여기에서는 성장 곡선, 성장률 및 최대 성장률을 포함한 성장 데이터를 측정하기 위해 고처리량 프로토콜이 제공됩니다. 이 프로토콜은 두 개의 생물막 생성 박테리아를 사용하여 검증 및 검증되었습니다. 이 연구에 적용된 결과와 접근 방식은 마이크로플레이트 리더를 사용하여 다른 고처리량 프로토콜로 확장할 수 있습니다.
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방법 논문
여기에서는 성장 곡선, 성장률 및 최대 성장률을 포함한 성장 데이터를 측정하기 위해 고처리량 프로토콜이 제공됩니다. 이 프로토콜은 두 개의 생물막 생성 박테리아를 사용하여 검증 및 검증되었습니다. 이 연구에 적용된 결과와 접근 방식은 마이크로플레이트 리더를 사용하여 다른 고처리량 프로토콜로 확장할 수 있습니다.
이 연구는 96웰 플레이트에서 박테리아 성장을 모니터링하고 최대 성장률을 분석하기 위해 반복 가능하고 신뢰할 수 있는 고처리량 프로토콜을 개발하는 것을 목표로 했습니다. 두 박테리아 종의 성장 곡선과 최대 성장률을 측정했습니다. (i) 뚜껑 응결, (ii) 경로 길이 보정, (iii) 접종 크기, (iv) 샘플링 시간 간격 및 (v) 공간 편향을 포함한 문제를 조사했습니다. 프로토콜의 반복성은 실행 간 표준 편차가 0.03인 세 가지 독립적인 기술 복제로 평가되었습니다. 바실러스 마이코이데스(Bacillus mycoides )와 페니바실러스 툰드라(Paenibacillus tundrae )의 최대 성장률은 ±각각 0.99 h−1 ± 0.03 h−1 및 0.85 h−1 ± 0.025 h−1로 측정되었다. 이러한 박테리아는 서로 뭉치는 친화력 때문에 광학적으로 모니터링하기가 더 어렵습니다. 이 연구는 마이크로플레이트 리더에서 신뢰할 수 있고 정확하며 재현 가능한 데이터를 얻기 위해 접종 크기, 경로 길이 보정, 뚜껑 보온화, 샘플링 시간 간격 및 웰 플레이트 공간 편향의 중요성을 보여줍니다. 개발된 프로토콜과 검증 단계는 마이크로플레이트 리더와 고처리량 프로토콜을 사용하여 다른 방법으로 확장할 수 있어 연구자의 타고난 오류와 재료 비용을 줄일 수 있습니다.
박테리아의 메커니즘 및 대사 연구를 포함한 다중 오믹스 조작에 대한 관심이 높아짐에 따라 성장 데이터 기록과 같은 고처리량 및 자동화된 방법의 중요성이 강조되고 있습니다 1,2. 최대 성장률과 같은 운동 매개변수로 구성된 성장 데이터는 다양한 물리적, 화학적, 항균 조건에 대한 박테리아 반응을 특성화하는 데 도움이 될 수 있습니다. 성장률 데이터는 잠재적인 유전자형-표현형 연관성1을 밝히거나 식품 농산물의 미생물 안전성 및 유통 기한을 나타내는 데 사용되는 표준 반응 변수입니다 3,4. 적응형 실험실 진화(adaptive laboratory evolution) 5,6,7, 게놈 전체 스크리닝(genome-wide screening), 특정 화학 분석
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참고: 이 프로토콜의 모든 단계는 멸균 상태(즉, 두 개의 화염 또는 생물 안전 캐비닛 사이)에서 따라야 합니다. 모든 재료와 도구는 20분 동안 고압멸균됩니다. 이 프로토콜에 사용되는 모든 재료, 장비 및 소프트웨어에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오. 장갑을 낀 손은 소독하고 손 소독제 또는 70% 알코올 용액으로 최소 1분 동안 적신 상태로 유지한 후 안전 캐비닛에서 제거하지 마십시오. 그렇지 않으면 손을 안전 캐비닛에 다시 넣기 전에 소독 절차를 반복해야 합니다. 주의 : 화염을 사용하기 전에 소독제가 완전히 증발했는지 확인하십시오.
