상기 프로토콜은 해부된 마우스 배아 안면 과정 또는 배양된 마우스 배아 구개 중간엽 세포로부터 전체 세포 단백질 용해물을 단리하고 인산화된 단백질 수준을 평가하기 위해 후속 웨스턴 블롯팅을 수행하는 방법을 제시한다.
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방법 논문
마우스 안면 과정으로부터 전체 세포 단백질 용해물을 분리하고 포스포단백질 분석을 위해 배양된 팔라탈 중간엽 세포
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
포유류 두개골 안면 발달은 여러 세포 집단이 전두엽 골격을 생성하기 위해 조정되는 복잡한 형태 학적 과정입니다. 이러한 형태학적 변화는 다양한 신호전달 상호작용을 통해 시작되고 지속되며, 이는 종종 키나아제에 의한 단백질 인산화를 포함한다. 여기에서, 포유동물 두개골 발달 동안 단백질의 인산화를 연구하는 생리학적으로 관련된 맥락의 두 가지 예가 제공된다: 마우스 안면 과정, 특히 E11.5 상악 과정, 및 E13.5 이차 구개 선반으로부터 유래된 배양된 마우스 배아 구개 중간엽 세포. 단백질 분리 중 탈인산화의 공통적 인 장벽을 극복하기 위해 포스포 단백질의 분리를 허용하는 표준 실험실 방법에 대한 적응 및 변형이 논의됩니다. 또한, 전체 세포 단백질 용해물의 웨스턴 블롯팅에 따른 포스포단백질의 적절한 분석 및 정량화를 위한 모범 사례가 제공됩니다. 이러한 기술은, 특히 약리학적 억제제 및/또는 뮤린 유전 모델과 조합하여, 두개골 발달 동안 활성인 다양한 포스포단백질의 역학 및 역할에 대한 더 큰 통찰력을 얻기 위해 사용될 수 있다.
서론
포유류 두개골 안면 발달은 여러 세포 집단이 전두엽 골격을 생성하기 위해 조정되는 복잡한 형태 학적 과정입니다. 마우스에서,이 과정은 배아 일 (E) 9.5에서 전두엽 두드러기와 상악 및 하악 과정의 쌍을 형성하면서 시작되며, 각각은 철새 후 두개골 신경 볏 세포를 포함합니다. 측면 및 내측 비강 과정은 비강 구덩이의 출현과 함께 전두엽 두드러짐에서 발생하고 결국 융합되어 콧 구멍을 형성합니다. 또한, 내측 비강 과정과 상악 과정은 상립을 생성하기 위해 융합된다. 동시에, 고형성 (palatogenesis)은 E11.5에서 상악 과정의 구강 측에서 뚜렷한 파생물 (이차 구개 선반)의 형성으로 시작됩니다. 시간이 지남에 따라 구개골 선반은 혀의 양쪽에서 아래쪽으로 자라며 혀 위의 반대 위치로 상승하고 결국 중간 선에서 융합되어 E16.51에 의해 비강과 구강 충치를 분리하는 연속 구개열을 형성합니다.
두개골 안면 발달 전반에 걸친 이러한 형태학적 변화는 다양한 신호전달 상호작용을 통해 시작되고 지속되며, 이는 종종 키나아제에 의한 단백질 인산화를 포함한다. 예를 들어, 골형성 단백질 수용체 (BMPRs) 및 다양한 수용체 티로신 키나제 (RTK) 패밀리를 포함하는 형질전환 성장 인자 (TGF)-β 수용....
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프로토콜
동물과 관련된 모든 절차는 콜로라도 대학 안슈츠 메디컬 캠퍼스의 IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았으며 제도적 지침 및 규정을 준수하여 수행되었습니다. 암컷 129S4 마우스를 1.5-6개월령에 21-23°C의 열중성 이하 온도에서 사육하여 배아 수확에 사용하였다. 프로토콜의 개략적인 워크플로우는 그림 1에 나와 있습니다. 이 프로토콜에 사용되는 모든 재료, 장비, 소프트웨어, 시약 및 동물에 대한 자세한 내용은 자료 표를 참조하십시오.
