Method Article

액체와 얼음에서 바이러스 어셈블리의 고해상도 이미징 향상

DOI:

10.3791/63856

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July 20th, 2022

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1Department of Biomedical Engineering, Pennsylvania State University, 2Department of Materials Science and Engineering, McMaster University, 3Bioinformatics and Genomics Graduate Program, Huck Institutes of the Life Sciences, Pennsylvania State University, 4Molecular, Cellular, and Integrative Biosciences Graduate Program, Huck Institutes of the Life Sciences, Pennsylvania State University, 5Materials Research Institute, Pennsylvania State University, 6Huck Institutes of the Life Sciences, Pennsylvania State University, 7Applications team, Direct Electron, 8Application Scientist, Protochips, Inc., 9Department of Biology, Wake Forest University

In This Article

Retraction Notice

This article, Advancing High-Resolution Imaging of Virus Assemblies in Liquid and Ice, has been retracted at the request of the Editors-in-Chief due to concerns about the integrity of the data presented. These concerns included: (a) Figure 3 was found to contain noise without structural features expected for a protein capsid; (b) critical half-map data necessary to verify resolution claims were not deposited; (c) there was a lack of system logs or controls to rule out stage drift regarding observed movements in Figure 3; and (d) the absence of protocols to address Brownian motion and beam-induced drift significantly weakened the reliability of the findings.<br/><br/>The corresponding author's indication she principally relied on RMEASURE program did not sufficiently address the publisher's concerns. After consulting external experts, the Editors-in-Chief concluded that the issues remain unresolved, and the data do not meet JoVE's standards for scientific reliability and reproducibility, requiring retraction. The corresponding author disagrees with the grounds for retraction. Co-authors DiCecco, Grandfield and Bator agree with the retraction. Other co-authors were unavailable for comment.

Summary

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여기에서는 투과 전자 현미경을 사용하여 나노 스케일에서 액체-EM 및 Cryo-EM 분석에 적합한 바이러스 어셈블리를 준비하는 프로토콜에 대해 설명합니다.

Abstract

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과학자들이 이제 나노 스케일에서 실시간 프로세스를 관찰할 수 있게 되면서 액체 전자 현미경(액체-EM)에 대한 관심이 최근 몇 년 동안 급증했습니다. 많은 이벤트가 밀리초 범위 또는 더 빠른 시간 척도에서 발생하므로 고분해능 Cryo-EM 정보를 동적 관찰과 페어링하는 것이 매우 바람직합니다. 유연한 구조에 대한 향상된 지식은 SARS-CoV-2와 같은 신종 병원체와 싸우기 위한 새로운 시약의 설계에도 도움이 될 수 있습니다. 더 중요한 것은 유체 환경에서 생물학적 물질을 보는 것이 인체에서의 성능을 독특하게 엿볼 수 있다는 것입니다. 여기에 액체 및 유리질 얼음에서 바이러스 어셈블리의 나노 스케일 특성을 조사하기 위해 새로 개발 된 방법이 제시됩니다. 이 목표를 달성하기 위해 잘 정의된 샘플이 모델 시스템으로 사용되었습니다. 샘플 준비 방법과 대표적인 구조 정보의 나란히 비교가 제시됩니다. 서브 나노 미터 특징은 ~ 3.5-Å-10 Å 범위에서 분해 된 구조에 대해 표시됩니다. 이 보완적인 프레임워크를 뒷받침하는 다른 최근 결과에는 백신 후보에 대한 동적 통찰력과 액체로 이미지화된 항체 기반 치료법이 포함됩니다. 전반적으로 이러한 상관 응용 프로그램은 분자 역학을 시각화하는 능력을 향상시켜 인간의 건강과 질병에서 사용할 수 있는 고유한 컨텍스트를 제공합니다.

