제한합니다.
이 논문은 단일 환자의 인간 유도 만능 줄기 (iPS) 세포 유래 사구체 상피 (podocytes)와 혈관 내피를 통합하여 등성 및 혈관 화 된 미세 유체 신장 사구체 칩을 설계하는 프로토콜을 제시합니다. 결과 사구체 칩은 줄기 세포 유래 내피 및 상피 세포층으로 구성되어 계통 특이 적 마커를 발현하고 기저막 단백질을 생성하며 신장의 사구체 여과 장벽과 유사한 조직-조직 인터페이스를 형성합니다. 설계된 사구체 칩은 분자를 선택적으로 필터링하고 약물로 인한 신장 손상을 요약합니다. 이소제닉 세포 유형을 사용하여 신장 사구체의 구조와 기능을 재구성하는 능력은 환자 특이성으로 신장 질환을 모델링하고 신장 정밀 의학 및 관련 응용 분야를 위한 장기 온 칩의 유용성을 발전시킬 수 있는 기회를 제공합니다.
서론
Organ-on-a-chip 장치는 분자 및 기계적 자극과 혈관 형성을 사용하여 특정 장기의 구조와 기능을 모델링하는 조직-조직 인터페이스를 형성하는 동적 3D in vitro 모델입니다. 신장의 사구체 (사구체 칩)를 재현하는 것을 목표로하는 이전에 확립 된 organ-on-a-chip 장치는 동물 세포주 1 또는 이종 소스 2,3의 인간1 차 및 불멸화 된 세포주로 구성되었습니다. 유 전적으로 이질적인 세포 공급원의 사용은 환자 특이 적 반응 및 유전학 또는 질병 메커니즘에 대한 연구를 크게 제한하는 변이를 나타냅니다 4,5. 이 문제를 해결하는 것은 시험관 내 모델 2,3,6 엔지니어링을 위한 보다 정확한 미세 환경을 제공하기 위해 보존된 분자 및 유전적 프로필을 가진 특정 개체에서 유래하는 등종 세포주의 가용성에 달려 있습니다. 인간 기원....
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프로토콜
1. 기저막 매트릭스 용액 및 코팅 기판 준비
- 기저막 매트릭스 1을 4°C에서 얼음 위에서 밤새 해동시킨다. 희석 비율에 대한 제조업체의 제안에 따른 분취량. 50mL 원뿔형 튜브와 피펫을 사용하여 완전히 해동되고 용해될 때까지 적절한 양의 기저막 매트릭스 1을 25mL의 차가운 DMEM/F12에 완전히 혼합합니다.
- 냉동 분취량을 용해하려면 200mL의 차가운 DMEM/F25에서 ~12μL를 취하여 냉동 분취량 튜브로 옮깁니다. 매트릭스가 완전히 해동되고 용해 될 때까지 위아래로 피펫하십시오. 기저막 매트릭스 1의 전체 튜브 내용물을 나머지 차가운 DMEM/F12로 옮깁니다.
- 기저막 매트릭스 1 용액 1mL를 6웰 플레이트의 각 웰에 피펫팅합니다. 코팅된 플레이트를 같은 날 사용하려면 37°C에서 2시간 동안 배양합니다.
- 대안적으로, 코팅된 플레이트를 파라필름으로 감싸고 4°C에서 최대 2주 동안 보관할 수 있다. 저장된 플레이트를 사용할 준비가 되면 37°C에서 30분 동안 배양합니다.
- 기저막 매트릭스 2를 멸균 증류수 9mL에 희석하여 최종 농도 5μg/mL를 달성합니다. 700 μL의 기저막 매트릭스 2 용액을 12-웰 플레이트의 각 ....
