Method Article

미세 유체 공학 및 형광 현미경을 사용하여 단일 액틴 필라멘트 및 번들의 조립 역학 연구

DOI:

10.3791/63891

⸱

May 5th, 2022

 ,  ,  ,  , 
1Université Paris Cité, CNRS, Institut Jacques Monod

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 형광 현미경과 함께 간단한 액틴 필라멘트 미세 유체 분석을위한 프로토콜을 제시하여 개별 액틴 필라멘트를 실시간으로 정확하게 모니터링하면서 순차적으로 다른 단백질 용액에 노출 할 수 있습니다.

Abstract

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액틴 필라멘트의 조립 및 분해를 조절하는 복잡한 분자 메커니즘을 해독하기 위해서는 잘 조절 된 조건에서 개별 반응을 모니터링하는 것이 큰 자산입니다. 이를 위해 지난 20 년 동안 살아있는 단일 필라멘트 실험이 등장했으며, 대부분 총 내부 반사 형광 (TIRF) 현미경을 사용하여 주요 결과를 제공했습니다. 2011년에는 이러한 실험의 가능성을 더욱 확대하고 문제가 되는 아티팩트가 반복되는 것을 피하기 위해 이러한 분석에서 간단한 미세유체학을 도입했습니다. 이 연구는 개별 액틴 필라멘트가 패시베이션 커버슬립 표면에 한쪽 끝으로 고정되고 흐름과 일치하며 다양한 단백질 솔루션에 연속적으로 노출 될 수있는 우리의 기본 프로토콜을 자세히 설명합니다. 우리는 또한 특정 응용 분야에 대한 프로토콜을 제시하고 흐르는 솔루션의 점성 드래그 덕분에 제어 된 기계적 힘을 어떻게 적용 할 수 있는지 설명합니다. 우리는 이러한 실험의 기술적인주의 사항을 강조하고이 기술을 기반으로 가능한 개발을 간략하게 제시합니다. 이러한 프로토콜 및 설명은 오늘날 사용하기 쉬운 미세 유체 공학 장비의 가용성과 함께 비 전문가가 실험실에서이 분석을 구현할 수 있도록해야합니다.

Introduction

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액틴 필라멘트 및 액틴 필라멘트 네트워크의 조립 및 분해는 여러 생화학 반응에 의해 제어되며 기계적 맥락에 따라 달라집니다. 이러한 복잡한 메커니즘에 대한 통찰력을 얻기 위해서는 개별 필라멘트에 대한 개별 반응을 관찰 할 수있는 것이 매우 중요합니다 (충분히 많은 수로). 지난 수십 년 동안, 주로 총 내부 반사 형광 (TIRF) 현미경을 사용하여 실시간으로 동적 액틴 필라멘트를 관찰하는 것이 핵심 기술로 부상했으며 벌크 용액 생화학 적 분석1로는 얻을 수 없었던 인상적인 결과 목록을 제공했습니다.

이를 달성하기 위해서는 형광 표지 된 액틴 필라멘트를 현미경 커버 슬립의 표면에 가깝게 유지하면서 형광 표지 될 수있는 액틴 결합 단백질 (ABPs)의 용액에 노출시켜야합니다. 이렇게 하면 잘 조절된 생화학적 조건에서 개별 필라멘트에서 발생하는 이벤트를 모니터링하여 반응 속도를 정량화할 수 있는 수단이 제공됩니다. 그러나 여러 가지 특정 제한 사항을 고려해야 합니다. 필라멘트를 표면에 가깝게 인위적으로 유지하면, 종종 다수의 앵커링 포인트 덕분에 또는 메틸셀룰로스와 같은 크라우집제(crowding agent)를 사용함으로써, 이들의 거동을 변경할 수 있다(예를 들어, 이들의 중합 및 탈중합에서 정지를 야기....

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Protocol

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1. 미세 유체 챔버 준비

  1. 여러 챔버 패턴이있는 SU-8 마스터 몰드를 선택하십시오. 일반적인 챔버는 세 개의 입구와 하나의 출구, 높이 20μm, 너비 800μm의 십자형입니다(그림 1). 이러한 마스터 몰드는 외부 회사로부터 구입하거나 학술 실험실에서 제조할 수 있다(예를 들어, Gicquel, Y. et al.5).
  2. 테이프를 몰드의 가장자리 주위에 놓습니다.
    1. 길이 50cm, 너비 19mm, 표준 투명 사무용 테이프( 재료 표 참조)를 벤치에 놓고 끈적끈적한 면을 위로 향하게 합니다. 몰드를 테이프의 한쪽 끝과 중간 선을 따라 수직으로 놓습니다.
    2. 몰드를 테이프의 다른 쪽 끝으로 굴려 몰드 주위에 1cm 테두리를 만듭니다. 테이프를 몰드 바닥 위로 접습니다.
  3. 폴리디메틸실록산(PDMS) 용액을 준비한다.
    1. 일회용 계량 접시에 25-30g의 PDMS 베이스 (재료 표)를 직접 부으십시오. 일회용 플라스틱 파스퇴르 피펫으로 10 중량 / 중량 PDMS 경화제 (재료 표

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Results

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위에서 설명한 모든 실험에서 형광으로 표지된 액틴 필라멘트는 표면에서 낮은 배경 형광을 나타내는 양호한 대비와 함께 명확하게 볼 수 있어야 합니다(그림 4, 일반적인 문제 해결을 위한 보충 파일 1 참조). 액틴 필라멘트는 또한 표면에 달라 붙지 않아야합니다 : 지배적 인 유속이 낮을 때, 액틴 필라멘트의 측면 변동은 살아있는 것을 관찰 할 때 인식 할 수 있어야하며 그들이 끝 중 하나에만 고정되어 있음을 명확하게 결정할 수 있어야합니다. 마찬가지로, TIRF 이미징을 사용할 때 수직 변동은 길이와 시간에 따른 강도의 변화로 볼 수 있어야 합니다. 적용된 유량에 따라 TIRF에 의해 획득된 액틴 필라멘트의 이미지 품질을 최적화하기 위해 TIRF 침투 깊이를 조정해야 할 수도 있습니다.

