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방법 논문

마우스 안면 과정으로부터 전체 세포 단백질 용해물을 분리하고 포스포단백질 분석을 위해 배양된 팔라탈 중간엽 세포

2K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/63834

⸱

2022년 4월 1일

 ,  , 
1Department of Craniofacial Biology, School of Dental Medicine, University of Colorado Anschutz Medical Campus

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

상기 프로토콜은 해부된 마우스 배아 안면 과정 또는 배양된 마우스 배아 구개 중간엽 세포로부터 전체 세포 단백질 용해물을 단리하고 인산화된 단백질 수준을 평가하기 위해 후속 웨스턴 블롯팅을 수행하는 방법을 제시한다.

초록

포유류 두개골 안면 발달은 여러 세포 집단이 전두엽 골격을 생성하기 위해 조정되는 복잡한 형태 학적 과정입니다. 이러한 형태학적 변화는 다양한 신호전달 상호작용을 통해 시작되고 지속되며, 이는 종종 키나아제에 의한 단백질 인산화를 포함한다. 여기에서, 포유동물 두개골 발달 동안 단백질의 인산화를 연구하는 생리학적으로 관련된 맥락의 두 가지 예가 제공된다: 마우스 안면 과정, 특히 E11.5 상악 과정, 및 E13.5 이차 구개 선반으로부터 유래된 배양된 마우스 배아 구개 중간엽 세포. 단백질 분리 중 탈인산화의 공통적 인 장벽을 극복하기 위해 포스포 단백질의 분리를 허용하는 표준 실험실 방법에 대한 적응 및 변형이 논의됩니다. 또한, 전체 세포 단백질 용해물의 웨스턴 블롯팅에 따른 포스포단백질의 적절한 분석 및 정량화를 위한 모범 사례가 제공됩니다. 이러한 기술은, 특히 약리학적 억제제 및/또는 뮤린 유전 모델과 조합하여, 두개골 발달 동안 활성인 다양한 포스포단백질의 역학 및 역할에 대한 더 큰 통찰력을 얻기 위해 사용될 수 있다.

서론

포유류 두개골 안면 발달은 여러 세포 집단이 전두엽 골격을 생성하기 위해 조정되는 복잡한 형태 학적 과정입니다. 마우스에서,이 과정은 배아 일 (E) 9.5에서 전두엽 두드러기와 상악 및 하악 과정의 쌍을 형성하면서 시작되며, 각각은 철새 후 두개골 신경 볏 세포를 포함합니다. 측면 및 내측 비강 과정은 비강 구덩이의 출현과 함께 전두엽 두드러짐에서 발생하고 결국 융합되어 콧 구멍을 형성합니다. 또한, 내측 비강 과정과 상악 과정은 상립을 생성하기 위해 융합된다. 동시에, 고형성 (palatogenesis)은 E11.5에서 상악 과정의 구강 측에서 뚜렷한 파생물 (이차 구개 선반)의 형성으로 시작됩니다. 시간이 지남에 따라 구개골 선반은 혀의 양쪽에서 아래쪽으로 자라며 혀 위의 반대 위치로 상승하고 결국 중간 선에서 융합되어 E16.51에 의해 비강과 구강 충치를 분리하는 연속 구개열을 형성합니다.

두개골 안면 발달 전반에 걸친 이러한 형태학적 변화는 다양한 신호전달 상호작용을 통해 시작되고 지속되며, 이는 종종 키나아제에 의한 단백질 인산화를 포함한다. 예를 들어, 골형성 단백질 수용체 (BMPRs) 및 다양한 수용체 티로신 키나제 (RTK) 패밀리를 포함하는 형질전환 성장 인자 (TGF)-β 수용체의 서브패밀리와 같은 세포막 수용체는 두개골 신경 크레스트 세포 2,3,4에서 리간드 결합 및 활성화시 자가인산화된다. . 추가적으로, G 단백질-결합된 막횡단 수용체 평활화는 Patched1 수용체에 결합하는 소닉 헤지호그(SHH) 리간드의 두개골 신경 크레스트 세포 및 두개골 외배엽 하류에서 인산화되어, 섬모막 및 SHH 경로 활성화5에서의 평활화된 축적을 초래한다. 이러한 리간드-수용체 상호작용은 두개골 맥락에서 자가분비, 파라크린, 및/또는 병타크린 신호전달을 통해 발생할 수 있다. 예를 들어, BMP6는 연골세포 분화 6 동안 자가분비 방식으로 신호를 보내는 것으로 알려져 있는 반면, 섬유아세포 성장 인자(FGF) 8은 인두 아치 외배엽에서 발현되고 인두 아치 중간엽에서 발현되는 RTKs의 FGF 패밀리의 구성원에 결합하여 인두 아치의 패터닝 및 발발을 개시하는 파라크린 방식으로7, 8,9,10. 또한, 노치 신호전달은 막횡단 델타 및/또는 재그드 리간드가 이웃 세포 상의 막횡단 노치 수용체에 결합할 때 juxtacrine 신호전달을 통해 두개골 골격 발달 동안 연골세포 및 조골세포 둘 다에서 활성화되며, 이는 후속적으로 절단되고 인산화된다(11). 그러나, 자가분비 및 파라크린 신호전달 둘 다에서 기능할 수 있는 유연성을 갖는 두개골 발달에 중요한 다른 리간드 및 수용체 쌍이 있다. 일례로서, 뮤린 치아 형태형성 동안, 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF)-AA 리간드는 법랑질 기관 상피12에서 RTK PDGFRα를 활성화시키는 자가분비 방식으로 신호를 보내는 것으로 입증되었다. 대조적으로, 임신 중반 동안의 뮤린 안면 과정에서, 리간드 PDGF-AA 및 PDGF-CC를 코딩하는 전사체는 두개골 외배엽에서 발현되는 반면, PDGFRα 수용체는 기저 두개골 신경 볏 유래 중간엽에서 발현되어, 파라크린 신호전달13,14,15,16,17을 초래한다. . 신호전달 메카니즘에 관계없이, 이러한 수용체 인산화 사건은 종종 어댑터 단백질 및/또는 신호전달 분자의 모집을 초래하며, 이는 종종 미토겐-활성화된 단백질 키나제 (MAPK) 경로와 같은 세포내 키나제 캐스케이드를 개시하기 위해 스스로 인산화된다18,19.