Introduction

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생물 의학 연구는 새로운 기술 개발을 통해 인간의 건강과 질병에 대한 이해를 향상시킵니다. 고해상도 이미징은 나노 세계에 대한 우리의 관점을 변화시키고 있으며, 세포와 분자를정교하게 1,2,3,4,5 연구할 수 있게 해줍니다. 연질 폴리머, 단백질 어셈블리 또는 인간 바이러스와 같은 동적 구성 요소의 정적 정보는 복잡한 내러티브의 제한된 스냅 샷 만 보여줍니다. 분자 개체가 어떻게 작동하는지 더 잘 이해하려면 구조와 기능을 공동으로 조사해야 합니다.

원자적으로 얇은 그래핀 또는 실리콘 기반 마이크로칩과 같은 재료 생산의 최근 발전은 투과 전자 현미경(TEM)을 사용한 실시간 구조 기능 분석을 위한 새로운 기회를 제공합니다. 이러한 재료는 라이브 EM 이미징 6,7,8,9,10,11을 위해 밀폐된 챔버를 생성할 수 있습니다.

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Protocol

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1. 액체-EM용 시편 홀더 적재

  1. 각 칩을 150mL의 아세톤에서 2분 동안 인큐베이션한 후 150mL의 메탄올에서 2분 동안 인큐베이션하여 질화규소(SiN) 마이크로칩을 세척합니다. 층류 기류에서 칩을 건조시킵니다.
  2. 아르곤 가스를 사용하여 30W, 15mA의 표준 조건에서 45초 동안 작동하는 글로우 방전 기기를 사용하여 건조된 칩을 플라즈마 청소합니다.
  3. 건조베이스 마이크로 칩을 시편 홀더의 팁에 넣습니다. ~0.2μL의 샘플(50mM hepes, pH 7.5, 150mM NaCl, 10mM MgCl2, 10mM CaCl2에서 0.2-1mg/mL의 바이러스 어셈블리)을 기본 칩에 추가합니다. 1-2분 인큐베이션 단계 후에, 샘플을 함유하는 습식 베이스 칩 상에 탑 칩을 놓는다.
  4. 어셈블리를 함께 고정하여 3개의 황동 나사로 기계적으로 제자리에 고정되는 밀폐된 인클로저를 형성합니다. 어셈블리를 밀봉하면 터보 펌핑 건식 펌핑 스테이션을 사용하여 팁을 10-6Torr 로 펌핑합니다. 이제 홀더를 TEM에 삽입할 준비가 되었습니다.
    알림: 셀렉트 홀더에는 냉각 기능이 없으며 Cryo-EM에는 사용되지 않습니다.

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Results

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모든 액체-EM 이미징 실험에는 200kV에서 작동하는 액체-TEM을 사용하였고, 모든 Cryo-EM 데이터 수집에는 300kV에서 작동하는 cryo-TEM을 사용하였다. 여러 바이러스의 대표적인 이미지와 구조를 제시하여 다양한 테스트 대상에 걸쳐 방법의 유용성을 입증합니다. 여기에는 재조합 아데노 관련 바이러스 아형 3(AAV), 환자 혈청에서 유래한 SARS-CoV-2 하위 바이러스 어셈블리, 유인원 로타바이러스 이중층 입자(DLP), SA11 균주가 포함됩니다. 먼저, 액체 완충액(50mM Hepes, pH 7.5; 150mM NaCl; 10mM MgCl2; 10mM CaCl2) 및 유리체 얼음(그림 3A-C; 보충 그림 2). 액체-EM 샘플은 SiN 기반 마이크로칩과 특수 시편 홀더를 사용하여 준비되었습니다. Cryo-EM 샘플은 표준 구.......