필라멘트를 중합 조건에 노출시킬 때(섹션 8 참조), 필라멘트 신장은 규칙적이어야 한다(즉, 필라멘트의 끝에서의 .......

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Discussion

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액틴 필라멘트가 길이를 따라 여러 지점에 의해 표면에 고정되거나 메틸 셀룰로오스와 같은 크라우드 링제에 의해 그 가까이에 유지되는 표준 단일 필라멘트 방법과 비교할 때, 미세 유체학은 많은 이점을 제공합니다. 표면과의 상호작용이 최소화됨에 따라, 인위적인 일시정지는 신율 및 탈중합 둘 다 회피되는 동안 유도할 수 있다. 필라멘트는 흐름에 의해 정렬되고 서로 평행하여 모니터링과 길이 측정을 용이하게합니다. 필라멘트 주변의 용액은 지속적으로 갱신되어 일정한 단백질 농도에 노출됩니다. 필라멘트가 노출되는 다른 단백질 용액 사이를 신속하게 전환 할 수 있기 때문에 (<1 초, 그림 3D, E) 시간 제어 순차적 실험을 수행 할 수 있으며 이는 종종 운동 연구에 도움이됩니다. 마지막으로, 필라멘트 상의 유동 용액에 의해 가해지는 점성 항력은 필라멘트에 제어된 기계적 응력을 가하기 위해 이용될 수 있다(대표적인 결과 섹션). 적당한 유체 흐름 (

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Disclosures

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저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

Acknowledgements

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우리는 B. Ladoux와 R.-M.에게 감사드립니다. UV-cleaner 장비를 사용하는 Mège 실험실과 J. Heuvingh 및 0. du Roure는 실리콘 웨이퍼에서 금형을 준비하고 미세 유체 공학에 대한 팁을 제공하는 초기 교육을 받았습니다. 우리는 유럽 연구위원회 그랜트 StG-679116 (A.J.) 및 Agence Nationale de la Recherche Grants Muscactin and Conformin (G.R.-L.)의 기금을 인정합니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
β-CaseinMerckC69058 mg/mL
생검 펀치에서 사용(플런저 포함)Ted Pella15115-2ID 0.75 mm, OD 1.07 mm
비오틴-BSAMerckA85491 mg/mL에서 사용
BSAMerckA802250 mg/mL
커버슬립 Mini-Rack
테프론 홀더		InvitrogenC14784for 8 커버
슬립 커버슬립 22x40mm
두께 #1.5		Menzel Glä ser631-1370
DABCOMerckD27802구성 요소, f-버퍼
DTTEuromedex,EU0006-D구성 요소, F-버퍼
Ester NHS Alexa Fluor 488InvitrogenA20000Fluorophore, Lys328의 액틴 라벨링용.
EZ-Link Sulfo-NHS-BiotinThermo Scientific21338To biotinylate actin on Lys328
Hellmanex IIIHellma9-307-011-4-507유리 세척 세제
ImageJNIHN/A오픈 소스 소프트웨어
LaboportKNF811kn.18진공 펌프(궁극의 진공: 240mbar)
매직 인비저블 테이프스카치7100024666표준 투명 사무용 테이프
MicrewtubeSimportT341-6T2mL 미세유체 저장소 튜브
미세유체 장치 파트 1: 플로우 유닛 S플루이젠트FLU-S-D-PCKB유량계
미세유체 장치 파트 2: Fluiwell-4C-2 mL플루이젠14002001PCK리저버 홀더
미세유체 장치 파트 3: MFCS-EZ플루이젠EZ-11000001
EZ-00345001		압력 컨트롤러
Model 42 - UVO-CleanerJelight Inc.42-220자외선 세정제
N6-(6-Aminohexyl)-ATP-ATTO-488Jena BioscienceNU-805-488ATP-ATTO는 액틴
뉴트라비딘Thermo Scientific31000
PLL-PEGSuSoSPLL(20)-g[3.5]- PEG(2)PBS에서 1mg/mL로 사용합니다.
폴리디메틸실록산(PDMS) 실가드 184 실리콘 엘라스토머다우코닝1673921PDMS 베이스 및 경화제
폴리에테르에테르케톤(PEEK) 튜빙머크Z226661 푸른색" : I.D. = 0.25 mm
안전 블로우 건코일호스 공압식700-S여과 공기
실리콘 튜빙VWR228-0701PPEEK를 커플러에 연결
스테인리스강 카테터 커플러Prime BioscienceSC22/15PEEK 튜브에 연결하기 위해 PDMS 입구 및 배출구에 삽입
열가소성 필름Sigma AldrichPM996표준 "파라필름"
초순수 에탄올VWR64-17-5
초음파 세척 수조VWRUSC200TH1L 비커를 수용하기 위해
진공 건조제SP Bel-ArtF42022-0000으로 PDMS 또는 용액을 탈기합니다.
, 트 트 라벨링에 사용 함유"됨

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wioland, H., Jégou, A., Romet-Lemonne, G. Celebrating 20 years of live single-actin-filament studies with five golden rules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (3), 2109506119(2022).
  2. Kuhn, J. R., Pollard, T. D.

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