토양의 불투명도로 인해 구성 미생물 간의 상호 작용은 세포 분해능으로 쉽게 시각화 될 수 없습니다. 여기에서는 곰팡이 - 미생물 상호 작용을 조사하기위한 새로운 기회를 제공하는 두 가지 미세 유체 도구가 제시됩니다. 이 장치는 다재다능하고 사용하기 쉬우므로 세포 수준에서 높은 시공간 제어 및 고해상도 이미징이 가능합니다.
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이 논문에서
요약
초록
필라멘트 균류는 토양의 성공적인 거주자이며 유기 및 무기 물질의 분해뿐만 아니라 영양소 수준의 조절과 같은 토양 생태계에서 중요한 역할을합니다. 거기에서 그들은 또한 박테리아 나 다른 곰팡이와 같은 다양한 다른 미생물과 상호 작용할 수있는 수많은 기회를 발견합니다. 그러나 세포 수준에서 곰팡이 상호 작용을 연구하는 것은 토양의 블랙 박스와 같은 특성 때문에 어려울 수 있습니다. 곰팡이 상호 작용의 연구를 위해 새로운 미세 유체 도구가 개발되고 있습니다. 박테리아 - 곰팡이 및 곰팡이 - 곰팡이 상호 작용을 연구하기 위해 고안된 두 가지 플랫폼이 강조됩니다. 이러한 마이크로채널 내에서, 진균-미생물 상호작용은 이전에 가능했던 것보다 더 높은 시간적 및 공간적 분해능으로 제어된 물리-화학적 환경에서 모니터링될 수 있다. 이러한 도구의 적용은 균사에 대한 박테리아 극성 부착의 관찰 또는 특징이없는 곰팡이 - 곰팡이 적대감을 드러내는 것과 같은 수많은 새로운 생물학적 통찰력을 산출했습니다. 이러한 방법론의 주요 특징은 비 전문가가이 도구의 사용 편의성과 관련하여 미생물학 실험실에서 사용할 수있는 번역 가능성이 높은 기술을 제공합니다.
서론
토양은 탄소와 인 순환 1,2에 도움이되는 풍부한 미생물을 포함하는 매우 다양한 환경입니다. 필라멘트 균류는 유기 및 무기 물질의 분해제로서 수많은 생태계의 주요 구성 요소이며 공생 관계형성 3,4을 통해 식물의 영양을 향상시킬 수 있습니다. 토양 내에서 곰팡이는 다른 곰팡이5, 박테리아6, 바이러스7 및 선충류8과 같은 수많은 미생물과 동적으로 상호 작용합니다. 이러한 상호 작용은 토양과 식물 건강에 중요한 영향을 미칩니다. 그러나 고해상도로 상호 작용하는 미생물을 이미징 할 수있는 적절한 실험 시스템이 없기 때문에 많은 사람들이 정의되지 않은 채로 남아 있습니다.
박테리아 - 곰팡이 상호 작용 (BFI) 및 곰팡이 - 곰팡이 상호 작용 (FFIs)에 관한 조사는 의학의 항균제 및 농업의 생물학적 조절제를 포함하여 다양한 분야에서 가치있는 응용 프로그램을 가지고 있....
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프로토콜
참고: 이 프로토콜에 설명된 절차에 대한 요약은 그림 2에 시각적으로 묘사되어 있습니다.
그림 2: 이 프로토콜에 자세히 설명된 다섯 개의 주요 섹션으로 구성된 제시된 방법론의 개략적인 표현. 장치 설계는 CAD(컴퓨터 지원 설계) 소프트웨어와 포토리소그래피(1)를 사용하여 제조된 마스터 몰드를 사용하여 만들어집니다. 이것은 폴리 (디메틸 실록산) (PDMS)를 주조하는 데 사용되며, 이는 슬래브로 다이싱되고 유리 바닥 페트리 접시에 결합되어 미세 유체 장치 (2)를 형성합니다. 연구에 포함될 미생물은 배양(3)되고 장치(4)를 접종하는데 사용된다. 상호 작용은 현미경을 사용하여 연구되고 이미지 분석 기술을 사용하여 정량화됩니다 (5).
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결과
대표적인 결과는 예시 BFI40 및 FFI41 디바이스로부터 제시된다. 히팔 성장률 측정은 기본적인 현미경 기술과 함께 이러한 장치를 사용하여 쉽게 얻을 수 있습니다. 도 3A-B는 C. cinerea hyphae와 B. subtilis NCIB 3610 사이의 박테리아-진균 상호작용을 도시한다. B. subtilis의 존재는 공동 접종 후 약 5 시간 후에 C. cinerea의 성장을 정지시킨다 (도 3B). 화살표는 더 얇고 투명한 균사의 동시 형태학적 관찰을 나타낸다(도 3A). 또한 영향을받지 않은 최면 세포가 계속 증식한다는 점도 주목되었습니다.
