Entomopathogenic Nematodes 배양 및 유전자 조작

요약

Entomopathogenic 선충류는 박테리아와 공생하며 함께 선천적 인 면역 체계를 손상시켜 곤충을 성공적으로 감염시킵니다. 선충류 감염의 유전 적 기초에 대한 연구를 촉진하기 위해 엔토모 병원성 선충류를 유지하고 유 전적으로 조작하는 방법이 설명됩니다.

초록

Heterorhabditis 및 Steinernema 속의 Entomopathogenic 선충류는 토양에 사는 곤충의 의무적 인 기생충입니다. 그들의 수명주기의 주요 특징은 박테리아 Photorhabdus 및 Xenorhabdus와의 상호 연관성입니다. 선충류 기생충은 적절한 곤충 숙주를 찾아 진입하고, 곤충 면역 반응을 전복시키고, 효율적으로 번식하여 새로운 곤충 먹이를 적극적으로 사냥하여 감염시킬 다음 세대를 생산할 수 있습니다. 수명주기의 특성으로 인해 엔토모 병원성 선충류는 파괴적인 농업 곤충 해충을 방제하기 위해 살충제와 함께 사용되는 인기있는 생물학적 방제제입니다. 동시에,이 기생 선충류는 선충류 병원성을 분석하고 항 선충류 반응을 숙주로하는 연구 도구를 나타냅니다. 이 연구는 감염 동안 선충류 분비 분자의 역할을 이해하기위한 유전 기술 및 전사 학적 접근법의 최근 개발에 의해 도움을받습니다. 여기에서, 엔토모병원성 선충류를 유지하고 유전자 녹다운 절차를 사용하는 것에 대한 상세한 프로토콜이 제공된다. 이러한 방법론은 엔토모병원성 선충류 감염 인자의 기능적 특성화를 더욱 촉진한다.

서론

entomopathogenic nematodes (EPN)에 대한 연구는 통합 해충 관리 전략에서 이러한 기생충의 유용성과 기본 생물 의학 연구 ^1,2에 대한 참여로 인해 지난 몇 년 동안 강화되었습니다. 최근 연구들은 EPN을 감염 과정의 여러 단계에서 활성화되는 선충류 유전 성분을 검사하는 모델 유기체로 확립했다. 이 정보는 숙주 생리학을 변화시키고 곤충 선천적 면역 반응을 불안정하게 하기 위해 기생충에 의해 분비되는 분자의 성질 및 수에 대한 중요한 단서^{를 제공한다(3,4}). 동시에,이 지식은 일반적으로 곤충 숙주 면역 신호 전달 경로의 유형과 병원균 ^5,6의 진입 및 확산을 제한하기 위해 규제하는 기능에 대한 새로운 세부 사항에 의해 보완됩니다. 이러한 과정을 이해하는 것은 EPN과 곤충 숙주 간의 역동적 인 상호 작용의 양면을 구상하는 데 중요합니다. EPN-곤충 숙주 관계에 대한 더 나은 인식은 의심 할 여지없이 포유류 기생 선충류와의 유사한 연구를 촉진 할 것이며, 이....

프로토콜

1. 공생선충류 감염성 청소년의 생산

1. 페트리 접시 (10cm)를 여과지로 덮고 약 10-15 마리의 갤러리아 멜로 넬라 유충을 첨가하십시오 (그림 1A).
2. 피펫을 사용하여 현탁액 10 μL 당 약 25-50 IJ를 함유하는 물 2 mL를 왁스 웜 상에 분주한다. 페트리 접시를 실온에서 캐비닛에 보관하십시오.
3. 여과지의 습기에 따라 2 일마다 1-2 mL의 물을 첨가하십시오. IJ에 감염된 왁스 웜은 일반적으로 48 시간 이내에 사망합니다.
4. 왁스웜이^{IJs 8}에 감염된 후 약 10일 후에 White의 물 트랩을 준비합니다(그림 1B,C). 죽은 곤충을 여과지의 흠뻑 젖지 않은 부분으로 조심스럽게 옮기십시오. 수돗물을 사용하여 바닥 페트리 접시를 채우고 환기를위한 스페이서로 15 mL 튜브의 캡을 놓습니다.
5. 부드럽고 깨지기 쉬운 왁스 웜을 한 쌍의 플라스틱 포셉을 사용하여 여과지에서 천천히 들어 올려 조심스럽게 옮깁니다. 탈염수 또는 탈이온수 대신 수돗물을 사용하십시오. 후자는 선충류 응....

