Method Article

Microplate Reader를 사용한 박테리아 성장 데이터의 고처리량 정량화의 재현성 및 정밀도 향상

DOI:

10.3791/63849

⸱

July 27th, 2022

 ,  ,  , 
1Chemical and Biological Engineering Department, University of British Columbia, 2Process Engineering and Applied Science, Dalhousie University, 3Food Science and Technology, Dalhousie University, 4Center for Water Resources Studies, Civil and Resource Engineering, Dalhousie University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에서는 성장 곡선, 성장률 및 최대 성장률을 포함한 성장 데이터를 측정하기 위해 고처리량 프로토콜이 제공됩니다. 이 프로토콜은 두 개의 생물막 생성 박테리아를 사용하여 검증 및 검증되었습니다. 이 연구에 적용된 결과와 접근 방식은 마이크로플레이트 리더를 사용하여 다른 고처리량 프로토콜로 확장할 수 있습니다.

Abstract

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이 연구는 96웰 플레이트에서 박테리아 성장을 모니터링하고 최대 성장률을 분석하기 위해 반복 가능하고 신뢰할 수 있는 고처리량 프로토콜을 개발하는 것을 목표로 했습니다. 두 박테리아 종의 성장 곡선과 최대 성장률을 측정했습니다. (i) 뚜껑 응결, (ii) 경로 길이 보정, (iii) 접종 크기, (iv) 샘플링 시간 간격 및 (v) 공간 편향을 포함한 문제를 조사했습니다. 프로토콜의 반복성은 실행 간 표준 편차가 0.03인 세 가지 독립적인 기술 복제로 평가되었습니다. 바실러스 마이코이데스(Bacillus mycoides )와 페니바실러스 툰드라(Paenibacillus tundrae )의 최대 성장률은 ±각각 0.99 h−1 ± 0.03 h−1 및 0.85 h−1 ± 0.025 h−1로 측정되었다. 이러한 박테리아는 서로 뭉치는 친화력 때문에 광학적으로 모니터링하기가 더 어렵습니다. 이 연구는 마이크로플레이트 리더에서 신뢰할 수 있고 정확하며 재현 가능한 데이터를 얻기 위해 접종 크기, 경로 길이 보정, 뚜껑 보온화, 샘플링 시간 간격 및 웰 플레이트 공간 편향의 중요성을 보여줍니다. 개발된 프로토콜과 검증 단계는 마이크로플레이트 리더와 고처리량 프로토콜을 사용하여 다른 방법으로 확장할 수 있어 연구자의 타고난 오류와 재료 비용을 줄일 수 있습니다.

Introduction

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박테리아의 메커니즘 및 대사 연구를 포함한 다중 오믹스 조작에 대한 관심이 높아짐에 따라 성장 데이터 기록과 같은 고처리량 및 자동화된 방법의 중요성이 강조되고 있습니다 1,2. 최대 성장률과 같은 운동 매개변수로 구성된 성장 데이터는 다양한 물리적, 화학적, 항균 조건에 대한 박테리아 반응을 특성화하는 데 도움이 될 수 있습니다. 성장률 데이터는 잠재적인 유전자형-표현형 연관성1을 밝히거나 식품 농산물의 미생물 안전성 및 유통 기한을 나타내는 데 사용되는 표준 반응 변수입니다 3,4. 적응형 실험실 진화(adaptive laboratory evolution) 5,6,7, 게놈 전체 스크리닝(genome-wide screening), 특정 화학 분석

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Protocol

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참고: 이 프로토콜의 모든 단계는 멸균 상태(즉, 두 개의 화염 또는 생물 안전 캐비닛 사이)에서 따라야 합니다. 모든 재료와 도구는 20분 동안 고압멸균됩니다. 이 프로토콜에 사용되는 모든 재료, 장비 및 소프트웨어에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오. 장갑을 낀 손은 소독하고 손 소독제 또는 70% 알코올 용액으로 최소 1분 동안 적신 상태로 유지한 후 안전 캐비닛에서 제거하지 마십시오. 그렇지 않으면 손을 안전 캐비닛에 다시 넣기 전에 소독 절차를 반복해야 합니다. 주의 : 화염을 사용하기 전에 소독제가 완전히 증발했는지 확인하십시오.