이들 캐스케이드의 말단 세포내 이펙터는 이어서 전사 인자, RNA-결합, 세포골격 및 세포외 매트릭스 단백질과 같은 기질의 어레이를 인산화할 수 있다. Runx220, Hand1 21, Dlx3/5 22,23,24, Gli1-3 25 및 Sox9 26은 두개골 안면 발달의 맥락에서 인산화된 전사 인자 중 하나이다. 이러한 번역 후 변형(PTM)은 다른 활동들 중에서도 대안적인 PTM, 이량체화, 안정성, 절단 및/또는 DNA 결합 친화도에 대한 감수성에 직접적으로 영향을 미칠 수 있다(20,21,25,26). 추가적으로, RNA-결합 단백질 Srsf3는 두개골 안면 발달의 맥락에서 인산화되어, 그의 핵 전좌(27)로 이어진다. 일반적으로, RNA-결합 단백질의 인산화는 그들의 세포외 국소화, 단백질-단백질 상호작용, RNA 결합, 및/또는 서열 특이성(28)에 영향을 미치는 것으로 나타났다. 더욱이, 악토묘신의 인산화는 두개골 발달 전반에 걸쳐 세포골격 재배열(29,30)을 유도할 수 있고, 작은 인테그린 결합 리간드 N-결합 당단백질과 같은 세포외 매트릭스 단백질의 인산화는 골격 발달 동안 생광물화에 기여한다(31). 상기 및 다수의 다른 예를 통해, 두개골 안면 발달 동안 단백질 인산화에 대한 광범위한 함의가 있음이 명백하다. 추가적인 수준의 조절을 추가하면, 단백질 인산화는 포스파타제에 의해 더욱 조절되며, 이는 포스페이트 그룹을 제거함으로써 키나아제를 상쇄시킨다.

수용체 및 이펙터 분자 수준 모두에서 이러한 인산화 사건은 신호전달 경로의 전파에 매우 중요하며, 궁극적으로 핵에서의 유전자 발현의 변화를 초래하여, 이동, 증식, 생존 및 분화와 같은 특정 세포 활동을 유도하여, 포유동물 얼굴의 적절한 형성을 초래한다. 키나제 및 포스파타아제와의 단백질 상호작용의 맥락 특이성, PTM의 결과적인 변화, 세포 활성에 미치는 영향을 고려할 때, 이러한 파라미터가 생리학적으로 관련된 환경에서 연구되어 두개골 발달에 대한 인산화 사건의 기여에 대한 완전한 이해를 얻는 것이 중요하다. 여기에서, 단백질의 인산화 및 따라서 포유동물 두개골 발달 동안 신호전달 경로의 활성화를 연구하는 두 가지 맥락의 예가 제공된다: 마우스 안면 과정, 특히 E11.5 상악 과정, 및 배양된 마우스 배아 구개 중간엽 세포 E13.5 이차 구개 선반으로부터 유래 - 일차32차 및 불멸화33 둘 다 . E11.5에서, 상악 과정은 측방 및 내측 비강 과정1과 융합하는 과정에 있으며, 이로써 마우스 두개골 안면 발달 동안 중요한 시점을 나타낸다. 또한, 상악 과정 및 구개골 선반에서 유래 된 세포는 후자의 구조가 전자의 유도체이기 때문에 여기에서 선택되었으며, 따라서 연구자들은 관련 맥락에서 생체 내 및 시험관 내에서 단백질 인산화를 조사 할 수있는 기회를 제공합니다. 그러나이 프로토콜은 대체 얼굴 프로세스 및 발달 시점에도 적용 할 수 있습니다.

인산화된 단백질을 연구할 때 중요한 문제는 풍부한 환경 포스파타제에 의한 단백질 분리 중에 쉽게 탈인산화된다는 것입니다. 이러한 장벽을 극복하기 위해 인산화 단백질의 분리를 허용하는 표준 실험실 방법에 대한 적응 및 변형이 논의됩니다. 또한, 인산화된 단백질의 적절한 분석 및 정량화를 위한 모범 사례가 제공됩니다. 이러한 기술은, 특히 약리학적 억제제 및/또는 뮤린 유전 모델과 조합하여, 두개골 안면 발달 동안 활성인 다양한 신호전달 경로의 역학 및 역할에 대한 더 큰 통찰력을 얻기 위해 사용될 수 있다.

