방법 논문

자가면역뇌염과 관련된 새로운 병원성 항체를 검출하고 연구하기 위한 해마 신경 배양

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DOI:

10.3791/63829

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2022년 6월 2일

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1ICFO-Institut de Ciències Fotòniques, The Barcelona Institute of Science and Technology, 2Institut d'Investigacions Biomèdiques August Pi i Sunyer (IDIBAPS), Hospital Clínic, Universitat de Barcelona

이 논문에서

요약

자가 면역 뇌염은 중추 신경계의 항체 매개 질환의 새로운 범주입니다. 해마 뉴런은 이러한 항체를 발견하고 특성화하는 데 사용할 수 있습니다. 이 논문은 환자의 혈청 및 뇌척수액에서 자가항체를 결정하기 위한 일차 세포 배양 및 면역염색을 위한 프로토콜을 제공한다.

초록

지난 15 년 동안 중추 신경계 (CNS)의 항체 매개 질환의 새로운 범주가 특성화되어 현재 "자가 면역 뇌염"(AE)으로 정의됩니다. 현재 17 개의 알려진 AE 증후군이 있으며 모두 신경 세포 표면 또는 시냅스 단백질에 대한 항체와 관련이 있습니다. 임상 증후군은 복잡하며 관련 항체의 유형에 따라 다릅니다. 이러한 질병 중 가장 잘 알려진 것은 항 -N- 메틸 D- 아스 파르 테이트 수용체 (NMDAR) 뇌염으로, 심각한 기억 및 행동 장애와 관련된 두드러진 신경 정신병 장애입니다. 관련 항체는 N-말단 도메인에서 NMDAR의 GluN1 서브유닛과 반응합니다. AE 항체의 발견 및 특성화에 가장 빈번하게 사용되는 접근법은 해리 된, 태아, 설치류 해마 뉴런의 배양을 포함한다. 항체 특성화 과정에서 배양 물의 살아있는 뉴런은 환자의 혈청 또는 CSF에 노출되며 반응성의 검출은 환자의 혈청 또는 CSF 샘플이 뉴런 표면 항원에 대한 항체를 포함하고 있음을 나타냅니다. 해마 배양은 또한 환자의 항체가 뉴런의 구조적 또는 기능적 변화를 유발하는지 여부를 검사하여 잠재적으로 병원성인인지 여부를 결정하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 연구의 성공 수준은 배양의 품질과 환자 샘플의 반응성을 얻고 감지하는 데 사용되는 프로토콜에 따라 다릅니다. 이 논문은 환자의 혈청 또는 CSF에서 항체의 존재를 확인하기 위해 면역 염색과 결합 된 태아 쥐 해마 뉴런의 1 차 세포 배양에 최적화 된 프로토콜을 제공합니다. 배양된 뉴런 및 칼슘 이미징을 사용하여 NMDAR 항체의 잠재적인 병원성 효과를 검사하는 방법의 예도 제시됩니다.

서론

자가 면역 뇌염 (AE)은 최근에 발견 된 신경 표면 또는 시냅스 단백질 1,2를 표적으로하는 항체에 의해 매개되는 중추 신경계 (CNS) 질환의 범주입니다. 임상적 특징은 항체에 따라 다르지만 일반적으로 기억력 및 인지 장애, 행동 변화 및 정신과 증상, 비정상적인 움직임, 수면 장애, 의식 수준 감소 및 발작을 포함합니다. 이러한 장애는 모든 연령대의 개인에게 영향을 미칠 수 있으며 일부 유형의 AE는 주로 어린이와 젊은 성인에게 영향을 미칩니다2.

지난 15 년 동안 특정 신경 표면 / 시냅스 단백질에 대한 항체가있는 17 개의 AE 증후군이 설명되었습니다 (표 1). 뉴런 표적의 몇 가지 예는 시냅스 흥분성 수용체 NMDAR3,4 및 AMPAR5, 시냅스 억제 수용체 GABAbR6, 뉴런 분비 단백질 LGI17, 및 세포 부착 분자 IgLON58을 포함한다. 이러한 AE의 대부분에서 연구에 따르면 항체는 표적 항원의 구조나 기능을 방해하여 병원성 역할을 강력하게 지원합니다. 예를 들어, 항 -NMDAR 뇌염에서 항체는 NMDAR의 GluN1 서브 유닛의 N- 말단 도메인과 반응하여 이러한 수용체의 선택적이고 가역적 인 내재화를 생성하여 두드러진 신경 정신병 적 변화를 초래합니다 4,9,10,11. 따라서,환자의 혈청 또는 CSF에서 17 개의 알려진 항체 중 임의의 것을 확인하는 것은 특정 AE의 진단을 확립하는 진단 테스트로도 사용될 수 있습니다.

이들 항체의 확인 및 특성화에 더 빈번하게 사용되는 기술 중 하나는 해리 된, 태아, 설치류 해마 뉴런의 배양 물의 사용을 포함한다. 이들 배양은 여러 가지 이유로 유용하다: 배아 뇌는 해리하기 쉽고, 뉴런 배양에서 오염의 주요 원인인 낮은 수준의 신경교 세포를 함유한다12; 해마의 세포 집단은 CNS의 대부분의 다른 영역에 비해 상대적으로 균질하며 피라미드 세포가 대다수를 차지합니다13,14; 배양은 피라미드 뉴런의 생성이 완료되었지만 과립 세포가 아직 발달하지 않은 후기 단계의 배아에서 준비되어 배양의 균질성을 더욱 높입니다. 배양 될 때, 피라미드 뉴런은 대부분의 주요 표현형 특징을 발현하고, 잘 발달 된 수상 돌기를 형성 할 수 있으며, 구조적 및 전기 생리 학적 조사에 사용될 수있는 시냅스 적으로 연결된 네트워크를 확립 할 수있다12,13; 항체는 살아있는 뉴런을 관통 할 수 없기 때문에 살아있는 배양을 사용하면 세포 표면에있는 항원 표적을 식별 할 수 있습니다. 및 뉴런 배양물로부터의 항체-항원 복합체의 면역침전은 표적 항원의 동정을 허용한다5.