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결과
여기서 우리는 사구체의 기능적 3D 시험관 내 모델이 인간 iPS 세포의 등종 공급원으로부터 혈관화되고 상피화될 수 있음을 보여줍니다. 특히, 이 프로토콜은 인간 iPS 세포 기술, 특히 특수 세포 유형으로 분화하는 능력을 적용하여 환자 특정 수준에서 인간 신장의 구조와 기능을 모델링하기 위해 미세유체 장치와 통합될 수 있는 신장 사구체 상피(podocytes) 및 혈관 내피(viECs)를 생성하는 방법에 대한 지침을 제공합니다. 이 프로토콜 및 타임라인(그림 1A)의 개략적인 개요는 유사분열적으로 활성화된 인간 iPS 세포(그림 1B)를 배양한 다음 중배엽 및 측면 중배엽 세포 계통(그림 1C, D)으로 (병렬로) 분화하는 방법을 설명합니다. 생성된 중배엽 세포는 근접(T)을 발현하는 것으로 밝혀졌고, 측면 중배엽 세포는 .......
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토론
이 보고서에서는 동종 인간 iPS 세포주에서 혈관 내피 및 사구체 상피(족세포)를 유도하는 프로토콜과 이러한 세포를 사용하여 신장 사구체의 구조, 조직-조직 인터페이스 및 분자 여과 기능을 모방하는 3D 장기 온 칩 시스템을 설계하는 방법을 간략하게 설명합니다. 이 사구체 칩에는 내피와 사구체 상피가 장착되어 있어 함께 분자를 선택적으로 필터링하는 장벽을 제공합니다.
이 프로토콜을 적용하는 데 관심이있는 연구원은 다음과 같은 사항을 고려해야합니다 : 첫째, 사용되는 줄기 세포주의 고유 한 성장 특성에 따라 세포 파종에 최적화가 필요할 수 있습니다. 세포 파종 밀도는 인간 iPS 세포 증식 속도의 본질적인 차이로 인해 달라질 수 있습니다. 연구자들은 프로토콜에서 제안한 중배엽 파종 밀도로 시작한 다음 필요한 경우 조정하는 것이 좋습니다. 유사하게, 측면 중배엽 분화는 viEC 수율 및 50% 이상의 분류 효율을 달성하기 위해 필요에 따라 조정하기 전에 제안된 세포 파종 밀도로 시.......
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공개 사항
S.M.은 인간 iPS 세포로부터의 족세포 분화와 관련된 특허의 발명가이다. 다른 저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 듀크 대학의 프랫 공과 대학, 듀크 의과 대학의 신장학과, 생물 의학 연구의 화이트 헤드 장학금 및 S. Musah의 Genentech 연구 상이 지원했습니다. Y. Roye는 듀크 대학교 의생명공학과에서 듀크 대학교-알프레드 P. 슬론 재단 장학금과 윌리엄 M. "몬티" 라이커트 대학원 펠로우십을 받고 있습니다. DU11 (Duke University 클론 #11) iPS 세포주는 Duke iPSC Core Facility에서 생성되었으며 Duke University의 Bursac Lab에서 제공했습니다. 저자는 기술 지원과 유용한 토론에 대해 N. Abutaleb, J. Holmes, R. Bhattacharya 및 Y. Zhou에게 감사드립니다. 저자는 또한 원고에 대한 유용한 의견을 주신 Musah Lab 회원들에게 감사드립니다. 저자는 Acuri C6 유세포분석기를 선물한 Segura Lab에 감사를 표합니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Antibodies | |||
| Alexa Fluor 488- 및 Alexa Fluor 594 접합 2차 항체 | Thermo/Life Technologies | A32744; A32754입니다. A-11076; A32790입니다. A21203입니다. A11015 | |
| 콜라겐 IV | 열/생활 기술 | 14-9871-82 | |
| 네프린 | 프로젠 | GP-N2 | |
| PECAM-1 | R& D Systems | AF806 | |
| Podocin | Abcam | ab50339 | |
| VE-Cadherin | Santa Cruz | sc-9989 | |
| Basement membrane matrices | |||
| Corning Fibronectin, Human | Corning | 356008 | Basement membrane (3) |
| iMatrix-511 Laminin-E8 (LM-E8) fragment | Iwai North America | N8922012 | 기저막 매트릭스 (2) |
| Matrigel hESC 인증 매트릭스, 5-mL 바이알 | BD Biosciences | 354277 | 기저막 매트릭스 (1); 로트별 변동 |
| Cells | |||
| DU11 human iPS cells | DU11 (Duke University clone #11) iPS 세포주는 Duke iPSC Core Facility에서 생성되었으며 Duke University의 Bursac Lab에서 제공했습니다. 이 라인은 테스트를 거쳐 마이코플라스마(2021년 11월 마지막 테스트) 및 핵형 이상(2019년 7월)이 없는 것으로 확인 | ||