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프로토콜

동물과 관련된 모든 절차는 콜로라도 대학 안슈츠 메디컬 캠퍼스의 IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았으며 제도적 지침 및 규정을 준수하여 수행되었습니다. 암컷 129S4 마우스를 1.5-6개월령에 21-23°C의 열중성 이하 온도에서 사육하여 배아 수확에 사용하였다. 프로토콜의 개략적인 워크플로우는 그림 1에 나와 있습니다. 이 프로토콜에 사용되는 모든 재료, 장비, 소프트웨어, 시약 및 동물에 대한 자세한 내용은 자료 표를 참조하십시오.

1. E11.5 마우스 배아 수확

  1. 임신 한 여성 마우스를 CO2 챔버에서 시간 정합 중에 질 플러그를 검출 한 후 11.5 일 후에 약 50 % 변위 (3 챔버에서2.95 L / min) 및 노출 기간 (재료 표 참조)에 필요한 IACUC 승인CO2 유량을 사용하여 안락사시킨다. 안락사의 보조 방법으로 자궁 경부 탈구를 수행하십시오. 즉시 해부로 진행하십시오.
  2. 복부 쪽을 위로 향하게하는 해부 보드에 마우스 몸체를 놓습니다. 마우스 복부에 70 % 에탄올을 뿌리십시오.
  3. 직선 Semken 포셉으로 질 개구부의 앞쪽 피부를 꼬집고 들어 올려 복강을 열고 양쪽에서 45 ° 각도로 직선 블레이드 수술 가위로 들어 올린 피부와 기본 층을 절단하여 앞다리와 뒷다리 사이의 대략 절반 정도의 각 측면 표면으로 확장되는 "V"모양을 생성합니다.
  4. Semken 포셉을 사용하여 자궁 뿔 중 하나를 잡고 난관 아래와 수술 가위로 자궁 경부 위를 자릅니다. 자궁 경적을 완전히 제거 할 수 있도록 mesometrium을 잘라냅니다.
  5. 해부된 자궁 경적을 10 mL의 조직학 포스페이트 완충 식염수 (PBS) [0.137 M NaCl, 2.68 mM KCl, 1.76 mM KH2PO4 일염기성, 10.14 mMNa2HPO4이염기성, pH 7.4]를 10 cm 페트리 디쉬에 옮긴다.
  6. 단계 1.4-1.5에 설명된 것과 동일한 절차를 사용하여 복강의 반대편에 있는 두 번째 자궁 경적을 제거합니다.
  7. 개별 배아의 해부로 즉시 진행하지 않으면 두 개의 자궁 뿔이 들어있는 10cm 페트리 접시를 얼음 위에 놓습니다 (즉, 두 번째 암컷 마우스가 해부 될 경우).
  8. 해부 스테레오 현미경으로 Dumont # 5 미세 포셉으로 자궁 뿔에서 각 배아를 조심스럽게 해부하십시오. 천천히 myometrium, decidua, chorion을 떼어냅니다. 배아를 둘러싸고 있는 비교적 투명한 양수를 찢고 제거하고, 배아와 태반을 연결하는 탯줄을 절단한다.
  9. 각각의 해부된 배아를 절단된 플라스틱 전달 피펫 또는 배아 스푼을 사용하여 얼음 상의 12-웰 세포 배양 플레이트의 개별 웰에서 조직학 PBS의 2.5 mL로 옮긴다.
    참고: 둘 이상의 유전자형의 배아를 포함할 수 있는 깔짚으로 작업하는 경우, 얼음 위에 미리 표시된 0.5mL 마이크로 원심분리 튜브에 각각 배치하여 지노타이핑을 위해 각 배아를 둘러싸고 있는 양수를 저장하십시오.