신경 세포 배양을 사용한 연구의 성공 여부는 배양의 품질과 환자의 혈청 또는 뇌척수액(CSF)의 면역 반응성을 평가하는 데 사용되는 프로토콜에 크게 좌우됩니다. 배양에 영향을 미칠 수 있는 변수에는 배양 발달 전에 해마의 분리 절차, 조직의 해리, 도금 밀도, 사용된 성장 표면 및 배지 13,15,16의 구성이 포함됩니다. 이 논문은 알려진 AE 항원 및 잠재적으로 새로운 표면 표적에 대한 항체의 존재를 확인하는 데 사용할 수 있는 형광 면역염색과 결합된 태아 쥐 해마 뉴런의 1차 세포 배양에 최적화된 프로토콜을 제공합니다. 또한 GCaMP 계열인 GCaMP5G에서 유전적으로 암호화된 칼슘 지표(GECI)를 발현하는 배양된 해마 뉴런을 사용하여 생세포 이미징 기술로 NMDAR 항체의 병원성 효과를 검사하는 방법의 예를 제공합니다.

표적 단백질단백질 기능셀 구획주 증후군
엔다르이온 샤넬시냅스 단백질항 NMDAR 뇌염
암파르이온 샤넬시냅스 단백질변연계 뇌염
글루K2이온 샤넬시냅스 단백질뇌염
가바 아르이온 샤넬시냅스 단백질뇌염
가바브르대사성 수용체시냅스 단백질변연계 뇌염
mGluR1대사성 수용체시냅스 단백질뇌염
mGluR2대사성 수용체시냅스 단백질뇌염
엠글루R5대사성 수용체시냅스 단백질뇌염
D2R대사성 수용체시냅스 단백질기저핵 뇌염
LGI1접착 분자세포 표면 단백질변연계 뇌염
카스프르2접착 분자세포 표면 단백질변연계 뇌염
이그론5접착 분자세포 표면 단백질항 -IgLON5 질병
뉴렉신-3α접착 분자세포 표면 단백질뇌염
DNER (Tr)막횡단 단백질세포 표면 단백질뇌염
시즈6L막횡단 단백질세포 표면 단백질뇌염
양서류구조 분자세포 표면 단백질변연계 뇌염
증권 시세 표시기펩티다아제세포 표면 단백질뇌염

표 1: 신경 세포 표면 및 시냅스 단백질에 대한 항체.

프로토콜

모든 절차는 실험 동물의 사용 및 관리에 관한 유럽 (2010 / 63 / UE) 규정에 따라 바르셀로나 대학의 지역 윤리위원회의 승인을 받았습니다. 환자로부터 서면 사전 동의를 얻었으며 연구는 인간 샘플 사용에 대한 지역 기관 검토 위원회의 승인을 받았습니다(Hospital Clínic, HCB/2018/0192).

참고: 현재 프로토콜에는 세 부분이 있습니다. 첫 번째는 뉴런 배양을 확립하기위한 것이고, 두 번째는 뉴런의 살아있는 배양을 사용하여 표면 항체를 검출하기위한 것이며, 세 번째는 이러한 항체의 병원성을 결정하는 것입니다.

PART 1 : 해리, 태아, 설치류 해마 신경 세포의 확립

1. 준비 단계

  1. 도금 표면의 폴리 -L- 라이신 코팅 (해부 3 일 전)
    1. 증류수 500mL에 붕산 2.38g과 붕사 1.27g을 첨가하고 용해될 때까지 15분 동안 교반하여 붕산염 완충액을 제조한다. 후드 아래에서 여과(0.2μm 공극 크기)하여 완충액을 멸균하고 라벨을 붙이고 실온(RT)에서 보관합니다.
      알림: 이 솔루션은 안정적이며 6개월 동안 사용할 수 있습니다.
      주의 : 붕산염 완충액을 준비 할 때 권장되는 개인 보호 장비를 착용하십시오.
    2. 증류수 10mL에 PLL 1g을 첨가하고 용해될 때까지 교반하여 폴리-L-라이신(PLL) 원액(100mg/mL)을 준비합니다. 500 μL 분취량의 PLL 원액을 준비합니다. 1mg/mL의 최종 농도에 도달하려면 붕산염 완충액 50mL에 PLL 분취액 500μL를 넣고 용해될 때까지 소용돌이치고 여과(0.2μm 공극 크기)하여 용액을 멸균합니다.
      알림: 이 솔루션은 안정적이며 6개월 동안 사용할 수 있습니다.
    3. 코팅 할 표면을 준비하십시오. 면역 염색 절차에는 직경 12mm의 커버슬립을 사용하고 살아있는 뉴런의 이미징을 포함하는 연구에는 유리 바닥 접시를 사용하십시오. 커버 슬립을 사용하는 경우 오토 클레이브 한 다음 각 접시 (직경 3.5cm)에 5 개의 커버 슬립을 놓습니다.
      알림: 커버슬립의 두께는 획득한 이미지의 신호 품질과 강도에 영향을 미칩니다. 대부분의 현미경 대물렌즈는 #1.5 커버슬립용으로 설계되었습니다. 이미징 설정 및 기술에 따라 적절한 커버슬립을 선택하십시오.
    4. 후드 아래에서 각 접시에 1.5mL의 PLL 용액을 추가합니다(유리 바닥 접시 또는 5개의 커버슬립이 있는 3.5cm 접시). 모든 커버 슬립이 물에 잠겨 RT에서 24시간 동안 보관되었는지 확인하십시오.
    5. 해부 2일 전에 PLL 용액을 흡입하고 멸균 내독소가 없는 물로 세척하여 커버슬립이 잠겼는지 확인합니다. 접시에 물을 보관하고 RT에서 24시간 동안 보관하십시오.
    6. 해부 1 일 전에 물을 흡입하고 NB + B27 배양 배지 (아래 참조)로 교체하고 접시를 37 ° C의 인큐베이터에 24 시간 동안 놓습니다.
  2. 배양액 및 저장액 준비(해부 1일 전)
    1. 둘베코의 변형 독수리 배지(DMEM): L-글루타민과 페놀 레드가 없는 DMEM 고혈당(4.5g/L) 500mL에 말 혈청 50mL, 소 태아 혈청(FBS) 50mL, L-글루타민(200mM) 10mL, 피루브산 나트륨(100mM), 페니실린-스트렙토마이신 10mL(10,000U/mL)를 추가합니다. 필터(0.2μm 공극 크기)하고 단단히 밀폐된 캡을 사용하여 4oC에서 5mL 분취량에 보관합니다.
      알림: 이 솔루션은 안정적이며 1개월 동안 사용할 수 있습니다.
    2. B27(NB + B27)이 보충된 신경기저(NB) 배지: 페놀 레드가 없는 NB 배지 50mL에 B27 보충제 1mL를 추가합니다.
    3. B27이 보충된 동면-E 배지(최대 절전 모드 + B27): 최대 절전 모드-E 배지 50mL에 B27 보충제 1mL를 추가합니다.
    4. 세포외 생리학적 용액(EPS): 멸균수 1L에 NaCl(140mM), KCl(3.5mM), hepes(10mM), 포도당(20mM) 및CaCl2 (2mM)와 같은 지정된 최종 농도로 다음을 추가합니다. 용해될 때까지 저어주고 NaOH(0.5M) 또는 HCl(0.5M)을 첨가하여 pH를 7.4로 조정합니다. 후드 아래에서 여과(0.2μm 공극 크기)하여 살균하고 4oC에서 보관하십시오.
  3. 장비 및 기타 실험실 자료 (해부 당일)
    1. 수조를 37°C로 설정합니다. 다음 분취량을 가열합니다: HBSS 50mL 및 DMEM 5mL.
    2. 무수 에탄올이 포함 된 비커 (그림 1B)에 담가 다음 도구를 소독하십시오 (그림 1B) : 집게, 곡선 집게, 가위, 미세 곡선 집게, 가는 직선 집게, 수술 가위, 미세 각도 집게 및 정밀 스프링 가위.
      알림: 도구를 보호하려면 부드러운 재료(예: 과학 정밀 물티슈)를 비커 바닥에 놓습니다.
    3. 두 개의 트레이에 얼음을 채우고 다음 항목을 놓습니다.
      1. 얼음 트레이 1(그림 1C): 무수 에탄올이 있는 비커에 수술 도구를 놓고, 수술 도구를 헹구기 위한 HBSS가 있는 비커, 배아를 배치하기 위해 HBSS가 있는 10cm 접시, 배아의 머리를 놓을 HBSS가 있는 6cm 접시, 배아의 뇌를 배치하기 위해 Hibernate + B27이 있는 6cm 접시를 놓습니다.
      2. 얼음 트레이 2: 트립신 2.5% 분취량 1mL와 해마를 위해 동면 + B27이 포함된 3.5cm 접시를 놓습니다.
        참고: 이 절차에 필요한 시간은 연구자의 경험과 해부할 배아의 수에 따라 다릅니다. 따라서 얼음은 필요한 시간 동안 얼어 붙은 상태를 유지해야합니다. 이 목적을 위해 폴리스티렌 트레이가 권장됩니다.

