Visualizing Yeast Organelles with Fluorescent Protein Markers

요약

여기에서는 발아 효모인 Saccharomyces cerevisiae의 살아있는 세포 이미징에서 형광 단백질 기반 소기관 마커 세트를 사용하는 방법에 대해 설명합니다.

초록

싹트는 효모인 Saccharomyces cerevisiae는 세포 기관의 기능과 역학을 연구하는 고전적인 모델 시스템입니다. 이전 연구에서는 핵, 소포체(ER), 골지체, 엔도솜, 액포, 미토콘드리아, 과산화소체, 지질 방울 및 자가포식소체를 포함한 주요 소기관 및 내막 구조에 대한 형광 단백질 기반 마커를 구축했습니다. 여기에 제시된 프로토콜은 효모 형질전환을 위한 DNA 준비, 형질전환체의 선택 및 평가, 형광 현미경 관찰 및 예상 결과를 포함하여 효모에서 이러한 마커를 사용하는 절차를 설명합니다. 이 텍스트는 다른 배경에서 효모 세포 기관 연구 분야에 진입하는 연구자를 대상으로 합니다. 필수 단계뿐만 아니라 현미경 하드웨어 고려 사항 및 몇 가지 일반적인 위험에 대한 기술 노트도 다룹니다. 이는 사람들이 살아있는 세포 형광 현미경으로 효모 세포 내 독립체를 관찰할 수 있는 출발점을 제공합니다. 이러한 도구와 방법은 단백질 세포 내 국소화를 식별하고 타임 랩스 이미징에서 관심 소기관을 추적하는 데 사용할 수 있습니다.

서론

세포내(subcellular compartmentalization)를 막(membrane-bound)으로 묶인 소기관(organelle)으로 구획화하는 것은 진핵세포(eukaryotic cell)의 조직에서 일반적인 원리입니다. 각 소기관은 특정 기능을 수행합니다. 진핵생물 생물학의 다른 많은 측면과 마찬가지로, 싹을 틔우는 효모인 Saccharomyces cerevisiae는 세포 기관 조직과 역학의 기본 원리를 설명하는 데 있어 고전적인 모델 시스템이었습니다. 예를 들어 단백질 분비 경로, 과옥시솜 단백질 수입 경로 및 자가포식 경로 ^1,2,3에서 발견된 정액 등이 있습니다.

전형적인 영양이 풍부한 조건에서 빠르게 성장하는 효모 세포에는 소포체(ER), 초기 골기, 후기 골기/초기 엔도솜, 후기 엔도솜, 액포 및 미토콘드리아가 포함됩니다. 일부 과산화소체, 지질 방울 및 자가포식소체(처음 두 개보다 훨씬 적으며, 주로 영양이 풍부한 조건에서 존재하는 Cvt 소포 유형^....

프로토콜

1. 효모 균주 구조

1. 마커 플라스미드와 적절한 효모 균주를 얻습니다.
   참고: 플라스미드는 Addgene에서 구입할 수 있습니다. 이 프로토콜은 TN124(MATa ura3 trp1 pho8Δ60 pho13Δ::LEU2), BY4741(MATa leu2Δ0 ura3Δ his3Δ1 met15Δ0) 및 DJ03(BY4741 trp1Δ::MET15)을 예로 사용합니다. 과학적 질문의 성격 외에 균주 선택에 대한 한 가지 중요한 고려 사항은 선택 마커의 호환성입니다. 여기에 설명된 소기관 마커 플라스미드는 URA3 및 TRP1 을 선택 마커로 사용합니다. 따라서 수용 균주의 유전자형은 ura3 및 trp1이어야 합니다. 그렇지 않으면 균주 또는 플라스미드를 수정해야 합니다.
2. 다음 조리법에 따라 효모 매체를 준비하십시오.
   참고: SMD(합성 최소 덱스트로오스, 아미노산 없는 포도당 2%, 효모 질소 염기(YNB) 0.67%, 아데닌 30mg/L, 라이신 30mg/L, 메티오닌 30mg/L, 히스티딘 20mg/L, 우라실 20mg/L, 트립토판 50mg/....