2. E11.5 마우스 배아에서 상악 과정 해부

  1. 조직학 PBS 10mL가 들어있는 세 개의 10cm 페트리 접시를 준비하고 배아 사이의 회전에 사용할 얼음 위에 보관하십시오.
  2. 12-웰 세포 배양 플레이트의 개별 웰로부터 하나의 배아를 절단된 플라스틱 전달 피펫 또는 배아 스푼을 사용하여 얼음 상의 조직학 PBS가 있는 10 cm 페트리 접시 중 하나로 옮긴다.
  3. 해부 현미경 아래에서 미세 포셉을 사용하여 각 상악 과정을 얼굴과 분리하십시오. 먼저, 자연 압흔을 따라 상악 과정의 전방을 절단하여 측방 비강 과정과 상악 과정을 분리한다(도 2A).
  4. 둘째, 상악 과정과 하악 과정을 분리하는 자연 압흔을 따라 상악 과정의 후방을 절단합니다 (그림 2A).
  5. 셋째, 상악 과정을 완전히 분리하기 위해, 상악 과정의 눈 쪽에서 상악 과정의 전방에서 후방으로 수직으로 절단하여 자연 압흔이 위에서 참조되는 쪽을 만든다(그림 2A-C).
  6. 얼굴의 반대쪽에있는 상악 과정에 대해이 세 가지 컷을 반복하십시오.
  7. 2mL의 작은 라텍스 전구가 있는 9" 파스퇴르 피펫을 사용하여, 해부된 상악 공정 쌍과 약 30μL의 조직학 PBS의 작은 액적을 얼음 위에 라벨이 붙은 35mm 페트리 접시로 옮깁니다(그림 2D).
  8. 각 배아에 대해 단계 2.3-2.7을 따라, 배아 사이의 얼음 상에서 조직학 PBS를 함유하는 3개의 10 cm 페트리 접시를 회전시킨다. 해부 된 상악 과정의 개별 쌍을 얼음 위에 별도의 35mm 페트리 접시에 넣으십시오.
    참고 : 상악 과정 외배엽과 중간엽의 분리 (단계 2.9-2.17)는 깔짚에있는 모든 배아의 상악 과정을 해부 한 후에 수행 할 수 있습니다. 외배엽과 중간엽을 모두 포함하는 손상되지 않은 상악 과정이 필요한 경우 아래 2.18 단계로 진행하십시오.
  9. 조직 배양 PBS에서 조직 배양 PBS에 신선한 2% 트립신 250 μL와 10% 우태아 혈청(FBS) 250 μL를 준비하고, 얼음 위에 보관한다.
  10. 상악 과정을 포함하는 조직학 PBS의 첫 번째, 작은 액적으로부터 분리된 35 mm 페트리 디쉬에 대략 30 μL의 2% 트립신의 두 번째, 작은 액적을 놓는다. 한 쌍의 상악 공정을 파스퇴르 피펫을 사용하여 2% 트립신의 작은 액적으로 옮깁니다(그림 2D).
  11. 접시를 얼음 위에서 15 분 동안 배양하십시오.
  12. 얼음에서 35mm 페트리 접시를 꺼내 해부 현미경 아래에 놓습니다.
  13. 미세한 포셉을 사용하여 천천히 조심스럽게 각 상악 과정에서 외배엽 층을 떼어냅니다 (그림 2E).
    참고: 외배엽이 손상되지 않은 시트에서 중간엽으로부터 분리되지 않는 경우, 분리를 계속하기 전에 실온에서 2% 트립신(RT)에서 최대 5분 동안 추가로 배양하십시오. 조직이 2 % 트립신에서 붕해되기 시작하면 아래에 설명 된 바와 같이 상악 과정을 10 % FBS로 이동하여 트립신을 중화시키고 외배엽과 중간엽의 분리를 완료하십시오.
  14. 상악 과정 외배엽과 중간엽이 분리되면(도 2F), 한 쌍의 상악 공정으로부터 원하는 조직을 파스퇴르 피펫을 사용하여 이전의 두 개의 작은 액적으로부터 분리된 10% FBS의 약 30 μL의 세 번째 작은 액적으로 옮긴다(도 2D).
  15. 트립신화를 막기 위해 얼음 위에 35mm 페트리 접시를 놓습니다.
  16. 상악 처리 조직을 1-2분 동안 10% FBS의 얼음 상에서 인큐베이션한 다음, 두 상악 과정 모두에서 조직을 얼음 상에서 약 30 μL의 미리 냉각된 조직학 PBS의 네 번째, 작은 액적으로 옮기고-파스퇴르 피펫을 사용하여 이전의 세 개의 작은 액적으로부터 분리한다(도 2D).
  17. 상악 처리 조직을 조직학 PBS에서 1분 동안 인큐베이션하면서 파스퇴르 피펫의 끝으로 상악 프로세스 조직 주위의 조직학 PBS를 부드럽게 소용돌이치면서 모든 FBS가 조직으로부터 헹구어지도록 한다.
  18. 한 쌍의 상악 처리 조직을 파스퇴르 피펫을 사용하여 얼음 상의 표지된 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브로 옮기고, 조직학 PBS의 전달을 최소화한다. 파스퇴르 피펫으로 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브 내의 임의의 과량의 조직학 PBS를 제거하였다.
  19. 위의 단계에 따라 깔짚에있는 각 배아에서 상악 과정을 해부하십시오.
  20. 샘플을 즉시 처리하여 전체 세포 단백질 용해물을 분리하거나 (아래) -80°C에서 장기간 보관한다. 장기간 보관하기 전에, 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브를 드라이아이스 상에서 100% EtOH의 욕조에서 5분 동안 스냅-동결시킨다.