2. 해부 및 파종 (그림 1)

  1. 해마 격리
    참고 : E18에서 배아가있는 임신 한 쥐는 실험 동물의 사용 및 관리에 관한 유럽 (2010 / 63 / UE) 규정에 따라 바르셀로나 대학의 지역 윤리위원회에 따라 프로토콜이 시작되기 직전에 안락사됩니다. 이 프로토콜에서, 이산화탄소 (CO2) 흡입은 안락사의 방법으로 사용되었다.
    1. 집게와 가위를 사용하여 복부 복막 수준에서 쥐를 해부하십시오. E18 배아로 자궁을 추출하고 얼음에 식힌 10cm 접시에 넣습니다.
      참고: 쥐털이 배아에 부착되는 것을 피하는 것이 중요합니다. 복부를 멸균하기 위해 많은 양의 70 % 에탄올을 사용하는 것이 좋습니다. 이 단계부터 얼음 트레이 1의 후드 내부에서 작업하십시오.
    2. 배아 주머니를 열고 배아를 HBSS로 10cm 접시에 옮겨 배아가 완전히 잠겼는지 확인합니다.
    3. 가위로 배아 머리를 제거하고 HBSS가 든 6cm 접시에 넣습니다. 모든 배아에 대해이 과정을 반복하십시오.
      알림: 오염을 방지하려면 배아 머리를 제외한 모든 조직을 나사 캡이 있는 용기에 버려야 합니다.
    4. 미세한 곡선의 집게로 배아 머리를 잡고 한 쌍의 가느다란 직선 집게로 궤도를 뚫고 45° 각도로 들어간 다음 미세하게 구부러진 집게를 놓습니다.
      알림: 집게는 뇌를 통과해서는 안되므로 들어갈 때 각도를 유지하는 것이 중요합니다.
    5. 후두골에서 정면 뼈까지 수술 가위로 피부와 두개골을 해부하십시오. 한 쌍의 미세한 곡선 집게로 뇌를 제거하고 최대 절전 모드 + B6으로 27cm 접시에 넣으십시오. 모든 뇌가 회복 될 때까지이 과정을 반복하십시오.
    6. 가느다란 직선 집게로 종뇌를 시집적으로 분리합니다.
      참고: 이 단계부터 해마의 해부는 실체 현미경으로 수행됩니다. 빛이 측면에서 해부 표면을 비추도록 관절 식 램프를 사용하는 것이 좋습니다. 또한 더 많은 대비를 제공하여 해마를 더 잘 구별할 수 있도록 검은색 배경을 사용하는 것이 좋습니다.
    7. 최대 절전 모드 + B27을 1cm 거리 (예 : 원 안)에 떨어 뜨려 10cm 접시를 준비하십시오. 최대 절전 모드 + B27 한 방울당 하나의 종뇌를 놓고 해부 범위를 통해 시각화합니다(1.25x 대물렌즈 배율 권장).
    8. 조심스럽게 수막을 껍질을 벗기고 시상을 제거하여 해마를 더 잘 시각화하십시오.
    9. 정밀 스프링 가위로 해마를 해부하고 얼음 트레이 3.5의 Hibernate + B27로 2cm 접시에 넣습니다. 모든 해마가 수집 될 때까지 모든 종뇌에 대해 반복하십시오.
    10. 파스퇴르 피펫으로 모든 해마를 조심스럽게 모아 50mL 튜브로 옮깁니다.
      알림: 트립신을 희석하지 않도록 해마를 수집 할 때 Hibernate + B27의 최소 부피를 취하십시오.
  2. 세포 해리
    1. 해마의 효소 해리
      1. 해마가 들어있는 50mL 튜브에 2.5 % 트립신 1mL를 넣고 HBSS로 5mL 부피로 가져옵니다. 37°C의 수조에서 15분 동안 배양한다.
      2. 트립신을 희석하려면 예열된 HBSS 10mL를 넣고 37°C의 수조에서 5분 동안 배양합니다.
      3. 이제 점액 덩어리로 나타나는 해마를 1,000μL 마이크로피펫이 있는 50mL 튜브에 옮기고 예열된 HBSS 6mL를 추가한 다음 37°C의 수조에서 5분 동안 배양합니다.
    2. 해마의 기계적 해리
      1. 최소 부피를 취하여 원추형 바닥이있는 2mL 튜브로 질량을 옮깁니다. 예열된 DMEM 배지 1mL를 추가합니다. 1,000 μL 마이크로피펫으로 펠릿을 위아래로 부드럽게 흡인하여 균질화합니다.
        알림: 기포가 세포를 용해시킬 수 있으므로 흡인할 때 기포가 발생하지 않도록 하는 것이 중요합니다.
      2. 팁이 튜브의 원추형 바닥과 접촉하도록 미리 당겨진 유리 피펫 (10x-20x)으로 위아래 흡인을 반복하십시오. 거품이 발생하지 않도록하십시오. 이 단계가 끝나면 혼합물은 반투명해야합니다.
      3. 혼합물이 반투명하도록 균질하게 혼합되면 혼합물을 37°C에서 4mL의 DMEM 배지가 포함된 튜브로 옮기고 위아래로 피펫팅하여 유리 피펫으로 균질화합니다.
  3. 세포 파종
    1. 세포를 세십시오. 용액의 뉴런 수는 표준 실험실 절차에 따라 계산할 수 있습니다.
      참고: 항체 검출 및 칼슘 활성에 대한 이미징 실험에서는 3.5cm 접시당 50,000개 세포의 농도가 최적입니다.
    2. 세포를 현탁시킨 상태로 유지하고, 계산된 부피를 회수하고, PLL 코팅 커버슬립이 포함된 3.5cm 접시 또는 PLL 코팅 유리 바닥 접시에 접시에 담습니다.
    3. 교차 운동 (앞뒤로, 좌우로, 필요에 따라 반복)으로 부드럽게 흔들어 접시에 세포를 골고루 분배하고 접시를 CO2 (5 %) 인큐베이터에 놓습니다.
      알림: 세포가 접시 주변에 정착하는 것을 피하기 위해 교차 움직임을 사용하는 것이 중요합니다.
    4. 매주 약 1mL의 NB + B27을 첨가하여 배양 물이 건조되지 않도록하십시오.
      참고 : 2 주 (14 일 시험관 내 [div]) 후, 뉴런은 성숙하고 실험에 사용될 모든 인자를 발현합니다. 이 프로토콜을 사용하여 수득된 뉴런의 총 평균 수는 임신한 래트 당 평균 12개의 E18 배아로부터 오는 대략 2.5 x 106 개의 뉴런이다.


