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방법 논문

인간 유도 만능 줄기 세포로 설계된 Isogenic 신장 사구체 칩

3.2K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/63821

⸱

2022년 11월 4일

 , 
1Department of Biomedical Engineering, Pratt School of Engineering, Duke University, 2Department of Medicine, Division of Nephrology, Duke University School of Medicine, 3Department of Cell Biology, Duke University, 4Center for Biomolecular and Tissue Engineering, Duke University

이 논문에서

요약

여기에 제시된 것은 인간 유도 만능 줄기 세포에서 분화 된 유 전적으로 일치하는 상피 및 혈관 내피 세포를 통합하여 신장 사구체 여과 장벽의 구조와 기능을 요약하는 개인화 된 장기 온 칩 시스템을 설계하는 프로토콜입니다. 이 생체 공학 시스템은 신장 정밀 의학 및 관련 응용 분야를 발전시킬 수 있습니다.

초록

만성 신장 질환(CKD)은 미국 성인 인구의 15%에 영향을 미치지만 인간의 생물학적 반응과 신독성을 정확하게 예측할 수 있는 기능 모델이 부족하여 표적 치료법의 확립이 제한되었습니다. 신장 정밀 의학의 발전은 이러한 한계를 극복하는 데 도움이 될 수 있습니다. 그러나, 이전에 확립된 인간 신장 사구체의 시험관내 모델(혈액 여과를 위한 주요 부위이자 많은 질병 및 약물 독성의 주요 표적)은 일반적으로 제한된 기능적 특성과 타의 추종을 불허하는 유전적 배경을 가진 이질적인 세포 집단을 사용합니다. 이러한 특성은 환자 특정 질병 모델링 및 치료 발견에 대한 적용을 크게 제한합니다.

이 논문은 단일 환자의 인간 유도 만능 줄기 (iPS) 세포 유래 사구체 상피 (podocytes)와 혈관 내피를 통합하여 등성 및 혈관 화 된 미세 유체 신장 사구체 칩을 설계하는 프로토콜을 제시합니다. 결과 사구체 칩은 줄기 세포 유래 내피 및 상피 세포층으로 구성되어 계통 특이 적 마커를 발현하고 기저막 단백질을 생성하며 신장의 사구체 여과 장벽과 유사한 조직-조직 인터페이스를 형성합니다. 설계된 사구체 칩은 분자를 선택적으로 필터링하고 약물로 인한 신장 손상을 요약합니다. 이소제닉 세포 유형을 사용하여 신장 사구체의 구조와 기능을 재구성하는 능력은 환자 특이성으로 신장 질환을 모델링하고 신장 정밀 의학 및 관련 응용 분야를 위한 장기 온 칩의 유용성을 발전시킬 수 있는 기회를 제공합니다.

서론

Organ-on-a-chip 장치는 분자 및 기계적 자극과 혈관 형성을 사용하여 특정 장기의 구조와 기능을 모델링하는 조직-조직 인터페이스를 형성하는 동적 3D in vitro 모델입니다. 신장의 사구체 (사구체 칩)를 재현하는 것을 목표로하는 이전에 확립 된 organ-on-a-chip 장치는 동물 세포주 1 또는 이종 소스 2,3의 인간1 차 및 불멸화 된 세포주로 구성되었습니다. 유 전적으로 이질적인 세포 공급원의 사용은 환자 특이 적 반응 및 유전학 또는 질병 메커니즘에 대한 연구를 크게 제한하는 변이를 나타냅니다 4,5. 이 문제를 해결하는 것은 시험관 내 모델 2,3,6 엔지니어링을 위한 보다 정확한 미세 환경을 제공하기 위해 보존된 분자 및 유전적 프로필을 가진 특정 개체에서 유래하는 등종 세포주의 가용성에 달려 있습니다. 인간 기원의 이소겐 세포주는 이제 인간 iPS 세포 배양의 발전으로 인해 쉽게 생성될 수 있습니다. 인간 iPS 세포는 전형적으로 비침습적으로 공급되고, 무기한으로 자가 갱신될 수 있고, 거의 모든 세포 유형으로 분화하기 때문에, 이들은 사구체 칩 7,8과 같은 시험관내 모델의 확립을 위한 매력적인 세포 공급원 역할을 한다. 사구체 여과 장벽은 혈액 여과의 주요 부위입니다. 혈액은 먼저 사구체 기저막인 혈관 내피를 통해 여과되고 마지막으로 족세포라는 특수 상피를 통해 여과됩니다. 여과 장벽의 세 가지 구성 요소 모두 분자의 선택적 여과에 기여합니다. 여기에 제시된 것은 단일 인간 iPS 세포 공급원으로부터 혈관 내피 및 사구체 상피와 인터페이스되는 장기 온 칩 장치를 확립하는 프로토콜입니다. 이 프로토콜은 사구체 여과 장벽을 재현하기 위해 등종 및 혈관 화 칩을 설계하는 데 특히 유용하지만, 동종 성 '바디 온 칩'시스템과 같은 다른 유형의 개인화 된 장기 온 칩 및 다중 기관 플랫폼을 개발하기위한 청사진도 제공합니다.

본원에 기재된 프로토콜은 인간 iPS 세포를 2개의 별개의 혈통 - 측면 중배엽 및 중배엽 세포로 발산하는 것으로 시작하고, 이들은 연속적으로 각각 혈관 내피 및 사구체 상피로 분화된다. 측면 중배엽 세포를 생성하기 위해, 인간 iPS 세포를 기저막 매트릭스 1-코팅된 플레이트에 시딩하고, Wnt 활성제, CHIR 99021 및 강력한 중배엽 유도제인 뼈-형태형성 4(BMP4)가 보충된 N2B27 배지에서 3일(배지 교환 없이) 배양하였다. 생성된 측면 중배엽 세포는 이전에 근접(T), 혼합 쌍형 호메오박스(MIXL) 및 에오메소더민(EOMES)의 발현을 특징으로 했습니다.9. 이어서, 측면 중배엽 세포를 VEGF165 및 포스콜린이 보충된 배지에서 4일 동안 배양하여 자기 활성화 세포 분류(MACS)를 사용하여 VE-카데린 및/또는 PECAM-1 발현에 기초하여 분류된 혈관 내피 세포를 유도하였다. 생성된 혈관 내피 세포 (viEC)를 미세유체 장치에서 파종할 준비가 될 때까지 기저막 매트릭스 3-코팅된 플라스크 상에서 배양함으로써 확장시켰다.

중배엽 세포를 생성하기 위해, 인간 iPS 세포를 기저막 매트릭스 2-코팅된 플레이트에 시딩하고, 액티빈 A 및 CHIR99021을 함유하는 배지에서 2일 동안 배양하였다. 생성된 중배엽 세포는 이전에 기술된 바와 같이 HAND1, 구스코이드 및 상완골(T)의 발현을 특징으로 하였다 2,10,11. 중간 중배엽 (IM) 세포 분화를 유도하기 위해, 중배엽 세포를 BMP-7 및 CHIR99021이 보충된 배지에서 14일 동안 배양하였다. 생성된 IM 세포는 Wilm 종양 1 (WT1), 쌍을 이루는 상자 유전자 2 (PAX2) 및 홀수 건너뛴 관련 단백질 1 (OSR-1)2,10,11을 발현합니다.

