컴퓨터 수치 제어 자기 나노 입자 기반 면역 분석에 대한 엇갈린 제한이있는 미세 유체 아크릴 장치의 마이크로 밀링

Summary

미세 유체 공학은 진단 테스트 개발을위한 강력한 도구입니다. 그러나 값비싼 장비와 재료, 힘든 제조 및 취급 기술이 필요한 경우가 많습니다. 여기에서는 저비용 및 사용이 간편한 환경에서 자성 마이크로 및 나노 입자 기반 면역 분석을위한 아크릴 미세 유체 장치의 제조 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다.

Abstract

미세 유체 시스템은 면역 분석 기술을 크게 향상 시켰습니다. 그러나 많은 미세 가공 기술에는 전문적이고 비싸거나 복잡한 장비가 필요하므로 제조 비용이 많이 들고 대량 생산과 양립 할 수 없으며, 이는 자원이 부족한 환경에서 현장 진료 테스트 (POCT)를 채택하기위한 가장 중요한 전제 조건 중 하나입니다. 이 작업은 컴퓨터 수치 제어 (CNC) 마이크로 밀링 기술을 사용하여 나노 입자 접합 효소 면역 분석 테스트를위한 아크릴 (폴리 메틸 메타 크릴 레이트, PMMA) 장치의 제조 공정을 설명합니다. 미세유체 장치의 기능은 100 nm 자성 나노입자에 접합된 모델 항원으로서 라이소자임을 사용하여 상용 항체를 검출하기 위한 면역검정을 수행함으로써 나타난다. 이 장치는 높이가 5μm에 불과한 물리적 엇갈린 제한을 통합하여 외부 자석을 배치하여 자기 트랩을 구성하는 자성 미세 입자를 포착하는 데 사용됩니다. 이러한 방식으로, 공액 나노 입자의 면역 지지체에 대한 자기력은이를 포착하고 유동 항력에 저항하기에 충분합니다. 이 미세유체 장치는 면역분석 성능을 위한 정밀도의 손실 없이 저비용 대량 생산에 특히 적합합니다.

Introduction

최근 몇 년 동안 미세 유체 공학은 면역 분석 기술¹에서 중요한 역할을했습니다. 소형화 기술은 기존 면역분석법에 비해 시료 및 시약 소비 감소, 배양 시간 단축, 효율적인 용액 교환, 높은 통합^{및 자동화 2}와 같은 많은 뛰어난 이점을 가지고 있습니다.

또한, 면역 분석의 미세 유체 시스템은 면역 지원체로서 자성 나노 입자와 결합하여 배양 시간을 상당히 단축시켜 증가 된 표면 대 부피 비율로 인해 높은 검출 감도를 달성합니다³. 입자의 브라운 운동은 항원-항체 복합체 ^4,5의 형성 동안 반응 동력학을 향상시킵니다. 또한, 나노입자의 자기적 특성은 다양한 미세유체 장치 구성에 통합될 수 있는 다기능성을 제공하여 소형화된 온칩 바이오^{감지 시스템5}에서 신호 전달 및 분자 포획에 이상적인 후보가 됩니다. 그러나, 자기력은 높은 표면 대 부피 비율⁶로 인해 나노 미터 규모의 항력보다 현저히 약하다. 따라서 세척 및 검출과 같은 중요한 면역 분석 단계를 위해 나노 입자를 포획하는 것은 어려울 수 있으며 기존의 자석으로는 충분하지 않습니다⁴.

나노입자를 조작하는 효율적인 방법은 미세^{유체 구조(}3)로 포장되어 있는 철 미세입자에 의해 형성된 미세유체 자기 트랩을 사용하는 것이다. 따라서 외부 자석이 접근하면 자화된 다공성 매질 내에서 자기력과 자속력 사이에 복잡한 상호 작용이 생성됩니다. 나노 입자에 작용하는 자기력은이를 포착하고 유동 항력 ^3,4,7에 저항 할만큼 충분히 강합니다. 이 접근법은 마이크로 입자를 유지하는 마이크로 메트릭 구조를 생성하기 위해 몇 마이크로 미터 정도의 해상도를 달성하는 미세 가공 기술이 필요합니다.