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토론
이 기사는 채널 미세 유체학을 사용하는 곰팡이 - 미생물 상호 작용의 연구를위한 프로토콜을 제시합니다. 저자는 이러한 장치의 다양성을 입증하고 연구자의 이익에 맞게 적응을 장려하는 것을 목표로합니다. 예시적인 BFI 및 FFI 장치를 사용하여, 진균-미생물 상호작용은 이전에 접근가능한 것보다 더 상세하게 연구될 수 있다. 토양의 배경 복잡성과 이질성을 제거하고, 균사의 성장을 단일 단층으로 제한하고, 환경 매개 변수를 엄격하게 조절함으로써, 시간이 지남에 따라 이러한 생물학적 사건의 고해상도 이미지를 캡처 할 수 있습니다. 이러한 장치를 사용하여, 미생물 파트너 간의 상호작용은 성장 속도, 형광 정량화 및 형태학적 형질의 관찰 생물이미징을 사용하여 특성화되었다.
장치는 세포 수준에서 진균-미생물 상호작용의 특성화를 가능하게 하도록 설계될 수 있다. 비 전문가를위한 다양성과 디자인의 용이성은이 프로토콜을 광범위한 연구 질문에 적응시키는 데 적합합니다. BFI 및 FFI 장치는 투명.......
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공개 사항
저자는 경쟁 이익이 없다고 선언합니다.
감사의 글
우리는 임페리얼 칼리지 런던의 생명 공학과와 Leverhulme Trust (연구 보조금 참조 : RPG-2020-352)의 재정 지원을 인정합니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Agar | Difco Laboratories | 214010 | 페트리 접시 내 박테리아 및 곰팡이 배양을 위한 배양 배지를 응고시키는 데 사용 |
| 알루미늄 호일 | Fisher Scientific Ltd | 11759408 | |
| AutoCAD 2021 | Autodesk, USA | ||
| 오토클레이브(VX-75) | Systec | ||
| 원심분리기(5810R) | Eppendorf | ||
| 클로로트리메티실란 | Merck Life Sciences | 386529 | 주의: 클로로트리메틸실란은 유해 물질입니다. 적절한 PPE를 착용하고 조심스럽게 다루십시오. 피부와 눈과의 접촉을 피하고 흡입을 하지 마십시오. 발화원에서 멀리 유지하고 환기가 잘 되는 곳에서 사용하십시오. |
| 코르크 보어 | SLS | COR1000 | |
| 개발자 솔루션 (mr-Dev 600) | Microresist Technologies | 주의: mr-Dev 600 개발자 솔루션은 가연성 | |
| Erlenmeyer 플라스크 | VWR | 214-1108 | 예: 200 mL; 정확한 필요에 맞는 크기를 선택하십시오 |
| 에탄올 (70% v/v) | Fisher Scientific Ltd | E/0650DF/15 | 99.8%에서 희석(분석 시약 등급) |
| Fiji | ImageJ | 이미징 처리를 위한 예시 소프트웨어 패키지 | |
| 여과된 압축 공기 | 대부분의 실험실에서 표준으로 사용할 수 있습니다. 또는 공기 조절기가 있는 무급유식 압축기를 사용할 수 있습니다. | ||
| 편평한 웨이퍼 핀셋 | SLS | INS5026 | |
| 집게 | Fisher Scientific Ltd | 10008051 | 구부러지고 날카로운 |
| 유리 바닥 페트리 접시 | World Precision Instruments | FD35-100 | 35 mm |
| 유리 바닥 페트리 접시 | World Precision Instruments | FD5040-100 | 50 mm |
| 유리 결정화 접시 | VWR | 216-1865 | 중고 PDMS 슬래브 세척용 |
| 유리 결정화 접시 | VWR | 216-1866 | 마스터 몰드 |
| 유리 매체 병 | 개발에 사용 Fisher Scientific Ltd | 15456113 | 예: 250mL; 정확한 요구에 맞는 크기를 선택하십시오 |
| 유리 주사기(Hamilton) | Fisher Scientific Ltd | 10625251 | 클로로트리메틸실란 |
| 핫 플레이트(HP 160 III BM) | 분배에 사용됩니다.SAWATEC | ||
| 접종 루프 | VWR | COPA175CS01 | |
| 이소프로필 알코올 | 시그마-알드리치 | W292907 | |
| 층류 후드 | Air Science (PCR) | 장치 제조에 사용되는 예시적인 층류 후드 | |
| LB 매체 | Fisher Scientific Ltd | BP9723-500 | 박테리아 하룻밤 배양을 |
| 위한 예시적인 영양 육수발광 다이오드 광 엔진(LedHUB) | Omicron-Laserage Laserprodukte GmbH | 곰팡이-미생물 상호작용(형광) 이미징에 사용할 수 있는 모범 광원 | |
| MA6 자외선 마스크 얼라인너 | Suss Microtec | ||
| 맥아 추출물 | VWR | 84618 | 모범 진균 배양 배지 제작에 사용 (맥아 추출물 한천) |
| 마스크 라이터 | 응용 재료 | 4700DP | 포토리소그래피용 포토 마스크를 인쇄하는 데 사용할 수 있는 마스크 라이터의 예 |