   
PART 2: 뉴런 세포 표면 단백질에서 항체 검출을 위한 해마 뉴런 배양 사용

참고: 프로토콜의 이 부분은 해마 배양을 사용하여 항-NMDAR 뇌염 환자의 혈청 및/또는 CSF에서 항-NMDAR 항체를 식별하는 방법을 보여줍니다. 형광 면역 염색은 살아있는 뉴런의 반응성을 시각화하는 데 사용되지만 다른 시각화 방법도 사용할 수 있습니다. 이 실험에 적합한 대조군은 건강한 개인의 혈청 또는 CSF입니다. 인체 샘플을 사용할 때는 기관 윤리위원회의 승인이 필요할 수 있음을 명심하십시오.

3. 살아있는 형광 면역 염색

  1. 커버 슬립에서 성장한 14 div 셀을 사용하십시오 (5 개의 커버 슬립이 포함 된 3.5cm 접시 당 50,000 개의 셀).
  2. 후드 내부에서 37°C로 예열된 NB로 커버슬립을 헹굽니다.
  3. 이 경우 혈청의 경우 1:200 또는 CSF의 경우 1:2로 NB 배지에 희석된 항-NMDAR 항체(1차 항체로 사용됨)가 포함된 샘플을 추가하고 37°C(CO2 (5%) 인큐베이터 내부)에서 1시간 배양합니다.
  4. RT에서 PBS 3x로 조심스럽게 헹굽니다.
  5. 고정 용액 (PBS 중 4 % 포름 알데히드)을 추가하고 RT에서 5 분 동안 배양합니다.
    주의 : 4 % 포름 알데히드를 취급 할 때는 후드 내부에서 작업하고 권장 개인 보호 장비를 착용하십시오.
  6. PBS로 각각 3 분 동안 5 번 씻으십시오.
  7. 2차 항체 염소 항-인간 AF488을 1:1000 희석액에 추가하고 RT에서 1시간 동안 배양합니다.
    알림: 배양하는 동안 알루미늄 호일로 덮어 빛 노출로부터 보호하십시오.
  8. PBS로 각각 3 분 동안 5 번 씻으십시오. 증류수로 헹굽니다.
  9. 액체 장착 매체(예: DAPI가 있는 페이딩 방지 장착 매체, 약 7μL)로 커버슬립을 장착하고 남아 있는 액체를 흡입한 다음 증류수로 헹굽니다. 이제 뉴런이 형광 이미징을 할 준비가 되었습니다.
    주의 : 장착 매체를 취급 할 때는 권장 개인 보호 장비를 착용하십시오.


   

PART 3: 칼슘 이미징을 이용한 항체 병원성 효과 입증

참고: 프로토콜의 이 부분은 환자의 항체가 배양에 기능적 영향을 미치는지 확인하는 방법을 보여 주며, 이는 병원성을 시사합니다. 효과의 중요성을 높이기 위해 8 명의 환자로부터의 CSF 풀이 사용되었습니다. 살아있는 배양물의 칼슘 활성은 GECI 형광 칼슘 지시약(GCaMP5G)을 사용하여 화학적 자극(NMDA + 글리신)시 기록하였다. 이러한 연구에는 뉴런의 필요한 생리적 조건을 유지할 수 있는 세포 챔버가 있는 도립 형광 현미경이 필요합니다.