참고: 두 개의 박테리아가 바이오필름을 생성하는 능력에 대해 앞서 설명한 바와 같이 식수 생물여과에서 분리되었습니다27 . 이들은 full-16S rRNA 염기서열분석을 통해 확인되었으며 Bacillus mycoides(SAMN10518261) 및 Paenibacillus tundrae(SAMN10452279)로 NCBI에 제출되었습니다.

1. 글리세롤에 박테리아 스톡을 준비하기

  1. 트립틱 소이 육수(TSB) 분말 3g의 무게....

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Results

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OD 판독 검증 및 경로 길이 보정 계수
B. mycoides 배양의 분할 샘플을 서로 다른 시점에서 채취하여 마이크로플레이트 리더와 분광 광도계를 사용하여 측정했습니다(그림 1A). 이 단계는 여러 장치에서 결과를 검증하기 위해 수행되었습니다. OD600 데이터는 상관관계가 있었지만 일치하지 않았습니다(그림 1B). 상관 관계는 0.55(95% 신뢰 구간[CI]: 0.53-0.58, R2 = 0.99)의 기울기로 선형이었으며, 이는 두 기기 간의 일정한 오프셋(기울기)을 나타냅니다. 적합도 검정에서는 RMSE(평균 제곱근 오차)와 Sy.x(표준 추정치 오차)가 0.01로 높은 상관 정확도가 확인되었습니다.

.......

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Discussion

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마이크로플레이트 리더를 사용하면 일관되고 반복 가능한 성장률을 얻을 수 있습니다. 이 기술은 인적 오류를 최소화하고 높은 처리량의 샘플링을 가능하게 합니다. 샘플당 배양량이 적기 때문에 이 접근 방식은 플라스크 또는 시험관을 사용한 세포 계수에 대한 매력적이고 저렴한 대안입니다. 마이크로플레이트 리더는 큰 표본 크기를 허용하여 통계적 검정력을 높이고 결과적으로 비용과 노동력을 낮게 유지하면서 신뢰할 수 있는 성장률 계산을 용이하게 합니다.

이 문서에서는 성장 데이터를 측정하고 분석하기 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 프로토콜은 B. mycoides 및 P. tundrea 로 검증되었습니다.이 박테리아는 생물막을 생성하는 능력으로 인해 본격적인 음용수 바이오 필터에서 분리되어 성장 데이터 평가를 더욱 어렵게 만들었습니다.

신뢰할 수 있.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

Acknowledgements

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이 작업은 자연 과학 및 공학 연구위원회 (NSERC) / 수질 및 처리 분야의 핼리팩스 물 산업 연구 의장 (보조금 번호)의 자금 지원을 받았습니다. IRCPJ 349838-16). 저자 팀은 또한 이 기사를 검토하는 데 Anita Taylor의 도움을 받은 것에 대해 감사의 뜻을 전합니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
원심분리기 Eppendorf5810 R
원심분리기 튜브 - 15 mL 써모피셔- 과학 339650멸균
원심관 - 50 mL 써모피셔- 과학 339652멸균
일회용 접종 루프, 10 &마이크로; L콜-파머 UZ-06231-08멸균
삼각 플라스크 - 250 mL 콜-파머   UZ-34502-59유리 
이소프로판올 써모피셔- 과학 396982500≥ 99.0
인산염 완충액 식염수 Sigma-AldrichP4417
피펫 팁 1,000 &마이크로; L써모피셔- 과학   UZ-25001-76
피펫 팁 10 mL 써모피셔- 과학 UZ-25001-83
피펫 팁 200 &마이크로; L써모피셔- 과학 UZ-25001-85
피펫 팁 5 mL 써모피셔- 과학   UZ-25001-80
피펫터 1,000 &마이크로; L콜-파머 UZ-07909-11
피펫터 10 mLCole-Parmer UZ-07909-15
피펫터 200 &마이크로; L콜-파머   UZ-07909-09
피펫터 5 mL 콜-파머 UZ-07859-30
트립틱 소이 국물 Millipore22091미생물학에 적합

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Reuß, D. R., et al. Large-scale reduction of the Bacillus subtilis genome: Consequences for the transcriptional network, resource allocation, and metabolism. Genome Research. 27 (2), 289-299 (2017).
  2. Sparkes, A., et al.

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Bacterial GrowthMicroplate ReaderHigh Throughput QuantificationGrowth Rate Analysis96 Well PlatesPathlength CorrectionInoculation SizeSampling IntervalSpatial BiasTechnical Replication
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