현재의 미세가공 기술은 수 미크론에서 수백 나노미터까지의 구조물의 고해상도 제조를 가능하게 한다(⁸). 그러나 이러한 기술 중 상당수는 전문적이고 비싸거나 복잡한 장비가 필요합니다. 주요 어려움 중 하나는 금형 제작을위한 클린 룸에 대한 요구 사항으로, 비용과 시간이 많이 소요됩니다 ^8,9. 최근에, 미세유체 공학자들은 비용 절감, 더 빠른 처리 시간, 더 저렴한 재료 및 도구,^{향상된 기능성 8}과 같은 다양한 이점을 갖는 다양한 대체 제조 방법을 개발함으로써 이러한 단점을 극복하고 있다. 이러한 방식으로 새로운 미세 가공 기술의 개발은 10 μm⁸의 낮은 분해능을 달성하는 저비용의 비 클린 룸 방법을 가져 왔습니다. 패터닝은 값비싼 성형 패턴을 생성하지 않고 기판 상에 직접 사용할 수 있으므로 시간이 많이 소요되는 공정을 피할 수 있습니다. 직접 제조 방법에는 CNC 밀링, 레이저 제거 및 직접 리소그래피⁸이 포함됩니다. 이러한 모든 방법은 경도9에 관계없이 광범위한 재료에서 높은 종횡비 채널을 생성하는 데^{적합하며,} 미세^{유체 장치8}에서 새롭고 유리한 형상, 물리적 거동 및 품질을 가능하게 합니다.

CNC 마이크로 밀링은 기판에서 벌크 재료를 제거하는 절삭 공구를 사용하여 마이크로 스케일 구조를 생성하며 미세 유체 장치^(10,11)를위한 효과적인 제조 방법입니다. 마이크로밀링 기술은 미세 유체 응용 분야에서 작업 표면에 직접 마이크로 채널과 피처를 생성하는 데 유용할 수 있으며, 주요 이점을 제공합니다: 짧은 시간(30분 미만)에 공작물을 제작할 수 있어 설계에서 프로토타입¹²까지의 처리 시간을 크게 단축할 수 있습니다. 또한 다양한 재료, 크기 및 모양의 절단 액세서리를 광범위하게 사용할 수 있기 때문에 CNC 밀링 머신은 다양한 유형의 저비용 일회용 재료에서 다양한 기능을 제작할 수 있는 적합한 도구입니다¹³.

마이크로 밀링에 일반적으로 사용되는 모든 재료 중에서 열가소성 수지는 많은 유리한 특성과 생물학적 응용 분야와의 호환성^10,14로 인해 선도적 인 선택으로 남아 있습니다. 열가소성 수지는 저비용의 일회용^{분석 시스템 9} 개발에 상당한 이점이 있기 때문에 미세 유체 시스템에 매력적인 기질입니다. 또한 이러한 재료는 대량 제조 공정에 매우 적합하여 상업화 및 대량 생산에 적합합니다. 이러한 이유로 PMMA와 같은 열가소성 수지는 미세 유체 공학¹⁰의 초기부터 신뢰할 수 있고 견고한 재료로 간주되었습니다. 열가소성 수지에서 폐쇄 채널을 제조하기 위한 상이한 프로토콜이 설명되었으며, 예컨대 용매 접합(¹⁵), 열 접합(¹⁶) 및 자외선(UV)/오존 표면 처리 접합(¹⁷)이 있다.

많은 경우, 기존의 마이크로 밀링 머신으로 달성 된 위치 결정 분해능은 10 μm보다 작은 구조가 필요한 일부 미세 유체 응용 분야에는 충분하지 않습니다. 고급 마이크로 밀링은 충분한 분해능을 가지고 있습니다. 불행히도, 높은 가격으로 인해, 그 사용은 소수의 사용자로 제한됩니다¹². 이전에 우리 연구 그룹은 10μm 미만의 가공 구조를 허용하는 저비용 공구의 제조 및 조작을 보고하여 기존 밀링 머신의 분해능을 극복했습니다¹². 고정 장치는 3 개의 압전 액추에이터를 포함하는 간단한 전자 장치로 3D 인쇄로 제조 된 플랫폼입니다. 표면에는 압전 요소가 동시에 작용할 때 들어 올릴 수있는 힌지 모양의 조인트가 있습니다. Z축 변위는 500nm의 분해능과 ±1.5μm의 정확도로 제어할 수 있습니다¹².