2채널 폴리디메틸실록산(PDMS) 기반 미세유체 칩은 시험관 내에서 사구체 여과 장벽의 구조를 요약하도록 설계되었습니다. 비뇨기 채널은 1,000 μm x 1,000 μm (w x h)이고 모세관 채널 치수는 1,000 μm x 200 μm (w x h)입니다. 주기적 스트레칭 및 이완 주기는 유체 채널의 각 측면에 존재하는 중공 챔버에 의해 촉진되었습니다. 세포를 비뇨기 및 모세관 채널을 분리하는 유연한 PDMS 막(두께 50μm)에 시딩했습니다. 멤브레인에는 육각형 기공(직경 7μm, 간격 40μm)이 있어 세포 간 신호 전달을 촉진하는 데 도움이 됩니다(그림 1A)2,12. IM 유도가 완료되기 이틀 전에, 마이크로유체 칩을 기저막 매트릭스 2로 코팅하였다. viEC는 IM 유도가 완료되기 1일 전에 내피 유지 배지를 사용하여 미세유체 칩의 모세관 채널에 시딩하고, ECM 코팅된 PDMS 멤브레인의 기저부에서 세포 접착을 가능하게 하기 위해 칩을 거꾸로 뒤집었습니다. IM 유도가 완료된 날에, 세포를 BMP7, 액티빈 A, CHIR99021, VEGF165, 및 모든 트랜스레티노산이 보충된 배지를 사용하여 마이크로유체 칩의 비뇨기 채널 내로 시딩하여 칩 내 족세포 분화를 유도하였다. 다음날, 배지 저장소를 Podocyte 유도 배지 및 내피 유지 배지로 채우고 0.4Hz에서 10 % 기계적 변형 및 유체 흐름 (60μL / h)을 칩에 적용했습니다.

세포화된 미세유체 칩을 Podocyte 유도 배지(비뇨기 채널 내) 및 내피 유지 배지(혈관 채널 내)를 사용하여 추가로 5일 동안 배양하였다. 생성된 신장 사구체 칩을 족세포 및 내피 세포 모두에 대한 유지 배지에서 최대 7일 동안 추가로 배양하였다. 분화된 족세포는 포도신 및 네프린 13,14를 포함한 계통 특이적 단백질을 양성으로 발현한 반면, viEC는 혈통 식별 단백질 PECAM-1 및 VE-Cadherin을 양성으로 발현했으며, 이들 모두는 사구체 여과 장벽 15,16의 무결성을 유지하는 데 필수적인 분자입니다. . 족세포와 viEC는 모두 조직 성숙과 기능에도 중요한 가장 풍부한 사구체 기저막 단백질인 콜라겐 IV를 분비하는 것으로 밝혀졌습니다.

사구체 칩의 여과 장벽 (내피, 기저막 및 상피)의 3 성분 시스템은 분자를 선택적으로 필터링하고 화학 요법, 신 독성 약물 치료에 반응하는 것으로 밝혀졌습니다. 약물 치료 결과는 사구체 칩이 신 독성 연구 및 질병 모델링에 사용될 수 있음을 나타냅니다. 이 프로토콜은 등종 iPS 세포 유도체로부터 기능성 미세유체 신장 사구체 칩을 엔지니어링하기 위한 일반적인 지침을 제공합니다. 엔지니어링 칩의 다운스트림 분석은 연구원이 원하는 대로 수행할 수 있습니다. 사구체 칩을 사용하여 약물로 인한 사구체 손상을 모델링하는 방법에 대한 자세한 내용은 이전 간행물 2,12를 참조하십시오.

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프로토콜

1. 기저막 매트릭스 용액 및 코팅 기판 준비

  1. 기저막 매트릭스 1을 4°C에서 얼음 위에서 밤새 해동시킨다. 희석 비율에 대한 제조업체의 제안에 따른 분취량. 50mL 원뿔형 튜브와 피펫을 사용하여 완전히 해동되고 용해될 때까지 적절한 양의 기저막 매트릭스 1을 25mL의 차가운 DMEM/F12에 완전히 혼합합니다.
    1. 냉동 분취량을 용해하려면 200mL의 차가운 DMEM/F25에서 ~12μL를 취하여 냉동 분취량 튜브로 옮깁니다. 매트릭스가 완전히 해동되고 용해 될 때까지 위아래로 피펫하십시오. 기저막 매트릭스 1의 전체 튜브 내용물을 나머지 차가운 DMEM/F12로 옮깁니다.
  2. 기저막 매트릭스 1 용액 1mL를 6웰 플레이트의 각 웰에 피펫팅합니다. 코팅된 플레이트를 같은 날 사용하려면 37°C에서 2시간 동안 배양합니다.
    1. 대안적으로, 코팅된 플레이트를 파라필름으로 감싸고 4°C에서 최대 2주 동안 보관할 수 있다. 저장된 플레이트를 사용할 준비가 되면 37°C에서 30분 동안 배양합니다.
  3. 기저막 매트릭스 2를 멸균 증류수 9mL에 희석하여 최종 농도 5μg/mL를 달성합니다. 700 μL의 기저막 매트릭스 2 용액을 12-웰 플레이트의 각 웰에 피펫팅한다. 기저막 매트릭스 2-코팅된 플레이트를 파라필름으로 감싸고 4°C에서 최대 2주 동안 보관합니다.
  4. 동결 건조 된 기저막 매트릭스 3을 재구성하여 제조업체가 제안한대로 인산염 완충 식염수 (PBS, Ca+2- 및 Mg + 2-free)에서 1mg / mL의 최종 농도를 달성합니다. 250μL 분취량 1개를 PBS 9.75mL(Ca+2 및 Mg+2 없음)에 최종 농도 25μg/mL로 희석합니다. 이 용액 6mL를 사용하여 T75 플라스크 1개를 코팅합니다(최종 농도 2μg/cm2). 매트릭스 코팅 플라스크를 4°C에서 최대 1주일 동안 보관합니다.

2. 인간 iPS 세포 배양

알림: 이 프로토콜에 사용된 DU11 라인은 테스트를 거쳐 마이코플라스마 및 핵형 이상이 없는 것으로 밝혀졌습니다.

  1. 기저막 매트릭스 1-코팅된 플레이트를 37°C에서 1-2시간 동안 배양합니다.
  2. 6웰 플레이트의 각 웰을 따뜻한 (37°C) DMEM/F12 1mL로 3회 세척합니다. 2mL의 인간 iPS 세포 배양 배지(CCM)(보충 표 S1)를 6웰 플레이트의 각 웰에 추가합니다. 세포를 37°C에서 배양하는 동안 세포는 하기에 기재된 바와 같이 시딩을 위해 준비된다.
  3. 인간 iPS 세포가 들어 있는 6웰 플레이트의 각 웰을 따뜻한 DMEM/F12 1mL로 세척합니다.
  4. DMEM/F12를 흡입합니다. 1mL의 따뜻한 세포 분리 버퍼를 6웰 플레이트의 각 웰에 추가합니다. 37°C에서 1분 동안 배양합니다.
  5. 현미경으로 각 웰을 육안으로 검사하여 세포 콜로니 가장자리 주변의 해리를 확인합니다. 세포에서 세포 분리 완충액을 조심스럽게 흡인합니다. 따뜻한 DMEM/F12 1mL로 각 웰을 부드럽게 씻습니다.
  6. 현미경으로 플레이트를 검사하여 세포가 플레이트에서 완전히 분리되거나 실수로 흡인되지 않았는지 확인하십시오.
  7. 3mL의 따뜻한 인간 iPS CCM을 세포가 있는 6웰 플레이트의 각 웰에 추가합니다. 세포 리프터를 사용하여 식민지를 부드럽게 긁어냅니다. 5mL 혈청학적 피펫을 사용하여 각 웰의 세포 현탁액을 위아래로 한 번씩 부드럽게 혼합합니다.
  8. 인큐베이터에서 새로운 기저막 매트릭스 1 코팅 플레이트를 꺼냅니다. 0.5 mL의 세포 현탁액을 새로운 기저막 매트릭스 1-코팅된 플레이트의 각 웰로 옮깁니다. 플레이트를 8자 모양으로 움직여 세포를 고르게 분배합니다. 5%CO2 인큐베이터에서 37°C에서 인큐베이션한다.
  9. 사용한 배지를 흡인하고 세포가 70% 합류할 때까지(통과 후 약 4일) 배양 후 매일 3mL의 인간 iPS CCM으로 교체합니다.