| Culture 배지 성장 인자 및 배지 보충제 | |||
| 0.5M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 | |
| 2-Mercaptoethanol | Thermo/Life Technologies | 21985023 | |
| Albumin from bovine serum, Texas Red conjugate | Thermo/Life Technologies | A23017 | |
| All-trans retinoic acid (500 mg) | Stem Cell Technologies | 72262 | |
| B27 무혈청 보충제 | Thermo/Life Technologies | 17504044 | |
| B-27 보충제(50x) 비타민 A 없음 | Thermo/Life Technologies | 12587010 | |
| 소 혈청 알부민 | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | 로트별 변동을 보일 수 있음 |
| CultureBoost-R | 세포 시스템 | 4Z0-500-R | 포도세포 유지 관리 매체 |
| DMEM/F12 Thermo | /Life Technologies | 12634028 | |
| GlutaMAX 보충제가 포함된 DMEM/F12 | Thermo/Life Technologies | 10565042 | DMEM/F12와 글루타민 |
| 포스콜린(아데닐릴 시클라아제 활성제) | Abcam | ab120058 | |
| GlutaMAX 보충제 | Thermo/Life Technologies | 35050061 | 글루타민 보충제 |
| 열 비활성화 FBS | Thermo/Life Technologies | 10082147 | |
| 헤파린 용액 | Stem Cell Technologies | 7980 | |
| Human Activin A | Thermo/Life Technologies | PHC9544 | |
| 인간 BMP4 | Preprotech | 120-05ET | |
| 인간 BMP7 | Thermo/Life Technologies | PHC9544 | |
| Human VEGF | Thermo/Life Technologies | PHC9394 | |
| Inulin-FITC | Sigma-Aldrich | F3272 | |
| mTeSR1 매체 | 줄기 세포 기술 | 05850 | 인간 iPS 세포 배양 배지(CCM). 제조업체에 따라 5x 보충제를 추가하십시오. Human iPS CCM은 -20°C에서 최대 6개월 동안 보관할 수 있습니다. |
| N-2 Supplement (100x) | Thermo/Life Technologies | 17502048 | |
| Neurobasal media | Thermo/Life Technologies | 21103049 | Lateral mesoderm basal media |
| PBS (Phosphate-buffered saline) | Thermo/Life Technologies | 14190-250 | |
| Penicillin-streptomycin, liquid (100x) | Thermo/Life Technologies | 15140-163 | |
| ROCK 억제제 (Y27632) | Tocris | 1254 | |
| StemPro-34 SFM | Thermo/Life Technologies | 10639011 | 내피 세포 배양 배지(CCM). 제조업체에 따라 보충제를 추가하십시오. 내피 CCM은 4°C; C 또는 -20 ° C는 최대 6개월 동안 사용할 수 있습니다. |
| TGF-베타 억제제 (SB431542) | Stem Cell Technologies | 72234 | |
| Enzymes and other reagents | |||
| Accutase | Thermo/Life Technologies | A1110501 | Cell detachment buffer |
| Dimethyl Suloxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| Ethanol solution, 70% (vol/vol), biotechnology grade | VWR | 97065-058 | |
| 파라포름알데히드(PFA) | Thermo/Life Technologies | 28906 | |
| 멸균 증류수 | Thermo/Life Technologies | 15230162 | |
| Triton X-100 | VWR | 97062-208 | |
| Equipment | |||
| Trypsin EDTA, 0.05% | Thermo/Life Technologies | 25300-120 | |