3. 마우스 상악 과정에서 전체 세포 단백질 용해물을 분리하는 것

  1. 상악 공정이 이전에 -80 °C에서 동결 된 경우 얼음 위에서 해동하십시오.
  2. 0.1 mL의 빙냉 NP-40 용해 완충액 (20 mM Tris HCl pH 8, 150 mM NaCl, 10 % 글리세롤, 1% 노니데트 P-40, 2 mM EDTA; 4°C에서 저장)을 프로테아제 및 포스파타제 억제제 (1x 완전 미니 프로테아제 억제제 칵테일 [물에 용해; -20°C에서 저장], 1 mM PMSF [이소프로판올에 용해; 4°C에서 저장], 10 mM NaF[-20°C에서 저장; 동결/해동 방지], 1 mMNa3VO4[-20°C에서 저장], 25 mM β-글리세로포스페이트[4°C에서 저장])를 얼음 위에 사용하기 직전에 첨가하였다.
    참고: 세포 분획화는 대안적으로 세포질, 핵, 막 또는 미토콘드리아 단백질 분획을 분리하기 위해 수행될 수 있다.
  3. 200 μL 피펫맨으로 10 번 위아래로 피펫하십시오.
  4. 10초 동안 소용돌이치고, 200μL 피펫맨으로 10회 위아래로 피펫팅한다. 거품을 생성하지 마십시오.
  5. 튜브 리볼버가 있는 1.5 mL/2 mL 패들을 사용하여 끝단을 회전시키면서 4°C에서 2시간 동안 인큐베이션한다.
  6. 샘플을 4°C에서 20분 동안 13,500 × g 에서 원심분리한다.
  7. 상청액을 200 mL 피펫맨과 함께 얼음 위에 새로운 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브에 수집한다.
  8. 실험 샘플에 10 μL의 단백질 용해물 + 10 μL의 NP-40 용해 완충액 및 단백질 표준으로 0.25-2.0 mg/mL의 범위에서 NP-40 용해 완충액의 소 혈청 알부민(분획 V)(BSA)의 3-5 희석액을 사용하여 단백질 분석 키트로 단백질 농도를 정량화합니다.
  9. 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)을 진행하거나(단계 5) 나머지 용해물을 드라이아이스 상에서 신속하게 동결시키고 -80°C에서 장기간 보관한다.

4. 일차 및/또는 불멸화된 마우스 배아 구개 중간엽(MEPM) 세포로부터 전체 세포 단백질 용해물을 분리하는 단계

주: E13.5 마우스 배아 및 불멸화된 MEPM 세포로부터의 일차 MEPM 세포의 단리 및 배양은 이전에 기술되었다32,33,34. 성장 인자를 갖는 세포의 자극 (단계 4.1-4.7)은 세포 용해 전에 수행될 수 있다. 자극되지 않은 세포가 필요한 경우, 아래의 단계 4.8로 진행하십시오.

  1. 진공 시스템에 부착된 5.75" 파스퇴르 피펫을 사용하여 6cm 세포 배양 접시에서 ~70% 합류로 MEPM 세포로부터 성장 배지[둘베코 변형 이글 배지(DMEM)를 50 U/mL의 페니실린, 50 μg/mL의 스트렙토마이신, 2 mM L-글루타민, 10% FBS로 흡인한다.
  2. 세포를 조직 배양 PBS 1 mL로 세척한다.
  3. 혈청 기아 배지 3 mL[페니실린 50 U/mL, 스트렙토마이신 50 μg/mL, 2 mM L-글루타민, 0.1% FBS가 있는 DMEM]을 37°C 수조에서 예열하여 첨가한다.
  4. 37°C 및 5%CO2에서 23시간 동안 인큐베이션한다.
  5. 혈청 기아 배지를 3 mL의 신선하고 예열된 혈청 기아 배지로 교체하십시오.
  6. 37°C 및 5%CO2 에서 1시간 동안 인큐베이션한다.
  7. 원하는 시간 동안 경험적으로 결정된 농도에서 선택의 성장 인자로 세포를 자극하십시오.
  8. 진공 시스템에 부착된 5.75" 파스퇴르 피펫을 사용하여 MEPM 세포로부터의 배지를 80%-100% 합류로 흡인한다.
  9. 세포를 빙냉 조직 배양 PBS (6 cm 세포 배양 접시에 대해 1 mL)로 두 번 세척하고; 마지막 세척 동안 플레이트를 옆으로 기울여 모든 조직 배양물을 PBS가 흡인되도록 한다.
  10. 사용 직전에 프로테아제 및 포스파타제 억제제가 첨가된 빙냉 NP-40 용해 완충액(6 cm 세포 배양 접시의 경우 0.1 mL)을 얼음 위에 첨가하여 세포를 용해시킨다.
  11. 플레이트의 완전한 커버리지를 보장하기 위해 대략 매 분마다 회전하면서 5 분 동안 얼음 위에서 플레이트를 인큐베이션하십시오.
  12. 예냉된 셀 리프터를 사용하여 플레이트에서 세포를 긁어내고 세포 현탁액을 얼음 위에 미리 냉각된 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브로 옮깁니다.
  13. 세포 현탁액을 튜브 리볼버와 함께 1.5 mL/2 mL 패들을 사용하여 말단을 회전시키면서 4°C에서 30분 동안 인큐베이션한다.
  14. 위에서 설명한 3.6-3.9단계를 진행합니다.