3. 0-16일: 인간 iPSC를 중간 중배엽 세포로 분화

  1. 0-2일: 중배엽 유도
    1. 보관 후 평형을 이루기 위해 기저막 매트릭스 2-코팅된 플레이트를 4°C에서 실온으로 2시간 동안 이동합니다.
    2. 약 70% 컨플루언트 인간 iPS 세포를 포함하는 6-웰 플레이트의 각 웰로부터 사용된 배지를 흡인한다. 따뜻한 DMEM/F12 1mL로 세포를 3배 부드럽게 씻습니다.
    3. DMEM/F12를 흡입합니다. 인간 iPS 세포의 6웰 플레이트의 각 웰에 1mL의 세포 분리 완충액을 추가합니다. 37°C에서 5-7분 동안 배양합니다.
    4. 현미경으로 각 웰을 육안으로 검사하여 세포 콜로니 가장자리 주변의 해리를 확인합니다. 세포 리프터를 사용하여 식민지를 부드럽게 긁어냅니다.
    5. 6웰 플레이트의 모든 웰에서 세포 현탁액을 15mL 원뿔형 튜브로 옮기고 P1000을 사용하여 위아래로 여러 번 피펫팅하여 iPS 세포의 단일 세포 현탁액을 얻습니다.
    6. 원뿔형 튜브의 세포 현탁액을 DMEM/F12로 14mL까지 채웁니다. 실온에서 200 × g 에서 5 분 동안 원심 분리합니다.
    7. 상청액을 흡인하십시오. 14mL의 따뜻한 DMEM/F12에 세포 펠릿을 재현탁합니다. 실 온에서 200 ×g에서 5 분 동안 원심 분리를 반복하십시오.
    8. 상청액을 흡인하십시오. 세포를 1mL의 중배엽 유도 배지에 재현탁시킵니다(보충 표 S1). 혈구계를 사용하여 세포를 세십시오. 중배엽 유도 배지에서 희석하여 1 × 105 cells/mL의 최종 농도를 달성합니다.
    9. 기저막 매트릭스 2-코팅된 플레이트로부터 코팅을 흡인한다. 기저막 매트릭스 2-코팅된 플레이트의 각 웰을 따뜻한 DMEM/F12 2mL로 12회 헹굽니다.
    10. 세포 현탁액을 위아래로 2배 부드럽게 피펫팅합니다. 1 mL의 세포 현탁액을 기저막 매트릭스 2-코팅된 플레이트의 각 웰로 옮깁니다. 플레이트를 8자 모양으로 부드럽게 움직여 세포를 고르게 분배합니다.
    11. 플레이트를 37°C에서 밤새 인큐베이션한다. 다음날(1일차), 12-웰 플레이트의 각 웰로부터 사용된 배지를 흡인한다. 따뜻한 중배엽 유도 배지 1mL로 교체하십시오. 37°C에서 밤새 배양합니다.
  2. 2-16일: 중간 중배엽 유도
    1. 사용한 중배엽 유도 배지를 흡인합니다. 1m L의 따뜻한 중간 중배엽 유도 배지로 교체하십시오(보충 표 S1). 사용한 배지를 흡인하고 14일 동안 매일 따뜻한 중간 중배엽 유도 배지 1mL로 교체합니다.