이 논문은 마이크로 밀링 기술을 통한 아크릴 장치 (PMMA)의 제조 공정 단계를 제시합니다. 칩 설계는 폭 200μm, 높이 200μm의 메인 채널과 시약의 흐름을 퍼지하기 위한 동일한 치수의 측면 채널로 구성됩니다. 중앙 영역에서, 채널은 외부 자석을 배치하여 나노 입자의 자기 트랩을 구성하는 자성 미세 입자를 포착하기 위해이 그룹⁽¹²)에 의해 만들어진 3D 인쇄 압전 플랫폼으로 제작 된 높이가 5μm에 불과한 물리적 제한에 의해 중단됩니다. 우리는 100 nm 자성 나노 입자에 접합 된 모델 항원으로 라이소자임을 사용하여 상용 항체를 검출하기위한 면역 분석법을 수행하여 미세 유체 장치의 작동을 보여줍니다. 이 장치는 독특한⁴ : 면역 지원으로 자성 나노 입자를 사용하면 총 테스트 시간이 몇 시간에서 몇 분으로 단축됩니다. 검출을 위해 형광 생성 효소를 사용하면 표준 효소 결합 면역 흡착 분석 (ELISA)과 비교할 수있는 검출 한계가 허용됩니다. 그리고 열가소성 수지를 제조 재료로 사용하면 이전 미세 유체 나노 입자의 자기 트랩³에는 없었던 대량 생산과 호환되며 POCT를 개발할 수있는 훌륭한 후보가됩니다.

Protocol

1. 마이크로 밀링

1. 표면 연삭
   1. 마이크로 밀링 머신과 압전 컨트롤러를 켭니다. 각각의 제어 소프트웨어를 시작하십시오¹².
   2. 필요한 엔드밀 비트(직경 200μm 및 800μm)를 선택합니다. 밀링 머신의 적절한 구획에 배치합니다(그림 1).
   3. 800μm 엔드밀 비트로 1.3mm 두께의 PMMA의 9mm x 25mm 직사각형을 절단합니다. 양면 접착 테이프를 사용하여 이러한 직사각형 중 하나를 압전 플랫폼에 조심스럽게 부착합니다(그림 2).
      참고: 모서리 중 하나가 가공을 위해 x축 및 y축의 원점 좌표와 일치하도록 항상 아크릴 직사각형을 같은 위치에 배치해야 합니다.
   4. z-센서를 연결하여 PMMA 사각형의 표면에 놓습니다. 감지 핀을 선택하고 센서 표면 위로 이동합니다. 센서에 접촉하지 않고 수동으로 핀을 내립니다. Z0 감지 모드를 활성화합니다(그림 3).
   5. 200μm 엔드밀 비트를 선택하고 x, y 원점으로 이동합니다. z-센서를 제거합니다. 아크릴 표면에 닿지 않도록 비트를 조심스럽게 내립니다.
   6. 200μm 엔드밀 비트를 14,500rpm으로 회전시킵니다. z축의 원점 좌표(z = 0)까지 천천히 내립니다. 원점에서 30μm 아래로 z축을 재설정합니다. 이 좌표를 새 z-원점으로 설정합니다.
      참고: 비트가 회전하지 않는 경우 비트를 내리지 마십시오. 그렇지 않으면 파손될 위험이 있습니다.
   7. 마이크로 밀링 머신 소프트웨어에서 절단 버튼을 클릭하여 절단 패널을 활성화합니다. 추가 버튼을 클릭하고 아크릴 표면 연삭을 위해 이전에 생성 된 코드가있는 .txt 파일 (보충 코딩 파일 1)을 선택하십시오. 출력 버튼을 클릭하여 프로세스를 시작하십시오.
   8. 엔드밀 비트를 제한이 머시닝될 좌표로 가져옵니다. 이 좌표에 도달하면 일시 중지 버튼을 클릭하여 엔드밀 비트가 지표면에서 들어 올려지지 않도록 합니다. 그렇지 않으면 엔드밀 비트를 이 좌표로 수동으로 재배치합니다(그림 4A).
2. 밀링 제한 5 μm
   1. 엔드밀 비트의 회전 속도를 11,000rpm으로 설정합니다. 압전 플랫폼의 인터페이스로 플랫폼을 6.5μm 올립니다(보충 그림 S1). 엔드밀 비트를 y축을 따라 500μm 이동합니다. 압전 플랫폼을 제어 인터페이스를 사용하여 z축의 초기 값으로 되돌립니다.
3. 마이크로 채널의 밀링
   1. 설계 소프트웨어에서 이전에 작성한 설계 파일(보충 설계 파일 1)을 엽니다. 인쇄 버튼을 클릭합니다. 속성(Properties) 메뉴에 액세스하고 머시닝할 디자인이 포함된 레이어에 해당하는 색상 창을 클릭합니다. 보충 그림 S2에 지정된 대로 도구 패널에서 제작 매개변수를 설정합니다.
   2. 도구 풀다운 메뉴에서 없음(None 옵션)을 선택하여 원하지 않는 레이어를 비활성화합니다.
4. 구멍 밀링
   1. 800μm 엔드밀 비트로 전환합니다. 해당 색상 창을 클릭하여 직경 1.2mm 구멍의 디자인 레이어를 활성화합니다.
   2. 1.3.2단계를 반복하되 이 경우 구멍에 대한 보충 그림 S3A 에 설명된 대로 해당 제작 매개변수를 설정합니다.
      알림: 가공 된 구멍의 깊이는 아크릴 두께의 절반입니다.
   3. 직사각형의 반대쪽 모서리에 있는 두 개의 추가 구멍을 새 플랫폼에서 거꾸로 아크릴 정렬에 맞게 가공합니다(그림 4B). 압전 플랫폼에서 아크릴 직사각형을 떼어냅니다. 아크릴을 뒤집고 가공된 기둥이 있는 어댑터 위에 양면 접착 테이프로 테이프로 붙입니다(그림 4C, D).
   4. 설계 소프트웨어에서 반대면에 대한 구멍 설계가 포함된 파일을 엽니다(보충 설계 파일 2). 보충 그림 S3B에 설명된 대로 해당 제작 파라미터를 설정합니다. 시약 입구 및 출구 구멍의 나머지 절반을 직경 1.5mm, 깊이 0.7mm로 밀링합니다(보충 그림 S3C).