4. 칼슘 영상

  1. 커버 슬립에서 성장한 14-18 div 셀을 사용하십시오 (5 개의 커버 슬립이있는 3.5cm 접시 당 50,000 개의 셀).
  2. 이미징 1주일 전에 바이러스 벡터 pAAV2-CAG-GCaMP5G를 2.5 x 1010 GC/mL로 세포에 추가하고 5-7일 동안 배양합니다.
    참고: 이 상업적으로 이용 가능한 사전 포장된 AAV 혈청형 2 벡터는 CAG 프로모터 하에 유전적으로 암호화된 칼슘 지표 GCaMP5G를 과발현합니다.
  3. 이미징 1일 전에 환자 샘플(이 예에서는 NB + B27에서 1:25로 희석된 CSF 풀)을 추가하고 24시간 동안 배양합니다. 오염을 방지하기 위해 사용하기 전에 항상 사람 샘플(0.2μm 공극 크기)을 여과하십시오.
    참고: 이러한 연구의 경우 건강한 피험자의 CSF 조절을 병행하여 실행해야 합니다.
  4. 이미징 당일에, 이미징 설정을 준비하고 현미경 셀 챔버를 37°C로 설정하고, 레인을 증류수로 채우고, 5%CO2 를 주입하여 세포 생리학적 조건을 유지한다.
  5. 후드에서 37°C로 예열된 EPS 3mL로 3단계의 세포를 세척합니다.
  6. 세포를 2.45mL의 EPS로 덮고 현미경 세포 챔버로 옮깁니다. NBQX (10 μM)를 추가하여 AMPA 및 KA 수용체를 차단하여 NMDA 수용체 반응을 독점적으로 시각화합니다.
  7. 수은 램프와 FITC 필터 큐브가 장착된 도립 형광 현미경에서 100ms마다 프레임이 기록된 2분 분량의 동영상을 획득합니다(자연 활동).
    참고: 20x NA 0.75 공기 대물렌즈가 사용되었으며 sCMOS 카메라로 100ms마다 이미지(512 x 512픽셀, 16비트 회색조)를 촬영했습니다.
  8. 100ms마다 녹화된 프레임으로 4분 분량의 두 번째 동영상을 가져옵니다. 획득을 시작한 직후 자극 용액 (NMDA [100 μM] + 글리신 [1 μM])을 접시에 첨가하십시오.
    알림: 접시에 미디어를 추가하면 이미징 조건(초점, 형광 강도 및/또는 불특정 배경 신호)을 방해할 수 있는 난기류가 생성됩니다. 이러한 변경 가능성을 줄이기 위해 채워진 50mL 접시에 2.5μL 이상의 용액을 추가하지 마십시오.
  9. 이미지 프로세싱 소프트웨어(여기에 사용된 ImageJ)를 사용하여, 자극시 수득된 시간 경과에 따른 형광 신호를 환자와 함께 배양하고 대조군 CSF 샘플로부터 추출한다.
    참고: GCaMP 프로브는 유리 칼슘 이온에 결합할 때 구조적 변화를 겪어 더 밝아집니다. 따라서 형광 강도의 증가는 신경 탈분극으로 인한 칼슘 유입과 관련이 있습니다.
  10. 분석할 관심 영역(ROI)을 결정합니다. 뉴런의 소마를 수동으로 분할하고 ROI를 ROI 관리자에 추가합니다(분석 > 도구 > ROI 관리자 > 추가). ROI 관리자 메뉴에서 ROI를 저장합니다(추가 > 저장).
  11. 측정값을 설정하고(분석 > 측정값 설정) 평균 회색 값을 선택합니다. 추가 > 다중 측정을 클릭하여 세포 소마스에서 평균 형광 강도 프로파일을 추출한 다음 생성된 테이블을 .xls 스프레드시트로 저장합니다.
  12. 통계 분석을 수행하여 그룹 간의 형광을 비교합니다(환자의 CSF 대 대조군의 CSF).

결과

해리, 태아, 설치류 해마 신경 세포의 확립
여기에 제시된 프로토콜은 Banker와 Goslin15가 수행 한 신경 세포 배양에 대한 영향력있는 연구를 기반으로합니다. 이 프로토콜은 신경 표면 항체 검출 연구를 수행하기 위한 최적의 형태, 밀도 및 순도를 가진 신경 세포 배양을 얻도록 개선되었습니다. 해부 및 파종 프로토콜은 세 부분으로 나뉩니다 (그림 1A). 첫 번째 부분 인 해마 분리는 생체 조직의 외과 적 추출로 구성됩니다 (그림 1A, 왼쪽 패널). 그림에서 알 수 있듯이 E18 배아를 가진 임신 한 Wistar 쥐는 성공적인 배양을위한 핵심 출발 물질입니다. E18 배아에서 뇌를 추출하면 실체 현미경으로 미세 수술을 수행합니다. 적절한 도구 (그림 1B)와 정밀한 취급으로 해마를 나머지 신경 조직과 분리 할 수 있습니다. 특정 배지에서 조직의 배치는 도 1C에 도시되어 있다. 프로토콜의 두 번째 부분은 해마 세포 해리로 구성됩니다. 그것은 두 단계로 세분됩니다 (그림 1A, 중간 패널) : 해마의 효소 해리와 기계적 해리는 손상되지 않은 해리 된 단일 세포를 초래합니다. 이 방법론을 사용하여, 도 2A-D에 나타내는, 세포 응집체 없이 세포 배양물을 수득할 수 있다. 프로토콜의 세 번째 부분은 셀 시드로 구성됩니다(그림 1A, 오른쪽 패널). 프로토콜의 이 부분은 플레이트에서 뉴런 배양의 밀도와 균질성을 조정하는 데 중요합니다. 세포를 계수하고 3.5cm 접시 영역에 50,000개의 뉴런을 파종하면 신경 세포 표면 단백질에 대한 항체의 존재를 확인하는 실험(그림 3)뿐만 아니라 칼슘 이미징으로 이러한 항체의 병원성을 분석할 수 있는 최적의 밀도를 제공합니다(그림 4).