결과

소기관 형태 및 역학은 효모 세포가 외부 및 내부 신호에 반응함에 따라 변경될 수 있습니다. 여기에서는 mid-log 단계에서 효모 소기관의 대표적인 이미지를 제공합니다(그림 3A,B). 앞서 언급했듯이 여러 소기관은 뚜렷한 형태학적 특징을 가지고 있으므로 다른 소기관 마커와 광범위하게 비교하지 않고도 쉽게 인식할 수 있습니다. 여기에는 응급실, 미토콘드리아 및 액포가 포함됩니다. 여기에서 보여주는 것을 포함하여 일부 실험실 균주에서는 액포의 핵분열 융합 균형이 많은 대수 위상 세포에 단일 액포가 포함될 정도로 왜곡되어 있습니다. 골지체, 엔도솜, 지질 방울 및 과산화소체는 일반적으로 너무 작아서 일반 광학 현미경 검사로는 윤곽을 확인할 수 없습니다. 그래서 그들은 모두 세포질 점으로 나타납니다. 이들의 정체를 확인하기 위해서는 다른 소기관 마커와의 교차 비교가 필요하며, 이는 로그 위상 셀⁷에 설정된 .......

토론

여기에 설명된 프로토콜은 다른 연구 분야에서 진입하는 사람들이 효모 소기관 이미징을 탐구할 수 있는 간단한 시작을 제공합니다. 특정 주제로 넘어가기 전에 이미징 소프트웨어에서 자동 기능을 과도하게 사용하지 말아야 한다는 점을 다시 한 번 강조하고 싶습니다. 현미경 이미지는 단순히 예쁜 그림이 아니라 과학적 데이터이므로 그에 따라 획득 및 해석을 다루어야 합니다. 이미지 수집 매개 변수를 신중하게 선택하고 16비트 이미지와 8비트 이미지의 개념을 숙지하는 것이 특히 중요합니다.

이 프로토콜은 SMD, SMD+CA, YPD 및 SD-N의 4가지 효모 배지를 나열합니다. SMD는 "합성 최소 포도당"을 의미합니다. SMD의 장점은 낮은 자가형광을 생성한다는 것입니다. 따라서 SMD는 형광 이미징에 선호되는 매체입니다. SMD+CA에는 SMD보다 풍부한 영양을 제공하는 카사미노산이 함유되어 있지만 더 이상 순수 합성이 아니라는.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
아데닌	Sangon Biotech	A600013
Casaminoacid	Sangon Biotech	A603060
Canavalia ensiformis (잭 빈)에서 Concanavalin A시	그마 Aldrich	L7647
D-Glucose	Sangon Biotech	A501991
피지			https://fiji.sc/
유리 바닥 페트리 접시	둥지	706001	Φ
UPLXAPO 100X 오일 이멀젼 대물렌즈, Lumencor Spectra X 광원 및 Hamamatsu Orca Flash4.0 LT 카메라가 장착된
L-히스티딘	상곤 생명공학	A604351
L-류신	상곤 생명공학	A100811
L-라이신	상곤 생명공학	A602759
L-메티오닌	상곤 생명공학	A100801
L-트립토판	상곤 생명공학	A601911
현미경 커버 유리	CITOTEST	10222222C	22 mm x 22 mm, 0.16– 0.19 mm
현미경 슬라이드	CITOTEST	1A5101	25 mm x 75 mm, 1– 1.2mm
펩톤	Sangon Biotech	A505247
Uracil	Sangon Biotech	A610564
Visiview	Visitron System GmbH
https://www.visitron.de/products/visiviewr-software.html 효모 추출물	Sangon Biotech	A100850
아미노산이 없는 효모 질소 염기	Sangon Biotech	A610507
아미노산 및 황산암모늄이 없는 YNB	Sangon Biotech	A600505

35mm ImajeJ https://imagej.net/ 반전 형광 현미경 Olympus IX83.