그림 1: 엔드밀 비트 배치. (A) 200 μm 및 800 μm 엔드 밀 비트를 배치하고 나사를 통해 강철 지지대에 고정합니다. (B) 각 엔드 밀 비트는 자동 선택을 위해 마이크로 밀링 머신의 특정 구획에 배치됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 압전 플랫폼. 이 플랫폼은 3D 프린팅으로 제작되며 3 개의 압전 액추에이터로 제어되는 z 축에서 미세한 변위를 허용하는 힌지로 연결된 2 개의 육각형베이스로 구성됩니다. PMMA 사각형이 부착되고 좌표의 정렬 모서리를 설정할 수있는 아크릴 어댑터도 관찰됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: Z축 보정. z축 보정 단계가 자세히 설명되어 있습니다. (A) z-센서에는 마이크로 밀링 머신에 연결되는 케이블이 포함되어 있습니다. (B) 센서는 가공 할 표면에 직접 배치됩니다. (C) 감지 핀은 엔드 밀 비트 옆의 특수 구획에 배치 된 금속 막대로 구성됩니다. (D) 두 액세서리가 접촉하면 마이크로 밀링 머신이 z 축의 원점 좌표를 자동으로 계산합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4 : 정류 된 아크릴 표면. (A) 직경 200μm의 엔드 밀 비트는 아크릴 직사각형의 전체 표면을 스윕하여 약 30μm 높이의 층을 제거합니다. (B) 이미지는 이전에 정류 된 아크릴의면에 밀링 된 다양한 구조를 보여줍니다. 시약 입구 및 출구를위한 채널과 구멍이 관찰됩니다. 5 μm 제한은 육안으로 볼 수 없습니다. (C) 정렬 구멍이 있는 미세 밀링 표면과 반대쪽 모서리에 정렬 기둥이 있는 어댑터. (D) 아크릴은 정렬 구멍이 맞는 기둥이있는 어댑터에 거꾸로 정렬됩니다. 스케일 바 = 500 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