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Discussion

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Cryo-EM 분야에서 채택된 새로운 자동화 도구 및 기술을 사용하여 현재 액체-EM 워크플로우를 간소화할 수 있는 새로운 기회가 제시됩니다. 새로운 마이크로칩 샌드위치 기술과 관련된 응용 분야는 액체 또는 유리질 얼음에서 고해상도 이미징 분석을 가능하게 하기 때문에 다른 방법과 관련하여 중요합니다. 프로토콜에서 가장 중요한 단계 중 하나는 나노 스케일 수준에서 정교한 세부 사항을 시각화하기 위해 이상적인 액체 두께의 시편을 생산하는 것입니다. 이상적인 관심 영역은 자동화된 데이터 수집을 위한 고처리량 루틴을 구현하기 전에 전체 샘플을 스크리닝하여 더 낮은 배율로 식별됩니다. 액체 또는 얼음 표본에서 확인된 영역에 빔 손상 아티팩트가 포함되어 있거나 시각적으로 선명한 개별 입자를 식별하기에 너무 두꺼워 보이는 경우 데이터 수집에서 제외해야 합니다. 고해상도 데이터 수집의 한계에는 액체 샘플에서 빔 유도 운동과 브라운 운동이 포함됩니다. Cryo-EM 분석법은 생물학적 시료의 움직임을 최소화하는 것을 목표로 합니다. 그러나 모션 .......

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Disclosures

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저자는 경쟁하는 재정적 이해 관계가 없다고 선언합니다. 저자 인 Madeline J. Dressel-Dukes는 Protochips, Inc.의 직원이며 Michael Spilman은 DirectElectron의 직원입니다.

Acknowledgements

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저자는 정제 된 AAV-3를 제공 한 Luk H. Vandenberghe 박사 (하버드 의과 대학 안과학과)를 인정합니다. 이 연구는 국립 보건원과 국립 암 연구소 (R01CA193578, R01CA227261, R01CA219700에서 DFK까지)의 지원을 받았습니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
아세톤피셔 사이언티픽  A11-11
오토로더 클리핑 도구ThermoFisher Scientific해당 사항없음 SubAngstrom 공급업체
오토로더 그리드 클립ThermoFisher ScientificN/A상단 및 하단 클립
탄소 코팅 금 EM 그리드Electron Microcopy SciencesCF400-AU-50400메시, 5nm 두께
COVID-19 환자 혈청RayBiotechCoV-Pos-S-500PCR+ 혈청 500마이크로리터
메탄올Fisher Scientific  A412-11 리터
Microwell-integrad 마이크로 칩Protochips, Inc.EPB-42A1-1010x10mm 창 어레이
TEMWindows 마이크로칩Simpore Inc.SN100-A10Q33B9개의 대형 창, 10nn 두께
의 TEMWindows 마이크로칩Simpore, Inc. SN100-A05Q33A9 개의 작은 창, 5nm 두께
상단 마이크로 칩Protochips, Inc.EPT-50W500 mm x 100 mm 창
Whatman #1 여과지Whatman1001 090100개, 90 mm
Equipment 
DirectView 직접 전자 검출기직접 전자6미크론 픽셀 간격
Falcon 3 EC 직접 전자 검출기ThermoFisher Scientific14미크론 픽셀 간격
Gatan 655 건식 펌프장Gatan, Inc.  펌프 홀더 팁을 10-6 range
Mark IV VitrobotThermoFisher Scientific최첨단 표본 준비 장치 
PELCO easiGlø, 글로우 토출 장치Ted Pella, Inc.  음극 모드
포세이돈 선택 표본 홀더Protochips, Inc.  FEI 호환; 시편 홀더
Talos F200C TEMThermoFisher Scientific200 kV; 액체-TEM
타이탄 Krios G3ThermoFisher Scientific300kV; Cryo-TEM
무료로 사용 가능한 소프트웨어웹사이트 링크코멘트 (선택 사항)
cryoSPARChttps://cryosparc.com/기타 이미지 처리 소프트웨어
CTFFIND4https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4CTF 탐지 프로그램
MotionCorr2
RELIONhttps://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php?title=Main_Page
SerialEMhttps://bio3d.colorado.edu/SerialEM/
UCSF Chimerahttps://www.cgl.ucsf.edu/chimera/분자 구조 분석 소프트웨어 패키지
리터 의 https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software

References

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  1. Deng, W., et al. Assembly, structure, function and regulation of type III secretion systems. Nature Reviews Microbiology. 15 (6), 323-337 (2017).
  2. Oikonomou, C. M., Chang, Y. -W., Jensen, G. J. A new view into prokaryotic cell biolo....

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