4. 0-15일: 인간 iPSC의 혈관 내피 세포로의 분화 및 확장

  1. 0일차: 인간 iPS 세포 파종
    1. ROCK 억제제로 15mL의 인간 iPS CCM을 준비합니다(보충 표 S1). 37 °C에서 따뜻하게 유지하십시오.
    2. 하나의 기저막 매트릭스 1-코팅된 플레이트를 37°C에서 1-2시간 동안 인큐베이션합니다. 기저막 매트릭스 흡인 1. 따뜻한 DMEM/F12 1mL로 3회 세척합니다.
    3. DMEM/F12를 흡입합니다. ROCK 억제제가 있는 인간 iPS CCM 2mL를 6웰 플레이트의 각 웰에 추가합니다. 세포가 하기에 기재된 바와 같이 파종을 위해 준비되는 동안 플레이트를 37°C에서 인큐베이션한다.
    4. 약 70% 컨플루언트 인간 iPS 세포를 포함하는 6-웰 플레이트의 각 웰로부터 사용된 배지를 흡인한다. 따뜻한 DMEM/F12 1mL로 세포를 3배 부드럽게 씻습니다.
    5. DMEM/F12를 흡입합니다. 인간 iPS 세포의 6웰 플레이트의 각 웰에 1mL의 세포 분리 완충액을 추가합니다. 37°C에서 5-7분 동안 배양하여 세포를 단일 세포로 해리합니다.
      참고: iPS 세포주 간의 고유한 차이로 인해 사용자는 최적의 배양 시간을 결정하기 위해 5분 후에 세포를 육안으로 검사해야 합니다.
    6. 세포를 15mL 원추형 튜브로 옮깁니다. 분리 완충액을 중화하기 위해 따뜻한 DMEM/F12로 세포 현탁액을 최대 14mL까지 가져옵니다. 실온에서 200×g 에서 5분 동안 원심분리합니다.
    7. 상청액을 부드럽게 흡인하십시오. 세포를 ROCK 억제제를 사용하여 1mL의 인간 iPS CCM에 재현탁시킨다. 혈구계를 사용하여 총 세포 수를 세십시오.
    8. 37,000 - 47,000 cells/cm2 (6-웰 플레이트의 355,200 - 451,200 cells/well) 사이에 세포를 시드합니다. 37°C에서 밤새 배양합니다.
      참고: iPS 세포주 간의 고유한 차이로 인해 사용자는 최적의 파종 밀도를 결정해야 합니다.
  2. 1-3일: 외측 중배엽 유도
    1. 다음날(Day 1), 사용된 배지를 인간 iPS 세포의 6-웰 플레이트의 각 웰로부터 흡인한다. 6웰 플레이트의 각 웰을 5mL의 측면 중배엽 유도 배지로 교체합니다(보충 표 S1). 배양 용기(예: 플라스크)를 확장할 때 일반적으로 배양 용기의 작업 부피의 3배로 교체하십시오.
    2. 이 매체를 3 일 동안 변경하지 마십시오.
      알림: 우물의 측면 중배엽 유도 배지는 일반적으로 세포가 영양분을 사용함에 따라 빨간색에서 노란색으로 색이 바뀝니다. 그러나 흐린 배지 또는 박테리아가 번식하는 배지는 정상이 아니므로 오염을 제거하고 폐기해야합니다.
  3. 4-6일: 내피세포 유도
    1. 6-웰 플레이트의 각 웰에서 사용한 배지를 흡인합니다. 6웰 플레이트의 각 웰을 따뜻한 내피 유도 배지 3mL로 교체합니다(보충 표 S1). 플레이트를 37°C에서 밤새 인큐베이션한다.
    2. 다음 2일(5일 및 6일) 동안 모든 웰에서 사용한 배지를 50mL 원추형 튜브로 수집합니다. 원추형 튜브를 4 ° C에서 보관하십시오. 3mL의 따뜻한 내피 유도 배지로 세포를 보충합니다. 플레이트를 37°C에서 인큐베이션한다.
  4. 7일차: 내피세포(viEC) 분류
    1. 기저막 매트릭스 3 플라스크를 꺼내 실온에서 1 시간 동안 방치하십시오.
    2. 50mL의 MACS 완충액을 준비합니다(보충 표 S1).
    3. 세포 분리 완충액, MACS 완충액, 내피 CCM 및 PBS(Ca2 + 및 Mg2+ 없음)를 조직 배양 후드의 얼음 위에 놓습니다.
    4. 자석을 MACS 스탠드에 놓습니다. 원뿔형 튜브 홀더에 두 개의 50mL 원뿔형 튜브와 하나의 15mL 원뿔형 튜브를 놓습니다.
    5. MACS 스탠드(자석 부착)와 하나의 LS 컬럼을 조직 배양 후드에 놓습니다. 자석 아래의 MACS 스탠드에 원뿔형 튜브 홀더(내부에 원뿔형 튜브 포함)를 설치합니다(보충 그림 S1A).
    6. 6웰 플레이트의 각 웰에서 사용한 배지를 50mL 원뿔형 튜브로 4.3.2단계의 수집합니다. 6-웰 플레이트의 각 웰을 PBS(Ca2+ 및Mg2+ 프리)로 세척한다.
    7. PBS를 흡인합니다. 세포 분리 버퍼 1mL를 추가합니다. 세포를 완전히 해리시키기 위해 37°C에서 5-7분 동안 배양합니다.
    8. 세포를 50mL 원추형 튜브로 옮깁니다. 차가운 내피 CCM으로 세포 현탁액을 15mL로 가져옵니다. 실온에서 5 분 동안 200 ×g에서 원심 분리합니다.
    9. 상청액을 흡인하십시오. 1mL의 차가운 MACS 완충액에 세포를 재현탁합니다. 혈구계로 세포를 세십시오.
    10. 10mL의 MACS 완충액을 세포 현탁액에 추가합니다. 실 온에서 200 ×g에서 5 분 동안 원심 분리합니다.
    11. 상청액을 흡인하십시오. 세포를 1,000만 세포당 80μL의 MACS 완충액에 재현탁시킨다. FcR 차단 시약, CD31 마이크로비드 및 CD144 마이크로비드의 세포 1,000만 개당 20μL를 추가합니다. 얼음 위에서 15분 동안 배양합니다.
    12. 세포 현탁액이 인큐베이션되는 동안, 내피 유도로부터 수집된 배지를 200 × g 에서 10분 동안 원심분리한다(단계 4.3.2).
    13. 상청액을 500 mL 0.22 μm 진공 필터에 모은다. 내피 조절 배지를 준비합니다(보충 표 S1). 멸균 조건에서 배지를 여과하고 배지를 37°C에서 따뜻하게 유지합니다.
      참고: 내피 세포 증식 속도는 통과 3 후에 감소하기 시작합니다. 계대 3 이후의 기하급수적 성장을 달성하기 위해, 내피 컨디셔닝 및 유지 배지는 계대 1부터 시작하는 10 μM TGF-베타 억제제(SB431542)로 보충될 수 있다.
    14. 단계 4.4.11에서 15분 인큐베이션 후, 세포 현탁액에 1,000만 세포 당 10 mL의 MACS 완충액(최대 30 mL MACS 완충액)을 첨가한다. 200 ×g에서 5 분 동안 원 심 분리합니다.
    15. 상청액을 흡인하십시오. 1mL의 MACS 완충액에 재현탁합니다.
    16. LS 컬럼을 가져 와서 플런저를 주사기에서 빼냅니다. 플런저를 플라스틱 슬리브에 다시 넣습니다. 기둥을 자석 위에 놓습니다.
    17. 컬럼 아래에 첫 번째 50mL 원뿔형 튜브를 놓습니다. 컬럼에 1mL의 MACS 버퍼를 추가합니다. 아래에 있는 50mL 원뿔형 튜브에 모으십시오.
    18. 컬럼이 건조되는 것을 완전히 방지하지는 않지만 액체가 흐르도록 하십시오. 액체 방울이 천천히 흘러내리기 시작하면 세포 현탁액을 컬럼에 추가합니다. 동일한 50mL 원추형 튜브에 플로우스루를 수집합니다.
    19. 액체 방울이 천천히 흐르기 시작하면 다음 50mL 원뿔형 튜브를 컬럼 아래에 놓습니다. 초기 플로우스루(단계 4.4.18)를 열에 추가합니다. 아래에 있는 50mL 원뿔형 튜브에 모으십시오.
    20. 액체 방울이 천천히 흘러내리기 시작하면 500μL의 MACS 버퍼를 3x 추가하여 컬럼을 세척합니다.
    21. 자석에서 컬럼을 제거하십시오. 컬럼을 15mL 원뿔형 튜브에 놓습니다. 컬럼에 차가운 PBS 1mL를 추가합니다.
    22. 세포를 수집하려면 플라스틱 슬리브에서 플런저를 꺼내 컬럼에 단단히 밀어 넣으십시오.
    23. 혈구계를 사용하여 세포를 세십시오. 세포 현탁액을 PBS로 5mL로 가져옵니다. 200 × g에서 5 분 동안 원심 분리합니다.
    24. 세포가 원심분리되는 동안 기저막 매트릭스 3-코팅 플라스크를 5mL의 PBS로 3x 세척하여 세포 파종을 준비합니다. PBS를 흡인하고 20mL의 내피 조절 배지를 기저막 매트릭스 3-코팅 플라스크에 추가합니다.
    25. 원심분리기에서 세포를 제거하고 상청액을 흡인합니다. 세포를 내피 조절 배지에 재현탁시켜 26,000 cells/cm2 (1.95 × 106 cells/T75 플라스크)에 시딩합니다. 세포를 씨를 뿌린다.
    26. 분류 효율과 셀 수율을 계산하려면 4.4.23단계의 셀 수를 4.4.9단계의 셀 수로 나눕니다.
  5. 8-15일: viEC의 확장
    1. 다음날(8일차), 플라스크에서 사용한 배지를 흡인합니다. 10mL의 내피 조절 배지로 교체하십시오. 플라스크가 90% 합류할 때까지 또는 내피 컨디셔닝 배지 병이 완전히 사용될 때까지 내피 컨디셔닝 배지를 격일로 교체하십시오.
    2. 사용한 배지를 흡인하고 지속적인 확장을 위해 격일로 10mL의 내피 유지 배지(보충 표 S1)로 교체합니다.
    3. viEC를 통과시키려면 2개의 기저막 매트릭스 3-코팅된 T75 플라스크를 준비합니다. 플라스크를 실온에서 1 시간 동안 그대로 두십시오. 새로 준비한 플라스크를 PBS 5mL로 3x 철저히 씻으십시오.
    4. PBS를 흡인합니다. 새로 준비된 각 플라스크에 따뜻한 내피 유지 배지 10mL를 추가합니다. 세포가 하기에 기재된 바와 같이 파종을 위해 준비되는 동안 플레이트를 37°C에서 인큐베이션한다.
    5. 5mL의 세포 분리 버퍼를 viEC의 90% 컨플루언트 T75 플라스크에 추가합니다. 37°C에서 5-7분 동안 배양합니다. 세포를 15mL 원추형 튜브로 옮깁니다. 따뜻한 DMEM/F12 5mL를 추가합니다. 200 ×g에서 5 분 동안 원 심 분리합니다.
    6. 상청액을 흡인하십시오. 따뜻한 내피 유지 배지 1mL에 재현탁합니다. 500 μL의 세포 현탁액을 새로 준비된 T75 플라스크 각각에 첨가한다.
    7. 다음날, 소비 된 매체를 흡인하십시오. 10mL의 내피 유지 배지로 교체하십시오. 사용한 배지를 흡인하고 플라스크가 90% 합류할 때까지 격일로 10mL의 내피 유지 배지로 교체합니다.