2. 채널 씰링

1. 아크릴 청소
   1. 기둥 어댑터 플랫폼에서 아크릴 사각형을 제거합니다. 가공되지 않은 다른 아크릴 직사각형을 가져 가십시오. 두 아크릴 시트를 이소프로필 알코올(IPA)로 씻고 증류수로 헹굽니다. 장갑을 착용하고 IPA와의 접촉을 피하십시오.
   2. 아크릴을 초음파 수조에 10 분 동안 담그십시오 (그림 5A, B).
2. 기체 클로로포름 노출
   1. 두 아크릴 시트를 완벽하게 말리십시오. 양면 테이프로 유리 페트리 접시 뚜껑 안쪽에 테이프로 붙입니다. 가공된 채널의 측면을 노출된 곳에 배치해야 합니다(그림 5C). 장갑을 착용하고 아크릴 표면을 직접 만지지 마십시오.
   2. 유리 페트리 접시의 바닥을 더 큰 유리 페트리 접시 안에 넣습니다(그림 5D). 클로로포름 1mL를 페트리 접시의 바닥에 붓습니다. 안쪽에 부착 된 아크릴 시트로 뚜껑을 빠르게 놓습니다.
   3. 즉시 더 큰 페트리 접시의 바닥에 증류수를 페트리 접시 뚜껑 높이까지 추가합니다. 아크릴을 클로로포름 가스에 1분 동안 노출시킵니다(그림 5E).
      알림: 클로로포름에 더 오래 노출되면 아크릴 표면이 공격되고 5μm 제한이 녹아 높이가 수정되거나 완전히 사라집니다.
   4. 페트리 접시를 기울여 생성 된 물개를 깨뜨립니다. 페트리 접시를 열어 클로로포름에서 아크릴을 즉시 제거하십시오. 물을 흘리지 않도록주의하십시오.
      주의 : 클로로포름은 독성이 높으므로 흄 후드에서이 과정을 수행하고 장갑을 사용하십시오.
3. 압착 및 가열에 의한 접착
   1. 양면 테이프에서 두 아크릴 판을 모두 떼어냅니다.
   2. 두 아크릴을 기체 클로로포름에 노출 된면과 마주보고 정렬하여 샌드위치를 만듭니다. 아크릴을 18kgf/^cm2 및 90°C의 온도에서 프레스에 놓습니다(그림 5F,G).
      알림: 더 나은 밀봉을 위해 아크릴을 세로로 정렬하고 2분 후에 정렬을 변경하는 것이 좋습니다. 이 시간이 지난 후 씰이 충분하지 않으면 1 분 이상 프레스에 다시 넣으십시오. 스테레오스코프를 사용하여 채널 및 제한 상태를 확인합니다. 압착 시간을 초과하는 경우 제한을 제거 할 위험이 있음을 고려하십시오.
4. 호스 부착
   1. 2-3cm 길이의 호스를 자릅니다. 완전히 똑바로 자르십시오. 순간 건조 액체 접착제로 각 호스를 장치의 구멍에 연결합니다(그림 6A). 접착제가 칩 내부로 들어가는 것을 방지하십시오.

그림 5 : 장치의 밀봉 공정. (A) 각 아크릴 시트를 증류수로 재 밀봉 가능한 백에 넣고 초음파 욕조에 담근다. (B) 왼쪽 이미지는 제작 직후의 채널을 보여주고 오른쪽 이미지는 IPA 및 초음파 수조로 세척 한 후 동일한 장치를 보여줍니다. 마이크로 채널에서 모든 불순물과 아크릴 잔류 물을 제거합니다. 200μm의 중앙 채널을 방해하는 제한의 가장자리가 관찰되어 성공적인 밀링 공정을 확인합니다. 스케일 바 = 500 μm. (C) 두 아크릴을 모두 건조시키고 뚜껑의 유리 플랫폼에 부착합니다. (D) 페트리 접시의 바닥은 더 큰 직경의 다른 접시 안에 놓입니다. (E) 페트리 접시를 닫을 때 워터 씰은 기체 클로로포름이 빠져 나가는 것을 방지합니다. (F) 무게가 5kg 인 레버 요소에 대한 설명. (G) 아크릴이 놓인 영역을 빨간색으로 보여주는 열린 레버의 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

3. 장치 준비

1. 주사기를 사용하여 채널을 증류수로 채 웁니다. 누출이나 흐름 저항이 없는지 확인하십시오. 장치를 초음파 수조에 10분 동안 담그면 채널 내부에 남아 있는 아크릴, 접착제 또는 원치 않는 물질이 제거됩니다.
2. 장치 채널 내부의 물을 비우십시오. 주사기를 사용하여 1x 트리스 완충 식염수(TBS)에 희석한 5%(w/v) 소 혈청 알부민(BSA)으로 제조한 차단 용액을 도입하고 이전에 0.2μm 폴리에테르설폰(PES) 주사기 필터로 여과합니다.
3. 5% BSA에서 직경 7.5μm의 철 미세입자의 현탁액을 준비한다.
   참고: 미립자는 이전에^{단백질 흡수에} 대한 내성을 부여하는 실리카-폴리에틸렌 글리콜(PEG) 층으로 기능화되었습니다4.
4. 칩과 마이크로입자 현탁액을 블로킹 용액과 함께 실온에서 적어도 1시간 동안 인큐베이션한다. 가능하면 4 ° C에서 밤새 차단하십시오.