figure-results-1
그림 1: 해마 뉴런의 1차 배양을 위한 시각적 프로토콜. (A) E18에서 배아 래트로부터 해마 뉴런의 해리 세포 배양을 준비하기 위한 프로토콜의 세 부분을 보여주는 흐름도. 프로토콜은 1로 나뉩니다. 해마 격리, 2. 세포 해리, 및 3. 세포 파종. (B) 해마 분리를위한 권장 도구 선택은 배아 수집을위한 (1- 집게, 2- 곡선 집게, 3- 가위), 뇌 추출을위한 (4- 미세 곡선 집게, 5- 미세 직선 집게, 6- 수술 가위) 및 해마 분리를위한 (7- 미세 각도 집게, 8- 정밀 스프링 가위). (C) 해마 분리에 필요한 플레이트와 매체가있는 얼음 트레이 1의 개략적 표현. 배아와 머리는 HBSS에 배치되는 반면 뇌는 동면 배지 + B27에 배치됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

18div에서 해마 뉴런의 배양은 성숙하고 상호 연결되어 있으며 구조적 및 기능적 단백질을 발현합니다.
신경 세포의 성장과 성숙에서 뉴런의 분극 단계 (그림 2A, B)와 시냅스 네트워크의 수지상 발달 및 구성 단계 (그림 2C, D)의 두 가지 분화 단계를 알 수 있습니다. 1div의 세포는 고르게 분포되어 플레이트에 부착되어 작은 신경돌기가 확장되기 시작하는 세포체 주위에 라멜라가 발생합니다(그림 2A). 배양에서 며칠이 지나면 신경 돌기가 짧은 거리로 확장됩니다. 세포는 상당한 분극을 나타내지만 순 성장은 거의 없습니다(그림 2B). 이 단계가 끝나면 시냅스 생성이 두드러지고 뉴런이 상호 연결되기 시작합니다. 뉴런 네트워크는 계속 성장하고 더 복잡해집니다(그림 2C). 18div에서 뉴런은 성숙하고 상호 연결됩니다. 뉴런 네트워크가 구축됩니다 (그림 2D). 시냅스 가시가 형성되고 연결되면 뉴런은 완전히 분극화되어 모든 기능적 및 구조적 단백질을 발현합니다. 성숙한 배양 뉴런에 의해 발현되는 많은 단백질 중에서 신경 수용체 NMDA (그림 2E)와 시냅스 단백질 PSD95 (그림 2F)가 여기에서 대표적인 마커로 선택되었습니다. 또한 신경섬유(NF)를 표지하고(그림 2G) MAP2 단백질을 표적으로 하여 수상돌기를 시각화하여(그림 2H) 축삭을 선택적으로 시각화할 수 있습니다.figure-results-2
그림 2 : 해마 뉴런의 해리 된 세포 배양의 성숙 시간 과정. (A-D) 배양 첫 18일 동안의 해마 뉴런의 위상차 이미지. (A) PLL-코팅된 기판에 부착될 때 1div의 뉴런. (B) 5 div에서 뉴런에서 작은 신경 돌기의 출현. (C) 11 div의 뉴런은 축삭 특성을 신장시키고 획득하는 긴 신경 돌기를 개발했습니다. (D) 18div의 뉴런은 성숙하여 신경망을 형성했습니다. 스케일 바 (A-D) = 40 μm. (E-H) 18 div에서 성숙한 뉴런을 보여주기 위해 선택적 마커를 사용하여 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경으로 촬영한 대표적인 형광 이미지. 뉴런 배양물을 고정하고 (E) 뉴런 수용체 (NMDAR), (F) 시냅스 마커 (PSD95), (G) 축삭 마커 (뉴로필라멘트, NF) 및 (H) 수지상 마커 (MAP2)를 선택적으로 염색하는 항체로 면역염색하였다. 스케일 바 (E-H) = 20 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

환자 샘플의 항체는 신경 세포 표면 항원과 반응합니다.
항 NMDAR 뇌염 환자로부터 얻은 샘플 (혈청 및 CSF)에는 뉴런 표면에 존재하는 NMDAR를 인식하는자가 항체가 포함되어 있습니다. 환자 샘플과 함께 배양물을 배양하면 세포 표면과 수상 돌기에 강렬한 형광 신호가 생성됩니다 (그림 3A, C). 대조적으로, 대조군 샘플은 신경 세포 배양에 투여될 때 형광 신호를 생성하지 않습니다(그림 3 B, D). 이러한 발견은 배양이 항체에 대한 환자 샘플을 스크리닝하는 데 어떻게 사용될 수 있는지 보여주고 신경 세포 표면을 표적으로 하는 새로운 항체의 식별로 이어질 수 있습니다.

환자의 CSF 샘플은 해마 뉴런의 NMDA 유도 배양에서 세포 내 칼슘 농도를 감소시킵니다.
신경 활동에 대한 환자의 항체의 효과를 평가하기 위해(24시간 치료 후), NMDA 매개 자극에 따라 배양된 뉴런으로부터 세포 내 칼슘 과도 현상을 실시간으로 모니터링했습니다. NMDA의 적용은 세포 내 녹색 형광의 변화로 표시된 바와 같이 형광 강도의 증가를 생성합니다(그림 4A 및 보충 비디오 1). 대조군 CSF 샘플로 처리된 뉴런은 환자 CSF 샘플로 처리된 세포와 비교하여 자극기를 적용했을 때 형광 강도(56%)에서 더 높은 차이를 보였다. 형광 강도의 차이를 측정하고 세포의 소마에서 추출한 데이터로부터 NMDA 매개 자극 곡선을 비교했습니다(그림 4B,C). 자극 곡선은 두 시나리오 모두에서 칼슘의 세포 내 유입이 있음을 보여 주지만 환자의 CSF (회색 선)로 처리 한 배양 물은 대조군 처리 배양 (검은 색 선)보다 낮은 반응을 보였다. 이러한 결과는 환자의 CSF에 존재하는 항체가 항체와 NMDAR의 상호 작용으로 인해 세포 활성을 감소시켜 병원성 효과를 유발한다는 것을 보여줍니다.