5. 14일차: 세포 배양을 위한 미세유체 장기 칩 장치의 제조

  1. 플라즈마 처리 및 기저막 매트릭스 2 코팅
    1. 기저막 매트릭스 2 용액을 준비합니다 (단계 1.3). 따로 보관하십시오.
    2. 멸균 조직 배양 후드에서 멸균 100mm x 15mm 원형 페트리 접시의 포장을 풉니다. 페트리 접시 상단을 페트리 접시 바닥 아래에 아래쪽을 향하게 놓습니다(보충 그림 S1B).
    3. 핀셋을 사용하여 패키지에서 미세 유체 칩을 꺼내 페트리 접시 안에 넣으십시오. 접시 아래에서 뚜껑을 사용하여 페트리 접시를 닫습니다.
    4. 플라즈마 애셔에서 페트리 접시 뚜껑을 접시 아래에 놓고 상단이 아래를 향하도록 하여 하나의 단위로 함께 유지합니다. 페트리 접시 장치를 플라즈마 애셔 챔버에 놓습니다. 100W, 15SCCM, 30초의 산소로 플라즈마 애셔를 시작합니다.
    5. 시간에 민감한: 처리가 완료되면 플라즈마 애셔에서 페트리 접시 장치를 꺼냅니다. 실험실 물티슈에 뿌려진 70% 에탄올로 페트리 접시 뚜껑을 빠르고 가볍게 닦습니다. 페트리 접시를 뚜껑으로 덮으십시오.
    6. 페트리 접시를 멸균 조직 배양 후드로 가져옵니다. 25μL의 기저막 매트릭스 2 용액을 칩의 비뇨기 (상단) 채널에 부드럽게 첨가하십시오. 20μL의 기저막 매트릭스 2 용액을 칩의 모세관(바닥) 채널에 추가합니다.
    7. 멸균 15mL 원뿔형 튜브 캡 2개를 멸균 증류수(~500μL)로 채웁니다. 칩 채널과 멤브레인이 마르지 않도록 페트리 접시에 캡을 놓습니다. 접시에 뚜껑을 놓습니다. 37°C에서 밤새 배양합니다.

6. viECs 및 중간 중배엽 세포를 미세 유체 장치에 파종

  1. 15일차: viEC
    1. 90% 컨플루언트 viEC를 포함하는 T75 플라스크에서 배지를 흡입합니다. 5mL의 세포 분리 완충액을 추가하고 37°C에서 5-7분 동안 배양합니다.
    2. 세포를 15mL 원추형 튜브로 옮깁니다. 5mL의 DMEM/F12를 추가합니다. 200 ×g에서 5 분 동안 원 심 분리합니다.
      참고: 약 75%의 합류 viEC가 있는 각 T90 플라스크는 ~3백만 개의 셀을 생성합니다.
    3. 상청액을 흡인하십시오. 세포를 300μL의 내피 유지 배지에 재현탁하여 약 2백만 개의 세포/300μL를 얻습니다. 혈구계로 세포를 세십시오. 세포 현탁액을 따로 보관하십시오.
    4. 마이크로유체 칩을 함유하는 페트리 접시를 조직 배양 후드로 옮긴다. P200 배리어 팁을 흡인기 팁에 부착합니다.
    5. 미세유체 칩의 상단 및 하단 채널을 200μL의 DMEM/F12로 플러시하는 동시에 출구 주변을 흡입합니다.
    6. 흡인기에 부착된 P200 배리어 팁으로 칩을 하단 채널의 출구에서 멀리 단단히 잡습니다. 약 134,000개의 세포가 포함된 20μL의 viEC 현탁액을 칩의 모세관(바닥) 채널에 단단히 주입합니다. 콘센트 주변에서 매체를 조심스럽게 흡입하십시오.
    7. 현미경으로 기포 또는 고르지 않은 viEC 파종 밀도를 확인하십시오.
    8. viEC가 유연한 PDMS 멤브레인의 기저면에 부착될 수 있도록 칩을 부드럽게 뒤집어 뒤집습니다. 칩을 홀더 카트리지에 넣습니다. 멤브레인이 건조되지 않도록 3mL의 PBS를 칩 홀더 카트리지에 추가합니다. 칩을 37°C에서 3시간 동안 배양합니다.
    9. 현미경으로 하단 채널에서 유연한 PDMS 멤브레인에 부착된 viEC의 합류 층을 확인합니다. 바닥 채널의 입구에 200μL의 내피 유지 배지를 떨어뜨리고 모세관(바닥) 채널 출구의 주변에서 조심스럽게 흡인하면서 부착되지 않은 내피 세포의 채널을 세척하기 위해 채널을 통해 흐르도록 합니다.
    10. 칩을 홀더 카트리지에 다시 장착합니다. 37°C에서 밤새 배양합니다.
  2. 16일차: 중간 중배엽(IM) 세포
    1. 200μL의 내피 유지 배지로 모세관(하단) 채널을 부드럽게 세척하면서 출구 포트 주변을 조심스럽게 흡인합니다.
    2. 배출구 주변을 조심스럽게 흡인하면서 200μL의 DMEM/F12로 비뇨기(상단) 채널을 플러시합니다. ~50μL의 DMEM/F12를 입구 및 출구 포트에 떨어뜨립니다.
    3. 12웰 플레이트의 각 웰에서 중간 중배엽 유도 배지를 흡인합니다.
      참고: 분화가 끝난 각 웰은 약 150만 개의 IM 세포를 제공합니다.
    4. 12웰 플레이트의 각 웰에 1mL의 트립신-EDTA를 추가하고 37°C에서 5분 동안 배양합니다.
    5. 세포 리프터를 사용하여 세포를 부드럽게 긁어내고 P1000을 사용하여 세포를 해리하기 위해 위아래로 피펫팅합니다. 각 웰에 2mL의 트립신 중화 용액(보충 표 S1)을 추가합니다. 세포를 50mL 원추형 튜브로 옮깁니다. DMEM/F12를 사용하여 세포 현탁액 부피를 50mL로 가져오고 200× g 에서 5분 동안 원심분리합니다.
    6. 상청액을 흡인하십시오. 세포를 500μL의 중간 중배엽 유도 배지에 재현탁하여 약 300만 개의 세포/500μL를 얻습니다. 혈구계로 세포를 세십시오.
    7. 흡인기에 부착된 P200 배리어 팁으로 칩을 비뇨기(상단) 채널의 출구에서 멀리 떨어진 곳에 단단히 고정합니다. 약 112,500개의 IM 세포가 포함된 25μL의 세포 현탁액을 칩의 비뇨기(상단) 채널에 단단히 주입하고 출구 주변에서 배지를 조심스럽게 흡입합니다.
    8. 현미경으로 기포 또는 고르지 않은 IM 세포 파종 밀도를 확인하십시오. 3mL의 PBS를 칩 홀더 카트리지에 추가합니다. 37°C에서 3시간 동안 배양합니다.
    9. 두 채널을 각각의 세포 배양 배지 200μL로 플러시하는 동시에 칩 배출구 주변을 조심스럽게 흡인하여 사용한 배지와 세포 파편의 역류를 방지합니다.
    10. 빈 P200 장벽 팁을 비뇨기 및 모세관 채널의 양쪽 출구에 부착합니다. 피펫 200 μL의 내피 유지 배지를 모세관 채널 입구에 주입하고 그 중 절반을 주입합니다. 채널의 입구와 출구가 이제 매체로 채워진 피펫 팁에 부착되도록 입구 내부의 피펫 팁을 해제합니다.
    11. 200 μL의 IM 유지 배지를 피펫팅하고 비뇨기 채널 입구에 절반을 주입한다. 채널의 입구와 출구가 이제 매체로 채워진 피펫 팁에 부착되도록 입구 내부의 피펫 팁을 해제합니다. 칩을 37°C에서 밤새 매립된 팁으로 배양합니다.
  3. 칩을 오르간 칩 바이오리액터에 연결하여 유체 흐름과 기계적 변형을 적용합니다.
    1. 비뇨기 및 모세관 채널에서 P200 팁을 제거합니다. 건조를 방지하기 위해 비뇨기 및 모세관 채널의 입구와 출구에 각 매체의 물방울을 추가합니다.
    2. 3mL의 따뜻한 족세포 유도 배지(보충 표 S1)를 요로 입구 저장소에 추가합니다. 따뜻한 내피 유지 배지 3mL를 모세관 입구 저장소에 추가합니다.
    3. 300μL의 따뜻한 Podocyte 유도 배지를 출구 포트 바로 위의 비뇨기 채널 출구 저장소에 추가합니다. 300μL의 따뜻한 내피 유지 배지를 출구 포트 바로 위의 모세관 채널 출구 저장소에 추가합니다.
    4. 포드를 트레이와 오르간 칩 생물 반응기에 밀어 넣습니다.
    5. 오르간 칩 바이오리액터의 회전 다이얼 을 사용하여 프라임 사이클 (2분)을 선택하고 시작합니다. 포드 밑면에 4개의 유체 포트 모두에서 작은 물방울이 있는지 육안으로 검사합니다.
    6. Pod 밑면과 미세유체 칩 포트 사이에 유체-유체 접촉을 달성하려면 칩 캐리어를 Pod에 부드럽게 밀어 넣습니다. 칩 캐리어 탭을 안팎으로 부드럽게 누릅니다. 칩 표면에서 과도한 매체를 흡입합니다.
    7. 장기 칩 바이오리액터 유량을 60μL/h로 설정합니다. 순환 변형률을 0.4Hz에서 10%로 설정합니다. 오르간 칩 바이오리액터의 회전 다이얼 을 사용하여 조절 주기를 선택하고 2시간 동안 실행합니다.
    8. 출구 저장소에서 매체 수준의 증가를 육안으로 검사하십시오.
    9. 장기 칩 바이오리액터의 회전 다이얼 을 사용하여 조절 주기를 선택합니다.