4. 미립자 트랩 형성

1. 측면 채널 출구 호스를 통해 주사기 바늘로 미립자를 칩에 삽입합니다. 칩을 수직으로 놓고 미세 입자가 측면 채널을 통해 중력의 영향으로 흐르도록합니다. 칩을 90°의 두 단계로 180° 회전하고 미세 입자가 5μm 제한에서 표적화되고 압축되도록 합니다.
2. 측면 채널을 향해 45° 회전하는 중력에 의해 과도한 미세 입자를 제거합니다.
3. 미립자 트랩이 풀리지 않도록 장치를 똑바로 세우십시오. 미립자 트랩 형성 공정의 요약은 도 6B 를 참조한다.

5. 면역 측정법

1. 나노 입자 준비
   1. 이전에 리소자임(항원 모델)과 접합된 100nm 나노입자의 현탁액 2μL를 취합니다. 100μL의 블로킹 용액이 담긴 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에 추가합니다. 4°C에서 밤새 배양한다.
   2. 150 μL의 세척 완충액(1x TBS, 0.05% 트윈 20)을 추가합니다.
   3. 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브를 자기 분리기에 넣습니다. 나노입자가 분리될 수 있도록 15분 동안 보관합니다(보충 그림 S4).
      알림: 자기 분리기의 최소 부피는 200μL입니다. 더 작은 볼륨을 사용하지 마십시오.
   4. 마이크로 피펫으로 튜브에서 액체를 제거하십시오. 나노 입자 펠릿이 형성된 튜브의 벽과의 접촉을 피하십시오.
   5. 250 μL의 신선한 세척 완충액을 첨가하십시오. 튜브를 15분 동안 교반 상태로 유지하십시오.
   6. 5.1.3.-5.1.5단계를 반복합니다. 2 배 더, 5 분 동안 만 흔들어.
   7. 원하는 농도의 1차 항-리소자임 항체를 추가합니다( 재료 표 참조). 항체 희석제(1x TBS, 1% BSA, 0.05% 트윈 20)에서 최종 부피 100μL로 조정합니다.
   8. 37°C에서 15분 동안 배양합니다. 실온에서 15분 더 흔들어 주십시오.
   9. 세척 단계 5.1.2.-5.1.6을 반복합니다.
   10. 항체 희석제 100μL를 추가합니다. 양 고추 냉이 퍼 옥시다제 결합 2 차 항체 (HRP-AbII) ( 재료 표 참조)를 1 : 500의 희석으로 첨가하십시오.
   11. 세척 단계 5.1.2.-5.1.6을 반복합니다.
   12. 나노입자를 항체 희석제의 최종 부피 50 μL로 유지한다.

6. 실험적 장착

1. 두 개의 100μL 유리 주사기에 물을 채우고 각 주사기에 6.5cm 길이의 호스를 연결하고 호스 끝에 금속 핀을 삽입한 다음 두 주사기를 컴퓨터 제어 주사기 펌프에 놓습니다.
2. 아크릴 장치의 모든 호스를 열로 밀봉하십시오.
3. 입구 호스를 자르고 몇 밀리미터 만 유지하십시오. 분배 바늘에 세척 버퍼를 채우고 절단 된 호스에 삽입하십시오. 바늘을 장치에 연결하기 전에 용액이 떨어지도록 하여 장치에 대한 공기 접근을 방지하십시오.
4. 측면 채널에서 배출 호스를 자릅니다. 주사기 펌프에 연결합니다. 다음으로 메인 채널 출구 호스에 대해 동일한 절차를 수행하십시오.
   참고: 6.3.-6.4단계를 수행하는 것이 중요합니다. 이 순서는 미립자 트랩의 포장을 풀지 않기 위해서입니다. 가능하면 돋보기를 사용하여이 단계에서 트랩의 상태를 확인하십시오.
5. 현미경 스테이지에 유리 슬라이드를 놓습니다. 양면 테이프로 자석을 슬라이드에 부착하고 양쪽에 작은 테이프 조각을 놓아 칩 가장자리를 유리에 고정합니다.
6. 주사기 펌프 컨트롤러의 유량 및 단위 탭을 통해 50μL/h의 유량을 설정합니다. 인출 모드를 선택하고 시작 버튼을 클릭하여 세척 버퍼의 흐름을 활성화합니다.
7. 트랩이 들어있는 칩의 영역이 자석에 닿도록 자석이있는 슬라이드쪽으로 장치를 수평으로 조심스럽게 접근하십시오.
8. 움직임을 방지하기 위해 양면 테이프로 장치의 가장자리를 유리에 붙입니다. 현미경 검사를 위한 광학 경로를 방해하지 마십시오(그림 6C).

