구심성 시냅스 구조 및 모발 세포를 면역표지하고, 노화된 조직에서 자가형광을 담금질하고, 달팽이관의 길이를 해부 및 추정하고, 공초점 영상으로 얻은 이미지 스택에서 시냅스를 정량화함으로써 젊은 성인 및 노인 게르빌 달팽이관을 처리하기 위한 프로토콜이 제시된다.
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이 논문에서
요약
초록
내부 모발 세포와 구심성 청각 신경 섬유를 연결하는 리본 시냅스의 손실은 연령 관련 청력 손실의 한 원인으로 간주됩니다. 리본 시냅스의 손실을 검출하는 가장 일반적인 방법은 개별 달팽이관의 여러 토노토픽 위치에서 정량적 샘플링을 허용하기 때문에 면역 표지입니다. 그러나 관심있는 구조는 뼈 달팽이관 깊숙이 묻혀 있습니다. Gerbils는 연령 관련 청력 손실에 대한 동물 모델로 사용됩니다. 여기에서는 고정, 게르빌 달팽이관 전체 마운트, 공초점 이미징 및 리본 시냅스 수 및 부피 정량화를 위한 일상적인 프로토콜이 설명된다. 또한, 귀중한 노화 된 개인으로부터 좋은 재료를 얻는 것과 관련된 특별한 도전이 강조됩니다.
Gerbils는 안락사되어 심혈관적으로 관류되거나 고막 bullae가 두개골에서 조심스럽게 해부됩니다. 달팽이관은 정점과 기저부에서 열리고 고정제로 직접 옮겨집니다. 초기 방법에 관계없이, 달팽이관은 후고정되고 이후에 탈석회화됩니다. 그런 다음 조직은 시냅스 전후 구조 및 모발 세포에 대한 일차 항체로 표지됩니다. 다음에, 달팽이관은 그들의 각각의 일차 것들에 특이적인 이차 형광 태깅된 항체와 함께 인큐베이션된다. 노화 된 gerbils의 달팽이관은 자기 형광 소광기로 처리되어 오래된 동물 조직의 전형적으로 실질적인 배경 형광을 줄입니다.
마지막으로, 달팽이관은 6-11 개의 세그먼트로 해부됩니다. 전체 달팽이관 길이는 특정 달팽이관 위치가 개인간에 안정적으로 결정될 수 있도록 재구성됩니다. 순차적으로 획득된 공초점 이미지 스택은 선택한 위치에서 모발 세포와 시냅스를 시각화하는 데 도움이 됩니다. 공초점 스택은 디컨볼루브되고 시냅스는 ImageJ를 사용하여 수동으로 계산되거나 Matlab에서 사용자 정의 작성된 이미지 분석 절차를 사용하여 시냅스 구조의보다 광범위한 정량화가 수행됩니다.
서론
연령 관련 난청은 65세 이상 1세 이상 세계 인구의 3분의1 이상에 영향을 미치는 세계에서 가장 널리 퍼진 질병 중 하나입니다. 근본적인 원인은 여전히 논쟁 중이며 적극적으로 조사되고 있지만 구심성 청각 신경 섬유2와 내부 모발 세포 (IHC)를 연결하는 특수 시냅스의 손실을 포함 할 수 있습니다. 이러한 리본 시냅스는 신경 전달 물질 글루타메이트로 채워진 소포뿐만 아니라 시냅스 후 α-아미노-3-히드록시-5-메틸-4-이속사졸프로피온산(AMPA) 글루타메이트 수용체 3,4,5로 채워진 소포를 갖는 시냅스 전 구조를 포함한다. 게르빌에서, ~20개의 구심성 청각 신경 섬유가 하나의 IHC 6,7,8에 접촉한다. 모디올러스를 향하는 IHC 상의 섬유는 큰 시냅스 리본과 반대되는 반면, IHC의 기둥 측에 연결되는 섬유는 작은 시냅스 리본(즉, 고양이
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프로토콜
모든 프로토콜과 절차는 독일 니더작센주의 관련 당국에 의해 승인되었으며, 허가 번호는 AZ 33.19-42502-04-15/1828 및 33.19-42502-04-15/1990입니다. 이 프로토콜은 남녀 모두의 몽골 게르빌 (M. unguiculatus)을위한 것입니다. 젊은 성인은 3-12 개월의 나이를 말하며, gerbils는 36 개월 이상에서 노인으로 간주됩니다. 달리 언급되지 않은 경우, 완충액 및 용액을 제조하고 최대 수개월 (4-8 °C) 동안 냉장고에 저장할 수 있습니다. 사용하기 전에 버퍼와 용액이 침전되지 않았는지 확인하십시오.