7. 17-21일 이후: 족세포 유도 및 칩 유지

  1. 비뇨기 채널 출구 저장소에서 배지를 포트에서 대각선으로 멀리 떨어뜨리되 배양 중 매일 저장소에 일부 배지를 유지합니다. 비뇨기 채널 입구 저장소에 최대 3mL의 족세포 유도 배지를 2일마다 5일 동안 보충합니다.
    1. 5일 후 비뇨기에서 배지를 흡입하되 일부 배지는 저장소에 보관하십시오. 매일 3mL의 족세포 유지 배지로 비뇨기 통로 입구 저장소를 보충하십시오.
  2. 포트에서 대각선으로 떨어진 모세관 채널 출구 저장소에서 배지를 흡입하되 배양 중 매일 저장소에 일부 배지를 보관하십시오. 모세관 채널 입구 저장소에 매일 최대 3mL의 내피 유지 배지를 보충합니다.

8. 기능 분석 및 면역 형광 이미징

참고: 유세포 분석 분석, 칩 유출물에 대한 ELISA 및 mRNA 분리에 대한 자세한 내용은 보충 파일 1 을 참조하십시오.

  1. 이눌린과 알부민을 이용한 기능성 분석(분자여과)
    1. 포트에서 대각선으로 떨어진 모세관 채널 출구 저장소에서 매체를 흡입하되 일부 매체는 저장소에 보관하십시오. 이눌린과 알부민이 보충된 내피 유지 배지 3mL(보충 표 S1)로 6시간 동안 교체합니다.
    2. 5mL 혈청학적 피펫을 사용하여 비뇨기에서 배지의 부피(mL)를 측정하고 15mL 원추형 튜브로 옮깁니다. 빛으로부터 보호하고 형광단 접합 이눌린과 알부민의 광퇴색을 최소화하기 위해 튜브를 알루미늄 호일로 감싸십시오. 3mL의 Podocyte 유지 배지로 저장소를 보충합니다.
    3. Podocyte 유지 배지에서 이눌린의 저장 용액을 준비하십시오. 25 μg/mL 이눌린에서 시작하여 Podocyte 유지 배지에서 2x 연속 희석을 통해 8가지 이눌린 표준물질을 준비합니다.
    4. 유사하게, Podocyte 유지 배지에서 알부민의 스톡 용액을 준비한다. 150 μg/mL 알부민에서 시작하여 Podocyte 유지 배지에서 2x 연속 희석 을 통해 8가지 알부민 표준물질을 준비합니다.
    5. 각 표준 이눌린 농도의 중복 100 μL를 검은색 96웰 플레이트(또는 총 16웰의 이눌린)의 각 웰에 피펫팅합니다. 동일한 96-웰 플레이트(총 16웰의 알부민)의 각 웰에 각 표준 알부민 농도의 중복 100 μL를 피펫팅한다. 피펫을 100 μL 중복된 족세포 유지 배지(또는 2개의 총 웰의 족세포 유지 배지)로서 사용할 수 있도록 한다.
    6. 비뇨기에서 유출 된 배지 100 μL를 동일한 96 웰 플레이트의 각 웰로 피펫팅합니다. 모세관 채널에서 유출 된 배지 100 μL를 복제하여 피펫팅합니다.
    7. 플레이트를 플레이트 리더에 삽입하고 여기 550 nm 및 방출 615 nm에서 알부민에 대한 형광을 측정합니다. 여기 513 nm 및 방출 577 nm에서 이눌린에 대해 동일한 플레이트를 측정합니다.
    8. 생성된 데이터에서 중복 측정값(칩당)의 평균을 구합니다. 시트의 나머지 데이터에서 해당 플레이트 판독값에 해당하는 공백 값을 뺍니다.
    9. 알부민 표준물질에 해당하는 값을 플로팅하여 x축에 농도[μg/mL], y축에 형광이 있는 표준 곡선을 만듭니다. 이눌린 표준물질에 해당하는 값을 플로팅하여 x축에 농도[μg/mL], y축에 형광이 있는 표준 곡선을 만듭니다.
    10. 통계 분석 소프트웨어 패키지와 선형 보간을 사용하여 칩의 유출 매체에서 각각 이눌린과 알부민의 소변 농도를 측정합니다.
    11. 방정식 (1)2를 사용하여 칩에서 이눌린/알부민의 소변 청소율을 결정합니다.
      소변 청소율 = ([U] × UV) / [P] (1)
      여기서 [U]는 8.1.10단계의 소변 농도, UV는 8.1.2단계에서 수집된 요로 채널 유출물의 부피, [P]는 이눌린 또는 알부민(10μg/mL 이눌린 또는 100μg/mL 알부민)의 모세관 농도입니다.
  2. 면역형광 이미징
    1. 빈 P200 팁을 비뇨기 및 모세관 채널의 출구 포트에 삽입합니다. 세포를 고정하려면 4 % 포름 알데히드 200μL를 피펫팅하고 그 중 절반을 하단 채널 입구에 주입하십시오. 입구 내부의 피펫 팁을 풉니 다.
    2. 4 % 포름 알데히드 200 μL를 피펫팅하고 그 중 절반을 비뇨기 채널 입구에 주입합니다. 채널의 입구와 출구가 이제 정착액으로 채워진 피펫 팁에 부착되도록 입구 내부의 피펫 팁을 해제합니다.
    3. 칩을 실온에서 20분 동안 배양합니다.
    4. 20분 후 모든 피펫 팁을 버립니다. 깨끗하고 비어있는 P200 팁을 비뇨기 및 모세 혈관의 출구 포트에 삽입하십시오. 세포를 투과화하려면 0.125% Triton X-100/PBS 200μL를 피펫팅하고 절반을 모세관 채널 입구에 주입합니다. 입구 내부의 피펫 팁을 풉니 다.
    5. 0.125% 트리톤 X-100/PBS 200μL를 피펫팅하고 그 중 절반을 비뇨기 채널 입구에 주입합니다. 입구 내부의 피펫 팁을 풉니 다. 칩을 실온에서 5분 동안 배양합니다.
    6. 모든 피펫 팁을 폐기하십시오. 깨끗하고 비어있는 P200 팁을 비뇨기 및 모세 혈관의 출구 포트에 삽입하십시오. 세포를 차단하기 위해 0.125% Triton X-100/PBS에 1% 소 혈청 알부민(BSA) 200μL를 피펫팅하고 그 중 절반을 모세관 채널 입구에 주입합니다. 입구 내부의 피펫 팁을 풉니 다.