그림 6: 최종 장치 구성 . (A) 해당 입력 및 출력에 호스가 부착 된 아크릴 장치. 눈금은 장치의 크기를 센티미터 단위로 표시합니다. (b) 미세입자 트랩의 형성을 위한 프로토콜. 미립자는 장치가 수직 위치에 놓일 때 중력에 의해 채널을 통해 흐릅니다. 미립자는 5 μm 제한에서 농축된다. 과량의 미립자는 측면 채널을 통해 칩을 회전시킴으로써 쉽게 제거된다. 칩은 면역 분석 전에 트랩을 보존하기 위해 수직으로 유지됩니다. (c) 상기 자석을 포함하는 유리 슬라이드 상에 장착된, 도립형광현미경의 스테이지 상에 장착된 미세유체소자. 시약이 첨가되는 분배 바늘과 주사기 펌프에 연결되는 출구 호스가 관찰됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

7. 면역 검출

1. 과도한 BSA를 제거하기 위해 50μL/h로 10분 동안 세척 버퍼를 계속 흐르게 합니다.
2. 마이크로피펫으로 분배 바늘에서 남은 세척 버퍼를 제거합니다. 50 μL의 나노입자 현탁액을 첨가한다.
3. 나노입자의 현탁액을 100μL/h의 유속으로 7분 동안 흘려준다. 그런 다음 유속을 50μL/h로 변경하고 15분 더 흘립니다.
4. 분배 바늘을 교체하십시오. 세척 버퍼를 50μL/h로 10분 동안 흘립니다. 세척 단계 동안 제조업체의 사양에 따라 형광 생성 기판을 준비하십시오.
5. 마이크로피펫으로 분배 바늘에서 남은 세척 버퍼를 제거합니다. 100 μL의 플루오로 생성 기질을 첨가하십시오 ( 재료 표 참조). 플루오로제닉 기질을 50μL/h에서 6분 동안 흘립니다.
6. 시린지 펌프를 제어하는 인터페이스의 해당 유량 및 타이머 설정 탭에서 유량(1 μL/h, 3 μL/h, 5 μL/h 및 10 μL/h) 및 시간(6분) 측정 파라미터를 설정합니다. 수행할 각 측정에 대해 인출 모드를 선택해야 합니다.
7. 세척 단계에 대해 추가 유량 탭을 50μL/h로 설정하고 타이머 를 3분 으로 설정합니다.
8. 50μL/h에서 기판이 멈추기 15초 전에 현미경의 형광을 켭니다. 기판이 1,000밀리초의 노출 시간으로 멈추기 10초 전에 현미경 카메라의 소프트웨어로 이미지 캡처를 시작합니다. 1프레임/초(FPS)로 6분 동안 이미징을 수행합니다.
9. 50μL/h에서 기판 세척 유량이 멈춘 직후 원하는 유량 파라미터의 시작 버튼을 클릭합니다. 선택한 측정 흐름이 중지된 직후 세척 흐름의 시작 버튼(50 μL/h)을 클릭합니다.
10. 이미지 캡처를 중지하고 현미경의 형광을 꺼서 기판의 광퇴색을 방지합니다.
11. 7.8.-7.10단계를 반복합니다. 사용 된 각 측정 유량에 대해.