5. 마우스 안면 과정 및/또는 포스포단백질에 대한 MEPM 세포로부터의 전체 세포 단백질 용해물의 웨스턴 블롯팅

  1. SDS-PAGE용 전체 세포 단백질 용해물 샘플을 준비합니다.
    1. 조직 / 세포의 단백질 풍부도에 따라로드 할 단백질의 양을 결정하십시오. 12.5 μg은 일반적으로 전체 세포 단백질 용해물에서 견고하게 발현된 단백질에 충분하다.
    2. 사용 직전에 10% β-메르캅토에탄올로 동량의 2x Laemmli 완충액[20% 글리세롤, 4% SDS, 0.004% 브로모페놀 블루, 0.125 M 트리스 HCl pH 6.8]을 첨가한다.
      주의: β-메르캅토에탄올은 피부 또는 눈 부식성이며, 독성이 있으며, 삼키면 위험하며, 수생 독성이 있습니다. 화학 흄 후드에 장갑, 실험실 코트, 얼굴 방패 및 안전 안경을 착용하십시오. 환경 보건 및 안전 지침에 따라 폐기하십시오.
    3. 볼텍싱으로 혼합하십시오.
    4. 샘플을 100°C에서 5분 동안 미니 건조 욕조에서 가열한다.
    5. 볼텍싱으로 혼합하고 샘플을 얼음 위에 놓습니다.
    6. 9,400 × g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리한다.
    7. 샘플을 SDS-PAGE 겔에 로딩하기 전에 얼음 위에 간단히 놓거나, -20°C에서 장기간 보관한다.
  2. 4%-15% 프리캐스트 단백질 겔 및 전기영동 완충액(35)을 갖는 전기영동 셀을 사용하여 SDS-PAGE를 수행한다.
  3. 사용 직전에 첨가된 0%-20% 메탄올(100 kDa 초과 단백질의 경우 0%-10%, 100 kDa 미만의 단백질의 경우 20%)이 첨가된 전사 완충액을 사용하여 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 막으로 단백질을 전기전달합니다.
  4. 관심있는 포스포단백질에 대한 막 및 프로브를 차단한다.
    1. 전사 후, 멤브레인을 1x 트리스 완충 식염수 (TBS) [20 mM 트리스, 0.137 M NaCl, pH 7.6]로 5분 동안 웨스턴 블롯 박스에서 세척한다.
    2. 멤브레인을 5 mL의 블로킹 버퍼[1x TBS, 0.1% 트윈 20, 5% w/v BSA]로 인큐베이션하고, 잘 혼합하고, 루어 팁이 있는 10 mL 시린지를 사용하여 0.2 μm 기공을 갖는 25 mm 시린지 필터를 통해 여과한다]를 오비탈 진탕기 상에서 교반하면서 웨스턴 블롯 박스에서 1시간 동안 여과한다.
      참고: 높은 비특이적 배경 신호를 유발할 수 있는 포스포단백질 카제인이 포함되어 있으므로 포스포단백질을 특성화할 때는 우유를 차단제로 사용하지 마십시오.
    3. 멤브레인을 TBS-T[1x TBS, 0.1% 트윈 20]에서 각각 5분 동안 오비탈 쉐이커에서 교반하면서 웨스턴 블롯 박스에서 세 번 세척한다.
    4. 멤브레인을 블로킹 버퍼에 희석된 5 mL의 일차 항체 중에서 4°C에서 하룻밤 동안 50 mL 원뿔형 튜브에서 50 mL 로볼버와 함께 튜브 리볼버를 사용하여 인큐베이션한다.
      참고: 웨스턴 블롯팅을 위한 적절한 농도에 대해서는 항체 데이터시트를 참조하십시오.
    5. 오비탈 쉐이커에서 교반하면서 서부 블롯 박스에서 TBS-T에서 각각 5분 동안 RT에서 멤브레인을 세 번 세척한다.
    6. 멤브레인을 5 mL의 적절한 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP)-접합된 이차 항체를 오비탈 진탕기 상에서 교반하면서 웨스턴 블롯 박스에서 1 h 동안 블로킹 완충액에 희석하여 인큐베이션한다.
    7. TBS-T에서 각각 5분 동안 멤브레인을 오비탈 쉐이커에서 교반하면서 웨스턴 블롯 박스에서 세 번 세척한다.
    8. 멤브레인을 강화된 화학발광(ECL) 웨스턴 블롯팅 기질[병 1 및 2로부터 동량 혼합; 대형 (8.6 cm x 6.7 cm) 멤브레인에 대해 각각 0.5 mL]에서 1분 동안 인큐베이션하여, 전체 멤브레인이 ECL 웨스턴 블롯팅 기판에 지속적으로 노출되도록 한다.
    9. 과량의 ECL 웨스턴 블롯팅 기질의 멤브레인을 배수하고 즉시 화학발광 이미저를 사용하여 개발한다.
  5. 멤브레인을 제거하고 관심있는 총 단백질에 대해 다시 조사하십시오.
    1. PVDF 멤브레인을 5 mL의 스트리핑 완충액[2% SDS, 62.5 mM Tris HCl pH 6.8]을 함유하는 폴리에틸렌 라이닝이 있는 투명 파우치에 넣고 사용 직전에 8 μL/mL의 β-메르캅토에탄올을 첨가하였다.
    2. 50°C에서 30분 동안 인큐베이션하고 분당 11회전으로 혼성화 오븐에서 흔든다.
    3. 오비탈 쉐이커에서 교반하면서 서부 블롯 박스에서 TBS-T에서 각각 5분 동안 RT에서 멤브레인을 세 번 세척한다.
    4. 위에서 설명한 5.4.2-5.4.9단계를 진행합니다.
  6. ImageJ 소프트웨어를 사용하여 웨스턴 블롯 밴드 밀도를 정량화하고, 관심있는 인산화된 단백질의 수준을 관심 대상 총 단백질의 수준(36)으로 정규화한다.