    7. 0.125% 트리톤 X-100/PBS에 1% BSA 200μL를 피펫팅하고 그 중 절반을 비뇨기 채널 입구에 주입합니다. 입구 내부의 피펫 팁을 풉니 다. 실온에서 30 분 동안 배양하십시오.
    8. 모든 피펫 팁을 폐기하십시오. 각 채널에 0.125% Triton X-100/PBS 200μL를 피펫팅하고 실온에서 5분 동안 배양하여 두 채널을 3배 세척합니다.
    9. 제조업체가 권장하는 0.125% Triton X-100/PBS로 희석하여 채널당 1차 항체 100μL를 준비합니다. 깨끗하고 비어있는 P200 팁을 비뇨기 및 모세 혈관의 출구 포트에 삽입하십시오. 1차 항체 100 μL를 피펫팅하고 각각의 채널에 절반을 주입한다. 입구 내부의 피펫 팁을 풉니 다.
    10. 실온에서 1시간 동안 배양하거나 더 나은 결과를 얻으려면 4°C에서 밤새 배양하십시오.
      참고: 여러 1차 항체를 한 번에 적용할 수 있습니다. 그러나 1 차 항체 용액은 제조업체의 지침에 따라 희석해야합니다.
    11. 3단계에 설명된 대로 채널을 10 x 8.2.8분 동안 세척합니다.
    12. 제조업체가 권장하는 희석 인자를 사용하여 채널당 100μL의 2차 항체를 0.125% Triton X-100/PBS로 준비합니다. 깨끗하고 비어있는 P200 팁을 비뇨기 및 모세 혈관의 출구 포트에 삽입하십시오. 2차 항체 100 μL를 피펫팅하고 각 채널에 절반을 주입한다. 입구 내부의 피펫 팁을 풉니 다. 실온에서 1 시간 동안 배양하십시오.
      참고: 각 2차 항체는 별도로 도포해야 합니다. 3단계에 따라 각 적용 사이에 최소 10 x 8.2.8분 동안 세척하십시오.
    13. 3단계에 설명된 대로 채널을 10 x 8.2.8분 동안 세척합니다.
    14. 200μL의 증류수로 두 채널을 한 번 세척하면서 칩 출구 포트 주변에서 잔류 유체를 흡입합니다.
    15. 깨끗하고 비어있는 P200을 비뇨기 및 모세 혈관 채널의 출구 포트에 주입하십시오. 세포를 대조염색하기 위해 200μL의 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI, 증류수에 1:1,000 희석)을 피펫팅하고 절반을 모세관 채널 입구에 주입합니다. 입구 내부의 피펫 팁을 해제하고 DAPI 200μL를 피펫팅하고 절반을 비뇨기 채널 입구에 주입합니다. 입구 내부의 피펫 팁을 풀고 실온에서 5분 동안 배양합니다.
    16. 모든 피펫 팁을 폐기하십시오. 깨끗하고 비어있는 P200 팁을 비뇨기 및 모세 혈관의 출구 포트에 삽입하십시오. 세포를 대조염색하기 위해 200μL의 팔로이딘(Ca 2+ 및 Mg2+가 없는 PBS에서 1:1,000 희석)을 피펫팅하고 그 중 절반을 모세관 채널 입구에 주입하고 입구 내부의 피펫 팁을 해제합니다. 200 μL의 팔로이딘(Ca 2+ 및 Mg2+ 없이 PBS에서 1:1,000 희석)을 피펫팅하고 그 중 절반을 비뇨기 채널 입구에 주입하고 입구 내부의 피펫 팁을 해제합니다. 실온에서 15 분 동안 배양하십시오.
    17. Ca3+ 및 Mg 2+ 없이 200μL의 PBS로 채널을 2배 플러시하고 출구 포트 주변에서 과도한 유체를 흡입합니다.
    18. 칩을 시각화합니다.

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결과

여기서 우리는 사구체의 기능적 3D 시험관 내 모델이 인간 iPS 세포의 등종 공급원으로부터 혈관화되고 상피화될 수 있음을 보여줍니다. 특히, 이 프로토콜은 인간 iPS 세포 기술, 특히 특수 세포 유형으로 분화하는 능력을 적용하여 환자 특정 수준에서 인간 신장의 구조와 기능을 모델링하기 위해 미세유체 장치와 통합될 수 있는 신장 사구체 상피(podocytes) 및 혈관 내피(viECs)를 생성하는 방법에 대한 지침을 제공합니다. 이 프로토콜 및 타임라인(그림 1A)의 개략적인 개요는 유사분열적으로 활성화된 인간 iPS 세포(그림 1B)를 배양한 다음 중배엽 및 측면 중배엽 세포 계통(그림 1C, D)으로 (병렬로) 분화하는 방법을 설명합니다. 생성된 중배엽 세포는 근접(T)을 발현하는 것으로 밝혀졌고, 측면 중배엽 세포는 ...

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토론

이 보고서에서는 동종 인간 iPS 세포주에서 혈관 내피 및 사구체 상피(족세포)를 유도하는 프로토콜과 이러한 세포를 사용하여 신장 사구체의 구조, 조직-조직 인터페이스 및 분자 여과 기능을 모방하는 3D 장기 온 칩 시스템을 설계하는 방법을 간략하게 설명합니다. 이 사구체 칩에는 내피와 사구체 상피가 장착되어 있어 함께 분자를 선택적으로 필터링하는 장벽을 제공합니다.

이 프로토콜을 적용하는 데 관심이있는 연구원은 다음과 같은 사항을 고려해야합니다 : 첫째, 사용되는 줄기 세포주의 고유 한 성장 특성에 따라 세포 파종에 최적화가 필요할 수 있습니다. 세포 파종 밀도는 인간 iPS 세포 증식 속도의 본질적인 차이로 인해 달라질 수 있습니다. 연구자들은 프로토콜에서 제안한 중배엽 파종 밀도로 시작한 다음 필요한 경우 조정하는 것이 좋습니다. 유사하게, 측면 중배엽 분화는 viEC 수율 및 50% 이상의 분류 효율을 달성하기 위해 필요에 따라 조정하기 전에 제안된 세포 파종 밀도로 시...