Results

기존 마이크로 밀링 기술의 분해능을 향상시키는 재현성이 높은 제조 프로토콜을 수립 할 수있었습니다. 이 프로토콜을 사용하면 200μm 높은 채널에서 엇갈린 제한으로 작동하는 높이 5μm만큼 작은 채널을 제작할 수 있습니다. 엇갈린 제한의 단순한 설계는 7.5μm 직경의 철 미세 입자를 포착하여 마이크로 채널에서 압축될 때 외부 자석이 장치에 접근할 때 자기 트랩을 생성할 수 있습니다. 이 장치를 사용하면 관심 분석물과 면역학적 지지체로 접합된 나노입자를 사용하여 면역분석을 수행할 수 있습니다. 이 연구에서는 효소 표지 항체 기반 검출을 통한 비경쟁적 간접 면역 분석법을 수행했습니다. 모델 항원(Ag)은 직경 100 nm의 나노입자(NPs)에 접합된 라이소자임 단백질이었다. 토끼 항-리소자임 IgG를 1차 항체(AbI)로 사용하였고, 검출은 토끼 양 고추냉이 퍼옥시다아제-접합 2차 항체(HRP-AbII)를 사용하여 수행하였다.

검출은 트랩을 통과할 때 HRP-AbII와 플루오로제닉...

Discussion

나노입자를 면역지지체로서 사용하는 면역분석용 아크릴 미세유체 장치를 마이크로밀링 기술을 사용하여 제작하였다. 기판 상에 직접 제조하는 방법은 마스터 몰드의 사용과 이것이 의미하는 시간 및 비용을 피할 수 있는 장점이 있다. 그러나 신속한 프로토 타이핑 및 대량 장치 제조로 제한됩니다.

여기에서, 우리는 밀링 머신⁽¹²)에 대해 이전에보고 된 액세서리 압전 플랫폼을 사용했다. 이 플랫폼은 기존 마이크로 밀링 머신의 10μm 분해능보다 더 나은 수직 분해능으로 가변 깊이 채널을 생성하기 위해 3D 프린팅으로 제작되었습니다. 우리는 200 μm 미세 유체 채널에서 엇갈린 제한을 형성하는 최대 5 μm 높이의 채널 밀링을 달성했습니다.

200 μm 및 800 μm 직경의 두 개의 엔드 밀 비트만 미세 유체 장치의 제조에 필요하며 비트를 수동으로 변경할 필요가 없습니다. 사용된 밀링 머신 모델은 ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.008 엔드밀	교세라 SGS	2204	2FL 0.008x1/8x0.12x1-1/12
0.032 엔드밀	KYOCERA SGS	2228	2FL 0.032x1/8x0.48x1-1/12
카르보닐-철 미립자	시그마-알드리치	44890	7 μ 엠
클로로포름	페르몬트	6201	건강 위험: 보통 가연성: 없음 반응성: 없음 접촉 위험: 보통
CMOS 카메라 Moment	Teledyne Photometrics		센서 기술: CMOS 양자 효율: 73% 픽셀 크기: 4.5 &마이크로; m x 4.5 &마이크로; m 지원 인터페이스: USB 3.2 Gen 2
Dr Engrave Software	Roland DGA Corporation		표면에 새겨진 경로를 설계하고 생성하는 새끼는 소프트웨어
추출 후드	알 수 없음	수 없음
유연한 플라스틱 튜빙	Tygon		AAD04103 ID = 0.020, OD = 0.060
형광 마이크로소프	ZEISS	Axio Vert.A1
고정밀 디스펜스 니들	록타이트	98612
홈메이드 압전 컨트롤러 애플리케이션	LabView		자세한 내용은 참조 12를 참조하십시오.
Loctite 495 즉시 접착제	Henkel	49503	마이크로피펫 팁 또는 분배 바늘로 적용
MagJET 분리 랙	열과학		12 x 1.5 mL
메카닉 프레스	집에서 만든
밀링 머신	Roland	MDX-50
압전 플랫폼	집에서 만든		참조 참조 12
Polymethylmethacrylate - 시트 - PMMA, 아크릴	Goodfellow	ME303018/1	두께: 1.3 mm, 투명도: 투명/투명
PVCamTest 소프트웨어	Teledyne Photometrics	버전 3.10.107	이미지 획득 소프트웨어
실체 현미경	Nikon	SMZ 7457
SuperMag Carboxyl Beads	Ocean NanoTech	KSC0100	100 nm
주사기 펌프	kd 과학	적  KDS200	최대 두 개의 주사기를 수용할 수 있습니다.
Utrasonic bath	Branson	2800
VPanel 소프트웨어	Windows OS	버전 1.0.3.0	마이크로 밀링 머신 제어용 소프트웨어