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그림 3: 환자 항체는 신경 세포 배양의 표면과 반응합니다. (A,E) 항 NMDAR 뇌염 환자의 혈청 및 CSF는 살아있는 쥐 해마 뉴런의 세포 표면과 반응하는 반면, (B, F) 대조군의 혈청 및 CSF는 반응성을 보이지 않습니다. 스케일 바 (A, B, E, F) = 20 μm. (C,G) 환자의 혈청 및 CSF에 대한 반응성의 전형적인 표면 패턴을 보여주는 수상 돌기 (63x) 및 대조군에 대한 (D, H) 음성의 고배율 이미지. 이미지는 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경으로 촬영되었습니다. 스케일 바 = 10 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 4: 환자 항체는 GCaMP5G를 발현하는 쥐 뉴런의 칼슘 유입을 줄입니다. (a) 자극 전(사전 자극)과 비교하여 세포 내 녹색 형광(자극 피크)의 증가로 나타난 바와 같이 칼슘 유입을 촉발한 뉴런의 배양물에 자극 용액(NMDA[100 μM] + 글리신[1 μM])을 투여했습니다. 120초 후, 형광 강도는 감소하고 안정화됩니다(자극 후). 환자의 CSF로 처리 한 배양 물은 대조군의 CSF와 비교하여 NMDA 매개 칼슘 증가에서 상당한 감소 (56 %)를 보였다. 이미지는 형광 현미경으로 촬영하였다. 스케일 바 = 20 μm. (B) NMDA 자극시 대조군의 CSF (검은 색 선) 및 환자의 CSF (회색 선)로 처리 된 배양물에 대한 시간 경과에 따른 형광 강도 (180 초)를 나타내는 3 개의 독립적 인 실험 중 하나의 플롯 (파란색 화살표). n (대조군의 CSF) = 20 셀; n (환자의 CSF) = 28 세포. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시됩니다. (C) 상자 그림은 중위수, 25번째 및 75번째 백분위수를 보여줍니다. 수염은 최소값과 최대 값을 나타냅니다. 유의성 평가는 이원 분산 분석 (ANOVA; p < 0.0001) 및 Mann-Whitney U 검정 (p < 0.0001)에 의해 수행되었다. p < 0.05의 값은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 동영상 1: GCaMP5G를 발현하는 두 개의 해마 뉴런을 나란히 보여주는 비디오: 대조군의 CSF로 처리된 뉴런(왼쪽) 대 환자의 CSF로 처리된 뉴런(오른쪽). NMDAR (자극)의 적용은 두 경우 모두 세포 내 형광 강도의 증가를 생성하지만, 환자의 CSF로 치료 한 것보다 대조군의 CSF로 치료 한 뉴런에서 훨씬 더 높은 수준을 보입니다. 이미지는 형광 현미경으로 촬영하고 룩업 테이블(LUT) Fire를 적용하여 ImageJ로 편집했습니다. 1700 프레임 (170 초); 5 배 가속. 스케일 바 = 10 μm. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

항체 매개 자가면역의 성장하는 분야는 환자의 진단 및 치료를 개선하는 데 사용할 수 있는 신경 자가항체의 식별을 위한 기회의 창을 열었습니다. 해마 뉴런의 배양은 항체 식별에 필수적인 도구입니다. 따라서 신뢰할 수 있고 재현 가능한 결과를 얻으려면 표준화된 프로토콜을 수행하는 것이 중요합니다. 고려해야 할 가장 중요한 단계, 제한 사항 및 문제 해결은 여기에서 설명합니다.

이 프로토콜의 중요한 단계는 해마 뉴런의 순도, 균질성 또는 생존력에 영향을 미치는지 여부에 따라 세 가지 범주로 그룹화 할 수 있습니다.

순도 - 최적의 일차 세포 배양을 얻으려면 연구자는 특히 해부 시간을 최소화하기 위해 자신감 있고 훈련을 받았으며 신속하게 작업할 수 있어야 합니다. 피라미드 뉴런이 주요 세포 유형이라 할지라도, 해마는 다양한 인터뉴런(interneurons)을 함유한다(14). 최소한의 신경교 세포로 배양을 생성하려면 최소한의 주변 조직으로 해마를 추출해야 합니다. 해부 중에 검은 색 배경을 사용하면 실체 현미경으로 해마의 한계를 식별하는 데 도움이됩니다. 또한, 낮은 세포 밀도는 더 적은 파라크린 지지를 초래하고 배양(13)을 유지하는 것을 더 어렵게 만든다는 것을 고려해야 한다. 따라서이 균형을 명심하는 것이 중요합니다. 이것은 적은 수의 세포 (3.5cm 접시 당 50,000 개의 뉴런)를 사용하는 영상 연구에서 중요합니다. 해마 추출을 위한 추가적인 시간을 가질 수 있으려면, 조직을 보존하는 동면 매체가17 사용되어야 한다. 적절한 수술 도구로 작업하는 것도 필수적입니다. 고정밀 공구는 섬세하므로 신중하게 보호하여 기술의 재현성을 보장해야합니다.

균질성 - 세포 응집체가 없는 배양을 개발하기 위해 사전 당겨진 유리 피펫과 표준 1,000μL 피펫을 결합하여 기계적 세포 해리가 업그레이드되었습니다.

생존성 - 이 프로토콜에서, 항생제는 뉴런 흥분성에 영향을 미치고 배양된 뉴런의 전기생리학적 특성을 변경하기 때문에 첨가되지 않았다18. 따라서 최고 수준의 무균 상태가 유지되지 않으면 오염 가능성이 매우 높습니다. 온도도 핵심 요소입니다. 해마 격리 중에 조직을 차갑게 유지하면 신진 대사가 느려지고 세포 분해가 감소합니다. 따라서 조직은 세포 해리 과정까지 얼음 위에 보관되었습니다. 또한, 효소 세포 해리 중에 현저한 세포 용해 없이 세포를 분해하는 올바른 균형을 찾는 것이 중요합니다. 이 프로토콜에서, 트립신을 사용한 배양 타이밍 및 후속 세척 단계는 적절한 뉴런 네트워크를 생성 할 수있는 충분한 공간을 가진 개별 세포를 얻기 위해 최적화되었습니다.

중요한 단계는 신경 세포 배양의 형광 라이브 면역 염색 및 칼슘 활성 기록에서도 발견됩니다. 환자 샘플에서 세포 표면 단백질에 대한 항체의 존재를 결정하기 위한 성공적인 라이브 면역염색을 수행하려면 항체가 세포내 단백질에 접근할 수 있도록 하는 세포의 투과화를 피해야 합니다. 또한 항체의 역가에 따라 배양 시간과 샘플 희석을 적절하게 조정해야 합니다(예: 매우 높은 역가 항체는 결과를 해석하기 어렵게 만드는 배경 염색을 제공할 수 있음). 칼슘 영상으로 자가항체의 병원성 평가를 수행할 때는 세포 활성 측정에 최적화된 배지를 사용해야 합니다(예: 배양 배지에서Mg2+ 억제가 우수한 성능을 위해 중요함). 또한 형광 이미징의 경우 페놀 레드와 같은 pH 표시기가 있는 매체는 비특이적 배경 신호를 도입하므로 피해야 합니다.