1. 고정 및 장기 수집
참고 : 달팽이관 만 필요한 경우 침수로 다소 간단한 고정 절차를 수행하는 것이 좋습니다. 그러나 잘 보존 된 뇌가 필요하다면 심질 관류가 유일한 옵션입니다. 두 경우 모두 고정제는 인산완충식염수(PBS) 중의 4% 파라포름알데히드(PFA)이다. 이것은 신선하게 만들어야하지만 사용할 때까지 냉동 보관할 수 있습니다. 심질 관류를 위해 ~ 300 mL의 분취량을 사용하거나 달팽이관 당 ~ 50-100 mL의 분취량을 사용하여 침지하여 고정하십시오.
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결과
달팽이관은 전체 동물의 고정으로 심혈관 관류 후 수확하거나 동물을 안락사시키고 침지 고정 한 후 신속하게 해부했습니다. 후자의 방법으로, IHCs는 해부 동안 제자리에 머물렀고, 반면, 관류가 실패하여 조직이 불충분하게 고정 된 경우, 감각 상피는 종종 파괴되었습니다. 저자들은 뇌의 고정이 여전히 적절하면서 심질 관류 후 달팽이관의 고정이 불충분 한 경우에 직면했습니다. 열등한 관류로부터의 조직은 달팽이관 정점과 기저부에 구멍을 열고 2 일 동안 4 % PFA에 침지하여 달팽이관을 포스트 고정함으로써 여전히 절약 될 수 있습니다.
전체 달팽이관의 길이 결정은 뚜렷한 특성 주파수와 동등한 특정 달팽이관 위치에서 IHCs 및 그들의 시냅스를 평가하기 위해 뮐러25 에 따라 수행되었다 (표 1). 이를 위해, 원하는 달팽이관 위치는 달팽이관 염기로부터의 바질라 막 길이의 백분율로서 계산되었다. 젊은 성인 gerb.......
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토론
이 프로토콜에 설명 된 방법을 사용하면 젊은 성인 및 노인 게르빌의 달팽이관에서 IHC 및 시냅스 구조를 면역표지하고, 시냅스 전후 및 사후 시냅스 요소의 공동 국소화를 통해 추정 된 기능적 시냅스를 확인하고, 개별 IHC에 할당하고, 수, 부피 및 위치를 정량화 할 수 있습니다. 이 접근법에 사용된 항체는 또한 외부 모발 세포 (OHCs; myoVIIa) 및 그들의 시냅스 전 리본을 표지하였다. 또한, IHC와 OHC 모두의 면역 표지에 대한 실행 가능한 대안은 오토 페린에 대한 항체이며, OHC는 IHC보다 훨씬 희미하게 보입니다.
관류는 두 가지 다른 설정을 사용하여 수행될 수 있다. 1) 상업용 드립 라인을 먹이는 단일 병이 동물 위 약 1.5m 높이의 풀리 휠에 매달려있는 중력 공급 드립 라인 시스템. 유체는 상단에서 열려있는 병을 낮춘 후에 연속적으로 도입됩니다. 2) 디지털 가변 속도 연동 펌프를 사용하는 시스템으로, 한쪽 끝에는 얇고 긴 튜브가 열려 유체를 흡입하고.......
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공개 사항
저자는 선언 할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
저자들은 Lichun Zhang이 이미징 시설의 사용을 위해 Oldenburg의 Carl von Ossietzky University of Oldenburg의 Fluorescent Microscopy Service Unit과 방법을 수립하는 데 도움을 준 것을 인정합니다. 이 연구는 독일의 우수성 전략 -EXC 2177/1에 따라 Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation)가 자금을 지원했습니다.
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참고문헌
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- Heeringa, A. N., Koeppl, C. The aging coch....
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