| : 마스터 몰드 플라스틱 마운트 | 3D 프린팅 맞춤형 홀더, 사내에서 제조된 | ||
| 미생물 안전 캐비닛 (바이오매트2) | Contained Air Solutions | 미생물 배양 및 장치 접종에 사용되는 예시 MSC | |
| Milli-Q 정제수 | 생물학 실험실에서 표준으로 사용 가능 | ||
| NaOH | Fisher Scientific Ltd | BP359-500 | |
| NIS-Elements Advanced Research 이미징 소프트웨어 | Nikon | Exemplar 소프트웨어 패키지 | |
| NIS-Elements Free Viewer | Nikon | Exemplar 소프트웨어 패키지 | |
| 오븐(바인더 BD115) | Fisher Scientific Ltd | 15602126 | 폴리(디메틸실록산) 경화에 사용)(PDMS) |
| 오븐 (CLO-2AH-S) | KOYO | 웨이퍼 | |
| Parafilm | Bemis | HS234526B | 투명 필름 |
| 페트리 접시, 사각형 멸균 | Fisher Scientific Ltd | 11708573 | 120.5 mm |
| 페트리 접시, 멸균 | Fisher Scientific Ltd | 15370366 | 90 mm |
| 포토리소그래피 마스크 | Micro Lithography Services Ltd. 영국 | ||
| 플라즈마 세정제(Zepto) | Diener Electronic | 100012601 | |
| 플라스틱 컵 | Semadeni | 8323 | |
| 플라스틱 주걱 | Semadeni | 3340 | |
| 휴대용 정밀 저울(OHAUS Scout) | Fisher Scientific Ltd | 15519631 | PDMS, 미디어 계량에 사용 분대 등. |
| 정밀 절단기 | Syneo | HS1251135P1183 | 절단 가장자리 직경: 3.18 mm |
| 정밀 절단기 | Syneo | HS1871730P1183S | 커팅 엣지 직경: 4.75 mm |
| 프로파일로미터 | Bruker | Dektak XT-스타일러스 | |
| 면도날 | Hä berle Labortechnik | 9156110 | |
| 냉장고 | Haden | 4-6 ° C | |
| Retiga R1 CCD 카메라 | Qimaging | 곰팡이-미생물 상호 작용 이미징에 사용할 수 있는 모범 카메라 | |
| 스카치 매직 테이프 | Office Depot | 3969954 | 19mm 보이지 않는 테이프; 투명 테이프 |
| 쉐이킹 인큐베이터(Cole-Parmer SI500) | Fisher Scientific Ltd | 10257954 | |
| 실리콘 웨이퍼 | Inseto | 100mm | |
| 소다 석회 유리 | 플레이트 Inseto | 125 mm x 125 mm x 2 mm. 마스크 정렬기에서 포토리소그래피 마스크를 고정하는 데 사용됩니다 | |
| . 염화나트륨 | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| 스핀코터 | SAWATEC | SM-180-BM | |
| SU-8 2010 포토레지스트 | MicroChem | 주의: SU-8 포토레지스트는 위험하므로 취급 시 주의하고 흡입 및 피부 접촉을 방지하십시오. 가연성, 잠재적으로 발암성 및 환경에 독성이 있습니다. | |
| Sylgard 184 엘라스토머 키트 | VWR | 634165S | 폴리(디메틸실록산)(PDMS) 장치 준비에 사용 |
| 온도 조절 인큐베이터 | Okolab | 곰팡이-미생물 상호 작용 이미징에 사용할 수 있는 예시 인큐베이터 | |
| Ti2-E 반전 에피형광 현미경 | Nikon | MEA54000 | 곰팡이-미생물 상호 작용 이미징에 사용할 수 있는 예시 현미경 |
| 초음파 세척기 S-Line | Fisher Scientific Ltd | FB15050 | |
| 진공 탈착기 | Fisher Scientific Ltd | 10528861 | 실리아화 및 PDMS 탈기는 별도의 탈데케이터에서 수행해야 함 |
| x10/0.3 NA CFI Plan Fluor DL 대물 렌즈 | Nikon | MRH20105 | 진균-미생물 상호 작용 이미징에 사용할 수 있는 예시 대물 렌즈 |
| x20/0.45 NA CFI Plan Fluor DL 대물 렌즈 | Nikon | MRH48230 | 곰팡이-미생물 상호 작용 이미징에 사용할 수 있는 모범적인 대물 렌즈 |
참고문헌
- Zhu, Y. -G., Miller, R. M. Carbon cycling by arbuscular mycorrhizal fungi in soil-plant systems. Trends in Plant Science. 8 (9), 407-409 (2003).
- Dai, Z., et al. Long-term nutrient inputs shift soil microbial fun....
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