1. E11.5 마우스 배아 수확
- 임신 한 여성 마우스를 CO2 챔버에서 시간 정합 중에 질 플러그를 검출 한 후 11.5 일 후에 약 50 % 변위 (3 챔버에서2.95 L / min) 및 노출 기간 (재료 표 참조)에 필요한 IACUC 승인CO2 유량을 사용하여 안락사시킨다. 안락사의 보조 방법으로 자궁 경부 탈구를 수행하십시오. 즉시 해부로 진행하십시오.
- 복부 쪽을 위로 향하....
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결과
마우스 안면 과정 및/또는 배양된 구개 중간엽 세포로부터 분리된 단백질의 인산화를 특성화하려고 시도할 때, 대표적인 결과는 상응하는 총 단백질 밴드의 높이 또는 그 근처에서 실행되는 항-포스포단백질 항체를 사용한 웨스턴 블롯팅에 이어 뚜렷하고 재현 가능한 밴드를 이상적으로 드러낼 것이다(그림 3 ). 그러나, 단백질의 광범위한 인산화가 발생하는 경우, 전체 단백질 밴드의 그것과 비교하여 포스포단백질 밴드의 약간의 상향 이동이 있을 수 있다. 또한, 단백질의 다중 이소형이 조직에 존재하거나, 이들 각각이 인산화되거나, 단백질이 가변적으로 추가적인 PTMs를 받는 경우, 항포스포단백질 항체를 사용한 웨스턴 블롯에서 다중 밴드가 나타날 수 있다. 관심있는 포스포단백질에 대한 신호가 관찰되지 않으면, 관심있는 전체 단백질의 검출에도 불구하고, 단백질은 선택된 맥락에서 인산화되지 않을 수 있거나, 프로토콜에 기술적 문제가 발생했을 수 있다. 후자의 경우, 전체 세포 용해물의 웨스턴 블.......
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토론
여기에 설명 된 프로토콜을 통해 연구원은 두개골 안면 발달 중에 중요한 인산화 의존성 신호 전달 사건을 강력하고 재현 가능한 방식으로 조사 할 수 있습니다. 이 프로토콜에는 적절한 데이터 수집 및 결과 분석을 보장하는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 마우스 안면 과정 및/또는 배양된 구개골 중간엽 세포로부터 포스포단백질을 분리하든, 지시될 때 모든 시약과 물질을 얼음 위에 유지하면서 신속하고 효율적으로 이동하는 것이 필수적입니다. 얼음의 저온은 세포의 대사 활성을 늦추고, 이로써 포스파타제 활성(38)으로부터 인산화된 단백질을 보호하고 높은 단백질 수율을 유지한다. 상악 과정의 해부 동안 세 개의 분리 된 10cm 페트리 접시를 사용하면 모든 해부가 충분히 미리 냉각 된 조직학 PBS에서 일어난다는 것을 보장합니다. 이와 관련하여, 이러한 단백질 분리 프로토콜의 추가적인, 필수 성분은 모든 용해 완충제에서 포스파타제 억제제의 사용이다. 이들 시약은 또한 관심있는 단백질
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
129S4 마우스는 시나이 산의 이칸 의과 대학 필립 소리아노 박사의 선물이었다. 이 연구는 NIH (National Institutes of Health) / National Institute of Dental and Craniofacial Research (NIDCR) R01 DE027689 및 K02 DE028572에서 K.A.F., F31 DE029976에서 M.A.R. 및 F31 DE029364에서 B.J.C.D.까지의 기금으로 지원되었습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Equipment | |||
| Block for Mini Dry bath Research | Products International Corp | 400783 | |
| Image Lab 소프트웨어가 있는 ChemiDoc XRS+ 이미징 시스템 | Bio-Rad | 1708265 | 화학발광 이미저 |
| CO2 인큐베이터, 에어 재킷 | VWR | 10810-902 | |
| 해부 보드, 11 x 13 in | Fisher Scientific | 09 002 12 | |
| 전기영동 셀, 4-겔, 미니 트랜스 블롯 모듈이 있는 미니 프리캐스트 겔용 | Bio-Rad | 1658030 | |
| 혼성화 오븐 | Fisher Scientific | UVP95003001 | |
| 마이크로 원심분리기 5415 D F45-24-11 로터(Eppendorf) | 가 있는 Sigma Aldrich | Z604062 | |
| Mini dry | bath Research Products International Corp | 400780 | |