| (Orb) 허브 모듈 | 에뮬레이트 | ORB-HM1 | |
| 100mm x 15mm 원형 페트리 접시 | Fisherbrand | FB087579B | |
| 120 x 120mm 정사각형 세포 배양 접시 | VWR | 688161 | |
| Accuri C6 | BD Biosciences | ||
| 흡입 피펫, 개별 포장 | Corning | 29442-462 | |
| 흡입 장치 | SP Bel-Art | F19917-0150 | |
| Avanti J-15R 원심분리기 | Beckman Coulter | B99516 | |
| 원추형 원심분리기 튜브, 15mL | Corning | 352097 | |
| 원추형 원심분리기 튜브, 50mL | Corning | 352098 | |
| EVOS M7000 | Thermo/Life Technologies | AMF7000 | 형광 현미경을 사용하여 고정 및 염색된 이미지 촬영 셀. |
| 혈구계 | VWR | 100503-092 | |
| Heracell VIOS 160i CO2 인큐베이터 | Thermo/Life Technologies | 51030403 | |
| AxioCam 503 카메라 장착 Inverted Zeiss Axio Observer | Carl Zeiss Micrscopy | 491916-0001-000(microscope) ; 426558-0000-000(camera) | |
| Kimberly-Clark 니트릴 장갑 | VWR | 40101-346 | |
| Kimwipes, large | VWR | 21905-049 | |
| Leoca SP8 직립 컨포칼 현미경 | |||
| 미디어 저장소 (POD 휴대용 모듈) | 에뮬레이트 | POD-1 | |
| 마이크로 플레이트 셰이커 | VWR | 12620-926 | |
| 장기 칩 | 에뮬레이트 | S-1 칩 | |
| 장기 칩 홀더 | 에뮬레이트 | AK-CCR | |
| P10 정밀 배리어 피펫 팁 | Denville Scientific | P1096-FR | |
| P100 배리어 피펫 팁 | Denville Scientific | P1125 | |
| P1000 배리어 피펫 팁 | Denville Scientific | P1121 | |
| P20 배리어 피펫 팁 | Denville Scientific | P1122 | |
| P200 배리어 피펫 팁 | Denville Scientific | P1122 | |
| 플라즈마 Asher | Quorum tech | K1050X RF | 이 플라즈마 에칭기/Asher/클리너는 Duke University의 Shared Materials Instrumentation Facility(SMiF)의 일부로 사용되었습니다. |
| 세포 여과기 스냅 캡이 있는 둥근 바닥 폴리스티렌 시험관 | Corning | 352235 | |
| 혈청학 피펫, 10mL, 개별 포장 | Corning | 356551 | |
| 혈청학 피펫, 25mL, 개별 포장 | Corning | 356525 | |
| 혈청학 피펫, 5mL, 개별 포장 | Corning | 356543 | |
| Steriflip, 0.22 µ m, PES | EMD Millipore | SCGP00525 | |
| 멸균 마이크로 원심분리기 튜브 | Thomas Scientific | 1138W14 | |
| T75cm2 벤트 캡이 있는 세포 배양 플라스크 | Corning | 430641U | |
| 조직 배양 처리된 12웰 플레이트 | Corning | 353043 | |
| 조직 배양 처리된 6웰 플레이트 | Corning | 353046 | |
| 진공 변조기 및 침투 펌프 (Zoe Culture Module) | 에뮬레이트 | ZOE-CM1 | 장기 칩 생물 반응기 |
| VE-Cadherin CD144 항 인간 항체 - APC conjugated | Miltenyi Biotec | 130-126-010 | |
| Wide-beveled cell lifter | Corning | 3008 | |
| MACS | |||
| CD144 MicroBeads, human | Miltenyi Biotec | 130-097-857 | |
| CD31 MicroBead Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-091-935 | |
| LS 컬럼 | Miltenyi Biotec | 130-042-401 |
참고문헌
- Wang, L., et al. A disease model of diabetic nephropathy in a glomerulus-on-a-chip microdevice. Lab on a Chip. 17 (10), 1749-1760 (2017).
- Musah, S., et al. Mature induced-pluripot....
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