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결과

마우스 안면 과정 및/또는 배양된 구개 중간엽 세포로부터 분리된 단백질의 인산화를 특성화하려고 시도할 때, 대표적인 결과는 상응하는 총 단백질 밴드의 높이 또는 그 근처에서 실행되는 항-포스포단백질 항체를 사용한 웨스턴 블롯팅에 이어 뚜렷하고 재현 가능한 밴드를 이상적으로 드러낼 것이다(그림 3 ). 그러나, 단백질의 광범위한 인산화가 발생하는 경우, 전체 단백질 밴드의 그것과 비교하여 포스포단백질 밴드의 약간의 상향 이동이 있을 수 있다. 또한, 단백질의 다중 이소형이 조직에 존재하거나, 이들 각각이 인산화되거나, 단백질이 가변적으로 추가적인 PTMs를 받는 경우, 항포스포단백질 항체를 사용한 웨스턴 블롯에서 다중 밴드가 나타날 수 있다. 관심있는 포스포단백질에 대한 신호가 관찰되지 않으면, 관심있는 전체 단백질의 검출에도 불구하고, 단백질은 선택된 맥락에서 인산화되지 않을 수 있거나, 프로토콜에 기술적 문제가 발생했을 수 있다. 후자의 경우, 전체 세포 용해물의 웨스턴 블...

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토론

여기에 설명 된 프로토콜을 통해 연구원은 두개골 안면 발달 중에 중요한 인산화 의존성 신호 전달 사건을 강력하고 재현 가능한 방식으로 조사 할 수 있습니다. 이 프로토콜에는 적절한 데이터 수집 및 결과 분석을 보장하는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 마우스 안면 과정 및/또는 배양된 구개골 중간엽 세포로부터 포스포단백질을 분리하든, 지시될 때 모든 시약과 물질을 얼음 위에 유지하면서 신속하고 효율적으로 이동하는 것이 필수적입니다. 얼음의 저온은 세포의 대사 활성을 늦추고, 이로써 포스파타제 활성(38)으로부터 인산화된 단백질을 보호하고 높은 단백질 수율을 유지한다. 상악 과정의 해부 동안 세 개의 분리 된 10cm 페트리 접시를 사용하면 모든 해부가 충분히 미리 냉각 된 조직학 PBS에서 일어난다는 것을 보장합니다. 이와 관련하여, 이러한 단백질 분리 프로토콜의 추가적인, 필수 성분은 모든 용해 완충제에서 포스파타제 억제제의 사용이다. 이들 시약은 또한 관심있는 단백질