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공개 사항

S.M.은 인간 iPS 세포로부터의 족세포 분화와 관련된 특허의 발명가이다. 다른 저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 듀크 대학의 프랫 공과 대학, 듀크 의과 대학의 신장학과, 생물 의학 연구의 화이트 헤드 장학금 및 S. Musah의 Genentech 연구 상이 지원했습니다. Y. Roye는 듀크 대학교 의생명공학과에서 듀크 대학교-알프레드 P. 슬론 재단 장학금과 윌리엄 M. "몬티" 라이커트 대학원 펠로우십을 받고 있습니다. DU11 (Duke University 클론 #11) iPS 세포주는 Duke iPSC Core Facility에서 생성되었으며 Duke University의 Bursac Lab에서 제공했습니다. 저자는 기술 지원과 유용한 토론에 대해 N. Abutaleb, J. Holmes, R. Bhattacharya 및 Y. Zhou에게 감사드립니다. 저자는 또한 원고에 대한 유용한 의견을 주신 Musah Lab 회원들에게 감사드립니다. 저자는 Acuri C6 유세포분석기를 선물한 Segura Lab에 감사를 표합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Antibodies
Alexa Fluor 488- 및 Alexa Fluor 594 접합 2차 항체Thermo/Life TechnologiesA32744; A32754입니다. A-11076; A32790입니다. A21203입니다. A11015
콜라겐 IV열/생활 기술14-9871-82
네프린프로젠GP-N2
PECAM-1R& D SystemsAF806
PodocinAbcamab50339
VE-CadherinSanta Cruzsc-9989
Basement membrane matrices
Corning Fibronectin, HumanCorning356008Basement membrane (3)
iMatrix-511 Laminin-E8 (LM-E8) fragmentIwai North AmericaN8922012기저막 매트릭스 (2)
Matrigel hESC 인증 매트릭스, 5-mL 바이알BD Biosciences354277기저막 매트릭스 (1); 로트별 변동
Cells
DU11 human iPS cellsDU11 (Duke University clone #11) iPS 세포주는 Duke iPSC Core Facility에서 생성되었으며 Duke University의 Bursac Lab에서 제공했습니다. 이 라인은 테스트를 거쳐 마이코플라스마(2021년 11월 마지막 테스트) 및 핵형 이상(2019년 7월)이 없는 것으로 확인
Culture 배지 성장 인자 및 배지 보충제
0.5M EDTA, pH 8.0Invitrogen15575020
2-MercaptoethanolThermo/Life Technologies21985023
Albumin from bovine serum, Texas Red conjugateThermo/Life TechnologiesA23017
All-trans retinoic acid (500 mg)Stem Cell Technologies72262
B27 무혈청 보충제Thermo/Life Technologies17504044
B-27 보충제(50x) 비타민 A 없음Thermo/Life Technologies12587010
소 혈청 알부민Sigma-AldrichA9418
CHIR99021Stemgent04-0004로트별 변동을 보일 수 있음
CultureBoost-R세포 시스템4Z0-500-R포도세포 유지 관리 매체
DMEM/F12 Thermo/Life Technologies12634028
GlutaMAX 보충제가 포함된 DMEM/F12Thermo/Life Technologies10565042DMEM/F12와 글루타민
포스콜린(아데닐릴 시클라아제 활성제)Abcamab120058
GlutaMAX 보충제Thermo/Life Technologies35050061글루타민 보충제
열 비활성화 FBSThermo/Life Technologies10082147
헤파린 용액Stem Cell Technologies7980
Human Activin AThermo/Life TechnologiesPHC9544
인간 BMP4Preprotech120-05ET
인간 BMP7Thermo/Life TechnologiesPHC9544
Human VEGFThermo/Life TechnologiesPHC9394
Inulin-FITCSigma-AldrichF3272
mTeSR1 매체줄기 세포 기술05850인간 iPS 세포 배양 배지(CCM). 제조업체에 따라 5x 보충제를 추가하십시오. Human iPS CCM은 -20°C에서 최대 6개월 동안 보관할 수 있습니다.
N-2 Supplement (100x)Thermo/Life Technologies17502048
Neurobasal mediaThermo/Life Technologies21103049Lateral mesoderm basal media
PBS (Phosphate-buffered saline)Thermo/Life Technologies14190-250
Penicillin-streptomycin, liquid (100x)Thermo/Life Technologies15140-163
ROCK 억제제 (Y27632)Tocris1254
StemPro-34 SFMThermo/Life Technologies10639011내피 세포 배양 배지(CCM). 제조업체에 따라 보충제를 추가하십시오. 내피 CCM은 4°C; C 또는 -20 ° C는 최대 6개월 동안 사용할 수 있습니다.
TGF-베타 억제제 (SB431542)Stem Cell Technologies72234
Enzymes and other reagents
AccutaseThermo/Life TechnologiesA1110501Cell detachment buffer
Dimethyl Suloxide (DMSO)Sigma-AldrichD2438
Ethanol solution, 70% (vol/vol), biotechnology gradeVWR97065-058
파라포름알데히드(PFA)Thermo/Life Technologies28906
멸균 증류수Thermo/Life Technologies15230162
Triton X-100VWR97062-208
Equipment
Trypsin EDTA, 0.05%Thermo/Life Technologies25300-120
(Orb) 허브 모듈에뮬레이트ORB-HM1
100mm x 15mm 원형 페트리 접시FisherbrandFB087579B
120 x 120mm 정사각형 세포 배양 접시VWR688161
Accuri C6BD Biosciences
흡입 피펫, 개별 포장Corning29442-462
흡입 장치SP Bel-ArtF19917-0150
Avanti J-15R 원심분리기Beckman CoulterB99516
원추형 원심분리기 튜브, 15mLCorning352097
원추형 원심분리기 튜브, 50mLCorning352098
EVOS M7000Thermo/Life TechnologiesAMF7000형광 현미경을 사용하여 고정 및 염색된 이미지 촬영 셀.
혈구계VWR100503-092
Heracell VIOS 160i CO2 인큐베이터Thermo/Life Technologies51030403
AxioCam 503 카메라 장착 Inverted Zeiss Axio ObserverCarl Zeiss Micrscopy491916-0001-000(microscope) ; 426558-0000-000(camera)
Kimberly-Clark 니트릴 장갑VWR40101-346
Kimwipes, largeVWR21905-049
Leoca SP8 직립 컨포칼 현미경
미디어 저장소 (POD 휴대용 모듈)에뮬레이트POD-1
마이크로 플레이트 셰이커VWR12620-926
장기 칩에뮬레이트S-1 칩
장기 칩 홀더에뮬레이트AK-CCR
P10 정밀 배리어 피펫 팁Denville ScientificP1096-FR
P100 배리어 피펫 팁Denville ScientificP1125
P1000 배리어 피펫 팁Denville ScientificP1121
P20 배리어 피펫 팁Denville ScientificP1122
P200 배리어 피펫 팁Denville ScientificP1122
플라즈마 AsherQuorum techK1050X RF이 플라즈마 에칭기/Asher/클리너는 Duke University의 Shared Materials Instrumentation Facility(SMiF)의 일부로 사용되었습니다.
세포 여과기 스냅 캡이 있는 둥근 바닥 폴리스티렌 시험관Corning352235
혈청학 피펫, 10mL, 개별 포장Corning356551
혈청학 피펫, 25mL, 개별 포장Corning356525
혈청학 피펫, 5mL, 개별 포장Corning356543
Steriflip, 0.22 µ m, PESEMD MilliporeSCGP00525
멸균 마이크로 원심분리기 튜브Thomas Scientific1138W14
T75cm2 벤트 캡이 있는 세포 배양 플라스크Corning430641U
조직 배양 처리된 12웰 플레이트Corning353043
조직 배양 처리된 6웰 플레이트Corning353046
진공 변조기 및 침투 펌프 (Zoe Culture Module)에뮬레이트ZOE-CM1장기 칩 생물 반응기
VE-Cadherin CD144 항 인간 항체 - APC conjugatedMiltenyi Biotec130-126-010
Wide-beveled cell lifterCorning3008
MACS
CD144 MicroBeads, humanMiltenyi Biotec130-097-857
CD31 MicroBead Kit, humanMiltenyi Biotec130-091-935
LS 컬럼Miltenyi Biotec130-042-401
되었습니다는 가 포함된 완전한 배지 키트

참고문헌

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