| 오비탈 쉐이커 | VWR | 89032-092 | |
| pH 측정기 | VWR | 89231-662 | |
| SDS-PAGE | Bio-Rad | 1645050 | |
| 직사각형 아이스 팬용 전원 공급 장치, 맥시 9 L | Fisher Scientific | 07-210-093 | |
| Stemi 508 실체 현미경(스탠드 포함) K LAB, LED 링 라이트 | Zeiss | 4350649020000000 | 해부 현미경 |
| 타이머 | VWR | 62344-641 | |
| 튜브 리볼버 | Fisher Scientific | 11 676 341 | |
| 소용돌이 믹서 | Fisher Scientific | 02 215 414 | |
| 수조 | VWR | 89501-472 | |
| 웨스턴 블롯 박스 | Fisher Scientific | NC9358182 | |
| 재료 | |||
| 세포 배양 접시, 6cm | Fisher Scientific | 12-565-95 | |
| 세포 배양 플레이트, 12웰 | Fisher Scientific | 07-200-82 | |
| 세포 리프터 | Fisher Scientific | 08-100-240 | |
| CO2 | Airgas | CD USP50 | |
| 원추형 튜브, 폴리프로필렌, 50 mL | Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| Dumont #5 파인 | 펜치 파인 사이언스 도구 | 11254-20 | |
| 배아 스푼 | 파인 사이언스 툴 | 10370-17 | |
| 마이크로 원심분리기 튜브, 0.5 mL | VWR | 89000-010 | |
| 마이크로 원심분리기 튜브, 1.5 mL | VWR | 20170-038 | |
| 파스퇴르 피펫, 5.75" | Fisher Scientific | 13-678-6A | |
| 파스퇴르 피펫, 9" | VWR | 14672-380 | |
| 페트리 접시, 10cm | Fisher Scientific | 08-757-100D | |
| 페트리 접시, 35mm | Fisher Scientific | FB0875711YZ | |
| 파우치, 투명, 폴리에틸렌 라이닝 | Fisher Scientific | 01-812-25B | |
| PVDF 멤브레인 | Fisher 과학 | IPVH00010 | |
| 셈켄 펜치 | 파인 사이언스 도구 | 11008-13 | |
| 소형 라텍스 전구, 2 mL | VWR | 82024-554 | |
| 수술용 가위 | 파인 사이언스 도구 | 14002-12 | |
| 주사기 필터, 25 mm, 0.2 μ m 기공 크기 | Fisher Scientific | 09-740-108 | |
| 루어 팁이 있는 주사기, 10mL | VWR | BD309604 | |
| 전사 피펫 | Fisher Scientific | 13-711-22 | |
| 웨스턴 블롯 카세트 개방 레버 | Bio-Rad | 4560000 | |
| Whatmann 3MM chr 크로마토그래피 종이 | Fisher Scientific | 05-714-5 | |
| 시약 | |||
| 4-15% 프리캐스트 단백질 겔, 10-well, 30 µ L | Bio-Rad | 4561083 | |
| β-글리세로인산디소듐 염 수화물 | Sigma Aldrich | G5422-25G | 재고 농도 1 M |
| β-메르캅토에탄올 | Sigma Aldrich | M3148-100ML | |
| 소 혈청 알부민, 분획 V, 열 충격 테스트 Fisher | Scientific | BP1600-100 | |
| 브로모페놀 블루 | Fisher Scientific | ||
| 컴플리트 미니 프로테아제 억제제 칵테일 | Sigma Aldrich | 11836153001 | 농축 25x |
| DC 단백질 분석 키트 II | Bio-Rad | 500-0112 | |
| DMEM, 고포도 | Gibco 11965092 | ||
| E7, 마우스 단클론 베타 튜불린 1차 항체, 농축액 0.1mL | 개발 연구 Hybridoma Bank | E7 | 1:1,000 |
| ECL 웨스턴 블로팅 기판 | Fisher Scientific | PI32106 | 낮은 피코그램 범위 |
| ECL 웨스턴 블로팅 기판 | Genesee Scientific | 20-302B | 낮은 펨토그램 범위 |
| 전기영동 버퍼, 5L | Bio-Rad | 1610772 | 스톡 농도 10x |