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공개 사항

저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 글

129S4 마우스는 시나이 산의 이칸 의과 대학 필립 소리아노 박사의 선물이었다. 이 연구는 NIH (National Institutes of Health) / National Institute of Dental and Craniofacial Research (NIDCR) R01 DE027689 및 K02 DE028572에서 K.A.F., F31 DE029976에서 M.A.R. 및 F31 DE029364에서 B.J.C.D.까지의 기금으로 지원되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Equipment
Block for Mini Dry bath ResearchProducts International Corp400783
Image Lab 소프트웨어가 있는 ChemiDoc XRS+ 이미징 시스템Bio-Rad1708265화학발광 이미저
CO2 인큐베이터, 에어 재킷VWR10810-902
해부 보드, 11 x 13 inFisher Scientific09 002 12
전기영동 셀, 4-겔, 미니 트랜스 블롯 모듈이 있는 미니 프리캐스트 겔용Bio-Rad1658030
혼성화 오븐Fisher ScientificUVP95003001
마이크로 원심분리기 5415 D F45-24-11 로터(Eppendorf)가 있는 Sigma AldrichZ604062
Mini drybath Research Products International Corp400780
오비탈 쉐이커VWR89032-092
pH 측정기VWR89231-662
SDS-PAGEBio-Rad1645050
직사각형 아이스 팬용 전원 공급 장치, 맥시 9 LFisher Scientific07-210-093
Stemi 508 실체 현미경(스탠드 포함) K LAB, LED 링 라이트Zeiss4350649020000000해부 현미경
타이머VWR62344-641
튜브 리볼버Fisher Scientific11 676 341
소용돌이 믹서Fisher Scientific02 215 414
수조VWR89501-472
웨스턴 블롯 박스Fisher ScientificNC9358182
재료
세포 배양 접시, 6cmFisher Scientific12-565-95
세포 배양 플레이트, 12웰Fisher Scientific07-200-82
세포 리프터Fisher Scientific08-100-240
CO2AirgasCD USP50
원추형 튜브, 폴리프로필렌, 50 mLFisher Scientific05-539-13
Dumont #5 파인펜치 파인 사이언스 도구11254-20
배아 스푼파인 사이언스 툴10370-17
마이크로 원심분리기 튜브, 0.5 mLVWR89000-010
마이크로 원심분리기 튜브, 1.5 mLVWR20170-038
파스퇴르 피펫, 5.75"Fisher Scientific13-678-6A
파스퇴르 피펫, 9"VWR14672-380
페트리 접시, 10cmFisher Scientific08-757-100D
페트리 접시, 35mmFisher ScientificFB0875711YZ
파우치, 투명, 폴리에틸렌 라이닝Fisher Scientific01-812-25B
PVDF 멤브레인Fisher 과학IPVH00010
셈켄 펜치파인 사이언스 도구11008-13
소형 라텍스 전구, 2 mLVWR82024-554
수술용 가위파인 사이언스 도구14002-12
주사기 필터, 25 mm, 0.2 μ m 기공 크기Fisher Scientific09-740-108
루어 팁이 있는 주사기, 10mLVWRBD309604
전사 피펫Fisher Scientific13-711-22
웨스턴 블롯 카세트 개방 레버Bio-Rad4560000
Whatmann 3MM chr 크로마토그래피 종이Fisher Scientific05-714-5
시약
4-15% 프리캐스트 단백질 겔, 10-well, 30 µ LBio-Rad4561083
β-글리세로인산디소듐 염 수화물Sigma AldrichG5422-25G재고 농도 1 M
β-메르캅토에탄올Sigma AldrichM3148-100ML
소 혈청 알부민, 분획 V, 열 충격 테스트 FisherScientificBP1600-100
브로모페놀 블루Fisher Scientific
컴플리트 미니 프로테아제 억제제 칵테일Sigma Aldrich11836153001농축 25x
DC 단백질 분석 키트 IIBio-Rad500-0112
DMEM, 고포도Gibco 11965092
E7, 마우스 단클론 베타 튜불린 1차 항체, 농축액 0.1mL개발 연구 Hybridoma BankE71:1,000
ECL 웨스턴 블로팅 기판Fisher ScientificPI32106낮은 피코그램 범위
ECL 웨스턴 블로팅 기판Genesee Scientific20-302B낮은 펨토그램 범위
전기영동 버퍼, 5LBio-Rad1610772스톡 농도 10x
에탄올, 200 프루프, 1Decon Laboratories, Inc.2705HCEtOH
에틸렌디아민테트라아세트산, 디뮐 Na 염 디하이드르. (결정질 powd./electrophor.)Fisher ScientificBP120-500EDTA
소 태아 혈청, 특성화, 미국 유래, 500mLHyCloneSH30071.03
글리세롤(ACS 인증)Fisher ScientificG33-4
HRP 접합 2차 항체, 염소 항마우스 IgGJackson ImmunoResearch Laboratories115-035-1461:20,000
HRP 접합 2차 항체, 염소 anti-rabbit IgGJackson ImmunoResearch Laboratories111-035-0031:20,000
염산 용액, 6N(인증)Fisher ScientificSA56-500HCl
Igepal Ca - 630 비이온 세제Fisher ScientificICN19859650Nonidet P-40
Isopropanol (HPLC)Fisher ScientificA451-1
L-글루타민Gibco25030081 재고 농도 200 mM
메탄올Fisher ScientificA454-4
p44/42 MAPK (Erk1/2) 1차 항체세포 신호 기술9102S1:1,000; 항-Erk1/2
PDGF-BB 재조합 리간드, 쥐Fisher Scientific520BB050
PDGF 수용체 및 베타; 1차 항체세포 신호 기술3169S1:1,000
페니실린-스트렙토마이신Gibco15140122원료 농도 100 U/mL, 100 µ g/mL
Phenylmethanesulfonyl fluoride, 99%Fisher ScientificAC215740100PMSF; 재고 농도 100 mM
Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) 1차 항체세포 신호 기술9101S1:1,000, anti-phospho-Erk1/2
Phospho-PDGF 수용체 α /PDGF 수용체 β 1차 항체세포 신호 기술3170S1:1,000
염화칼륨(백색 결정)Fisher ScientificBP366-500KCl
인산칼륨 일염기성(백색 결정)Fisher ScientificBP362-500KH2PO4
SDS solution, 10%Bio-Rad161-0416
염화나트륨(결정질/생물학적, 인증)Fisher ScientificS671-3NaCl
불화나트륨 (분말/ACS 인증)Fisher ScientificS299-100NaF; 1회 사용을 위한 분취량; 재고 농도 1 M
오르토바나데이트 나트륨, 99%Fisher ScientificAC205330500Na3VO4; 재고 농도 100 mM
인산나트륨 이염기성 무수(과립 또는 분말/인증 ACS)Fisher ScientificS374-500Na2HPO4
배양 PBSFisher Scientific21-031-CV
전달 완충액, 5 LBio-Rad1610771 스톡 농도 10x
Tris 염기(백색 결정 또는 결정 분말/분자 생물학)Fisher ScientificBP152-1
TrypsinBioWorld21560033
Tween 20Fisher ScientificBP337-500
웨스턴 블롯 분자량 마커Bio-Rad1610374
Software
ImageJ 소프트웨어National Institutes of Health
Animals
Female 129S4 마우스필립 소리아노(Philippe Soriano) 박사의 선물, 마운트 시나이 아이칸 의과대학
AC403140050당 갤런 조직

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