결과

축삭화를 거친 H. 박테리오포라 선충류의 상태를 평가하기 위해, IJs에서 P. luminescens 박테리아 콜로니의 존재 또는 부재를 결정하였다. 이를 위해, PBS에서 이전에 표면 멸균 및 균질화되었던 대략 500개의 IJs의 펠릿을 수집하였다. 양성 대조군 처리는 공생 P. 발광 박테리아를 함유하는 선충류 배양물로부터의 대략 500 IJs의 펠릿으로 구성되었다. 축삭 및 양성 대조군 선충류의 펠렛을 1x PBS에서 균질화하였다. 균질액을 한천 상에 피펫팅하고 개별 콜로니의 성장을 촉진하기 위해 퍼뜨렸다. 한천 플레이트를 24시간 동안 28°C에서 인큐베이션하였다. 다음날, P. luminescens 콜로니(CFU)의 발생이 관찰되었다. 예상한 바와 같이, 스톡 배양물로부터의 H. 박테리오포라는 공생 P. 루미네세켄스 세포를 운반하고; 그러나, 그들의 연관된 P. 루미네센 박테리아가 없는 선충류는 축삭이었고 미래.......

토론

엔토모병원성 선충류 감염 및 곤충 항선충류 면역의 분자 기초를 이해하려면 상호 연관된 박테리아 ^13,15,16으로부터 기생충의 분리가 필요하다. 엔토모병원성 선충류 H. bacteriophora 및 S. carpocapsae는 각각 그람 음성 박테리아 P. luminescens 및 X. nematophila와 함께 살며,¹⁷. 두 박테리아 종 모두 이전에 곤충 조직을 표적으로 삼고 감염^18,19 동안 선천적 인 면역 체계를 상쇄함으로써 병원성을 부여하는 요인을 인코딩하는 것으로 나타났습니다. 이것은 선충류가 곤충 숙주와 상호 작용하기 위해 진화 한 전략을.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Agarose	VWR	97062-244
Ambion Megascript T7 Kit	Thermo Fisher Scientific	AM1333
Ampicillin	Fisher Scientific	611770250
배양 플라스크 T25	Fisher Scientific	156367
배양 플라스크 T75	Fisher Scientific	156499
ChoiceTaq Mastermix	Denville Scientific	C775Y42
Corn oil	VWR	470200-112
Corn syrup	MP Biomedicals/VWR	IC10141301
Culture tube 10 mL	Fisher Scientific	14-959-14
Eppendorf Femtotips Microloader Tips	Eppendorf	E5242956003
Ethanol	Millipore-Sigma	E7023
Falcon tube 50 mL	Fisher Scientific	14-432-22
Femtojet Microinjector	Eppendorf	5252000021
Filter paper	VWR	28320-100
Galleria mellonella waxorms	Petco-Glass
coverslip	Fisher Scientific	12-553-464	50 x 24 mm
할로카본 오일 700	Sigma	H8898
접종 루프	VWR	12000-806
Kanamycin	VWR	97062-956
Kwik-Fil 붕규산 유리 모세 혈관 세계	정밀 기기	1B100F-3	1.0 mm
LB 한천	Fisher Scientific	BP1425-500	LB 한천 밀러 분말 500 g
LB 육수	Fisher Scientific	BP1426-500	LB 육수 밀러 파우더 500g
Leica DM IRB 도립 연구 현미경	현미경 중앙	맥
콩키 매체	Millipore-Sigma	M7408-250G
MEGAclear 전사 클린업 키트	Thermo Fisher Scientific	AM1908
마이크로 원심분리기 튜브	VWR	76332-064	1.5ml
NanoDrop 2000 분광 광도계	Thermo Fisher Scientific	ND-2000
바늘 주사기	VWR	BD305155	22G
영양 국물	Millipore-Sigma	70122-100G
파라필름	VWR	52858-076
분할 페트리 접시	VWR	490005-212
PBS	VWR	97062-732	버퍼 PBS 정제 생명공학 등급 200 탭
PCR 프라이머	Azenta-Pestle
	Millipore-Sigma	BAF199230001	Bel-Art 일회용 유봉
페트리 접시 6cm	VWR	25384-092	60 x 15mm
페트리 접시 10mm	VWR	10799-192	35 x 10mm
프로테오스 펩톤 #3	Thermo Fisher Scientific	211693
효모	Millipore-Sigma	Y1625

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