해마 신경 세포의 사용에는 두 가지 주요 한계가 있습니다. 첫째, 안정한 세포주와 비교하여 1 차 배양은 지속적으로 생성되어야하며 이는 실험실 동물을 정기적으로 사용하는 것을 의미합니다. 유도만능줄기세포(iPSC) 계통은 동물 모델 사용의 필요성을 대체할 수 있지만 iPSC의 분화 프로토콜은 여전히 최적이 아닙니다. 둘째, iPSC로부터 유도된 뉴런은 표면 단백질의 전체 스펙트럼을 발현하지 않으므로, 사용되는 경우, 반응성의 부재가 반드시 샘플(19)의 음성성을 의미하지는 않는다.

AE가 의심되는 환자의 혈청 또는 CSF에서 자가항체의 존재를 스크리닝하는 세 가지 방법이 있습니다: 쥐 뇌 조직을 사용하는 조직 기반 분석(TBA), 신경 단백질을 발현하도록 형질감염된 HEK 세포를 사용하는 세포 기반 분석(CBA), 및 해마 뉴런의 라이브 배양을 사용하여 여기에 보고된 응용 프로그램19. 배양 된 해마 뉴런 방법의 중요성은 TBA로 쉽게 구별 할 수없는 표면 및 세포 내 항원과의 반응성을 구별하는 능력에 있습니다. 게다가, HEK 형질감염된 세포의 CBA와 달리 1차 뉴런 배양은 형질감염된 단백질의 레퍼토리에 의해 제한되지 않습니다. 또한 배양된 해마 뉴런을 사용하여 면역침전 및 질량분석법과 결합할 때 새로운 항체 및 표적 항원을 식별할 수 있으므로 식별 가능한 항체의 스펙트럼을 확장할 수 있습니다. 마지막으로, 세포 활동의 변화를 모니터링할 수 있는 라이브 이미징 방법으로 자가항체의 병원성 효과를 평가할 수 있습니다. 결론적으로, 새로운 자가항체의 동정은 결국 환자 결과를 개선하기 위한 특정 면역요법의 개시를 가능하게 한다.

공개 사항

저자는 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

메르슈 리바스, 마리아 마르살, 구스타보 카스트로, 조르디 코르테스, 알리나 히르슈만, 앙헬 산도발(ICFO-Institut de Ciències Fotòniques)과 메르세데스 알바, 마리야 라도세비치, 다비드 소토, 자비에르 가술, 마르 구아스프, 리디아 사바터(IDIBAPS, 바르셀로나 대학교 클리닉 병원)와 기술 지원 및 시약 제공에 대해 Josep Dalmau와 Myrna R. Rosenfeld(IDIBAPS, 바르셀로나 대학교 Clínic 병원)에 대한 비판적 검토와 멘토링. 이 연구는 Instituto de Salud Carlos III (ISCIII)가 자금을 지원하고 유럽 연합, FIS (PI20 / 00280, JP), Fundació CELLEX (P.L-A.); Ministerio de Economía y Competitividad - R & D 우수 센터를위한 Severo Ochoa 프로그램 (CEX2019-000910-S, P.L-A.); CERCA 프로그램 및 레이저 랩 유럽 (871124, PLA); Ministerio de Ciencia e Innovación (MCIN/AEI/ 10.13039/501100011033, P.L-A.); 및 폰도 소셜 유럽 (PRE2020-095721, M.C.).

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
10cm 세포 배양 접시Nunc12-565-020
12mm 원형 커버 슬립FisherNC9708845
20x NA 0.75 S Fluor 공기 대물NikonCFI Super Fluor 20X
3.5cm 세포 배양 접시Nunc12-565-90
6cm 세포 배양 접시Nunc12-565-94
B27 보충제Gibco17504-044
비커 100mLPirex-Borax
Sigma-AldrichB9876
붕산Sigma-AldrichB0252
CaCl2Sigma-AldrichC1016
곡선 집게FST11009-13
D-포도당시그마-AldrichD9434
DMEM 고포도당(4.5g/L), L-글루타민 없음, 페놀 제외 붉은염소자리DMEM-HXRXA
암컷 Wistar 쥐(임신 18일)Janvier-Fetal
Bovine Serum (FBS)BiowestS181B-500
미세 각도 겸FST11251-35
미세 곡선 겸자FST11272-30
파인 스트레이트 집게FST11251-23
FITC 필터 큐브니콘스탠다드 시리즈
집게FST11000-12
염소 안티 휴먼 AF488InvitrogenA11013
HBSS염소자리HBSS-1A
HEPES시그마 알드리치H3375
Hibernate-E 매체GibcoA12476-01
호스 세럼 (HS)Thermofisher26050088
인간 항 NMDAR 항체 (CSF)환자 샘플-
인간 항 NMDAR 항체 (혈청)환자 샘플-
ImageJ / FijiNIHv1.50i
반전 형광 현미경Nikon이클립스 TE2000-U
KCl시그마-알드리치44675
L-글루타민바이오웨스트X0550-100
수은 램프니콘C-HGFI
현미경 셀챔버맞춤형-빌드-
NaCl시그마-알드리치S9887
NBQX토크리스373
페놀이 없는 Neurobasal레드 Gibco12348-017
NMDA시그마-알드리치M3262
pAAV2-CAG-GCaMP5G벡터Biolabs-
파라포름알데히드 4%Thermo ScientificJ199943-K2
페니실린-스트렙토마이신BiowestL0022-100
인산염 완충 식염수Gibco10010023
Poly-L-Lysine (PLL)Peptide internationalOKK-35056
폴리스티렌 얼음 트레이--폴리스테렌 상자의 재사용 캡
정밀 스프링 가위FST15000-08
ProLong Gold with DAPI(Antifading mounting media)분자프로브P36941
가위FST14068-12
나트륨 피루브산BiowestL0642-100
실체 현미경ZeissStemi 2000
수술 가위FST14081-09
Trypsin 2.5%Gibco15090046
물, 멸균 내독소 무료Sigma-AldrichW3500
렌즈 자

참고문헌

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