| 에탄올, 200 프루프, 1 | Decon Laboratories, Inc. | 2705HC | EtOH |
| 에틸렌디아민테트라아세트산, 디뮐 Na 염 디하이드르. (결정질 powd./electrophor.) | Fisher Scientific | BP120-500 | EDTA |
| 소 태아 혈청, 특성화, 미국 유래, 500mL | HyClone | SH30071.03 | |
| 글리세롤(ACS 인증) | Fisher Scientific | G33-4 | |
| HRP 접합 2차 항체, 염소 항마우스 IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 115-035-146 | 1:20,000 |
| HRP 접합 2차 항체, 염소 anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 111-035-003 | 1:20,000 |
| 염산 용액, 6N(인증) | Fisher Scientific | SA56-500 | HCl |
| Igepal Ca - 630 비이온 세제 | Fisher Scientific | ICN19859650 | Nonidet P-40 |
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| 페니실린-스트렙토마이신 | Gibco | 15140122 | 원료 농도 100 U/mL, 100 µ g/mL |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride, 99% | Fisher Scientific | AC215740100 | PMSF; 재고 농도 100 mM |
| Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) 1차 항체 | 세포 신호 기술 | 9101S | 1:1,000, anti-phospho-Erk1/2 |
| Phospho-PDGF 수용체 α /PDGF 수용체 β 1차 항체 | 세포 신호 기술 | 3170S | 1:1,000 |
| 염화칼륨(백색 결정) | Fisher Scientific | BP366-500 | KCl |
| 인산칼륨 일염기성(백색 결정) | Fisher Scientific | BP362-500 | KH2PO4 |
| SDS solution, 10% | Bio-Rad | 161-0416 | |
| 염화나트륨(결정질/생물학적, 인증) | Fisher Scientific | S671-3 | NaCl |
| 불화나트륨 (분말/ACS 인증) | Fisher Scientific | S299-100 | NaF; 1회 사용을 위한 분취량; 재고 농도 1 M |
| 오르토바나데이트 나트륨, 99% | Fisher Scientific | AC205330500 | Na3VO4; 재고 농도 100 mM |
| 인산나트륨 이염기성 무수(과립 또는 분말/인증 ACS) | Fisher Scientific | S374-500 | Na2HPO4 |
| 배양 PBS | Fisher Scientific | 21-031-CV | |
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| Tris 염기(백색 결정 또는 결정 분말/분자 생물학) | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Trypsin | BioWorld | 21560033 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| 웨스턴 블롯 분자량 마커 | Bio-Rad | 1610374 | |
| Software | |||
| ImageJ 소프트웨어 | National Institutes of Health | ||
| Animals | |||
| Female 129S4 마우스 | 필립 소리아노(Philippe Soriano) 박사의 선물, 마운트 시나이 아이칸 의과대학 |
참고문헌
- Bush, J. O., Jiang, R. Palatogenesis: morphogenetic and molecular mechanisms of secondary palate development. Development. 139 (2), 231-243 (2012).
- Chai, Y., Ito, Y., Han, J. TGF-beta signaling a....
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