참고: 두 개의 박테리아가 바이오필름을 생성하는 능력에 대해 앞서 설명한 바와 같이 식수 생물여과에서 분리되었습니다27 . 이들은 full-16S rRNA 염기서열분석을 통해 확인되었으며 Bacillus mycoides(SAMN10518261) 및 Paenibacillus tundrae(SAMN10452279)로 NCBI에 제출되었습니다.
1. 글리세롤에 박테리아 스톡을 준비하기
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OD 판독 검증 및 경로 길이 보정 계수
B. mycoides 배양의 분할 샘플을 서로 다른 시점에서 채취하여 마이크로플레이트 리더와 분광 광도계를 사용하여 측정했습니다(그림 1A). 이 단계는 여러 장치에서 결과를 검증하기 위해 수행되었습니다. OD600 데이터는 상관관계가 있었지만 일치하지 않았습니다(그림 1B). 상관 관계는 0.55(95% 신뢰 구간[CI]: 0.53-0.58, R2 = 0.99)의 기울기로 선형이었으며, 이는 두 기기 간의 일정한 오프셋(기울기)을 나타냅니다. 적합도 검정에서는 RMSE(평균 제곱근 오차)와 Sy.x(표준 추정치 오차)가 0.01로 높은 상관 정확도가 확인되었습니다.
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마이크로플레이트 리더를 사용하면 일관되고 반복 가능한 성장률을 얻을 수 있습니다. 이 기술은 인적 오류를 최소화하고 높은 처리량의 샘플링을 가능하게 합니다. 샘플당 배양량이 적기 때문에 이 접근 방식은 플라스크 또는 시험관을 사용한 세포 계수에 대한 매력적이고 저렴한 대안입니다. 마이크로플레이트 리더는 큰 표본 크기를 허용하여 통계적 검정력을 높이고 결과적으로 비용과 노동력을 낮게 유지하면서 신뢰할 수 있는 성장률 계산을 용이하게 합니다.
이 문서에서는 성장 데이터를 측정하고 분석하기 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 프로토콜은 B. mycoides 및 P. tundrea 로 검증되었습니다.이 박테리아는 생물막을 생성하는 능력으로 인해 본격적인 음용수 바이오 필터에서 분리되어 성장 데이터 평가를 더욱 어렵게 만들었습니다.
신뢰할 수 있.......
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저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.
이 작업은 자연 과학 및 공학 연구위원회 (NSERC) / 수질 및 처리 분야의 핼리팩스 물 산업 연구 의장 (보조금 번호)의 자금 지원을 받았습니다. IRCPJ 349838-16). 저자 팀은 또한 이 기사를 검토하는 데 Anita Taylor의 도움을 받은 것에 대해 감사의 뜻을 전합니다.
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| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 원심분리기 | Eppendorf | 5810 R | |
| 원심분리기 튜브 - 15 mL | 써모피셔- 과학 | 339650 | 멸균 |
| 원심관 - 50 mL | 써모피셔- 과학 | 339652 | 멸균 |
| 일회용 접종 루프, 10 &마이크로; L | 콜-파머 | UZ-06231-08 | 멸균 |
| 삼각 플라스크 - 250 mL | 콜-파머 | UZ-34502-59 | 유리 |
| 이소프로판올 | 써모피셔- 과학 | 396982500 | ≥ 99.0 |
| 인산염 완충액 식염수 | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| 피펫 팁 1,000 &마이크로; L | 써모피셔- 과학 | UZ-25001-76 | |
| 피펫 팁 10 mL | 써모피셔- 과학 | UZ-25001-83 | |
| 피펫 팁 200 &마이크로; L | 써모피셔- 과학 | UZ-25001-85 | |
| 피펫 팁 5 mL | 써모피셔- 과학 | UZ-25001-80 | |
| 피펫터 1,000 &마이크로; L | 콜-파머 | UZ-07909-11 | |
| 피펫터 10 mL | Cole-Parmer | UZ-07909-15 | |
| 피펫터 200 &마이크로; L | 콜-파머 | UZ-07909-09 | |
| 피펫터 5 mL | 콜-파머 | UZ-07859-30 | |
| 트립틱 소이 국물 | Millipore | 22091 | 미생물학에 적합 |
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