저가의 양이온성 고분자 폴리에틸렌이민(PEI)을 사용하여 H9 인간 배아줄기세포(hESCs)에서 shRNA의 안정적인 발현을 위한 렌티바이러스 입자를 생산하고 H9 유래 신경전구세포(NPC)를 고효율로 일시적으로 형질도입했습니다.
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방법 논문
저비용 양이온성 고분자 폴리에틸렌이민(PEI)을 사용하여 hESC 및 NPC에 대한 shRNA의 렌티바이러스 매개 전달
이 논문에서
요약
초록
현재의 프로토콜은 인간 배아 줄기 세포 (hESCs)뿐만 아니라 hESCs로부터 유래 된 신경 전구 세포 (NPCs) 모두에 짧은 헤어핀 RNA (shRNAs)를 고효율로 전달하기위한 렌티바이러스 입자의 사용을 기술한다. 렌티바이러스 입자는 저가의 양이온성 폴리머 폴리에틸렌이민(PEI)을 사용하여 패키징 플라스미드(pAX 및 pMD2.G)와 함께 진입 벡터(운반 shRNAs)를 사용하여 HEK293T 세포를 공동형질감염시킴으로써 생성되었다. 바이러스 입자는 초원심분리를 사용하여 농축되었고, 이는 5 x 107 이상의 평균 역가를 초래하였다. hESCs 및 NPCs 둘 다 퓨로마이신 선택 및 hESC에서의 안정한 발현뿐만 아니라 NPC에서의 일시적인 GFP 발현에 의해 나타난 바와 같이, 이러한 렌티바이러스 입자를 사용하여 높은 효율로 감염될 수 있었다. 더욱이, 웨스턴 블롯 분석은 shRNAs에 의해 표적화된 유전자의 발현에서 유의한 감소를 보여주었다. 또한, 세포는 CNS의 다른 계보로의 후속 분화에 의해 입증 된 바와 같이 분화 잠재력뿐만 아니라 다능성을 유지했습니다. 현재 프로토콜은 shRNA의 전달을 다룬다; 그러나, 과발현 연구를 위해 cDNA의 자궁외 발현에 대해 동일한 접근법이 사용될 수 있다.
서론
배반포 내부 세포괴로부터 유래된 인간 배아줄기세포(hESCs)는 다능성이며, 시험관내 조건 1,2 하에서 외부 인자에 따라 상이한 세포 유형으로 분화될 수 있다. hESC의 잠재력을 완전히 활용하기 위해서는 이러한 세포에 대한 신속하고 신뢰할 수있는 유전자 전달 방법이 필수적입니다. 종래, 사용된 기술은 크게 두 가지 유형으로 분류될 수 있다: 비바이러스성 및 바이러스 유전자 전달 시스템(3,4). 더 자주 사용되는 비바이러스 유전자 전달 시스템은 리포펙션, 전기천공 및 핵형성이다. 비바이러스 전달 시스템은 더 적은 삽입 돌연변이 및 면역원성의 전반적인 감소 5,6 때문에 유리하다. 그러나, 이들 방법은 낮은 형질감염 효율 및 짧은 일시적 유전자 발현의 기간을 초래하며, 이는 장기 분화 연구7에 대한 주요한 한계이다. 전기천공은 리포펙션에 비해 더 나은 형질감염 효율을 초래한다; 그러나, 50% 이상의 세포 사멸
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프로토콜
1. PEI 또는 리포펙타민 3000 시약을 사용한 HEK293T 세포의 형질감염
- HEK293T 세포를 형질감염을 위해 시딩하기 전에 90% 합류할 때까지 5% CO2 및21% O2의 대기를 갖는 가습된 인큐베이터에서 37°C에서 DMEM + 10% FBS + 1x 페니실린/스트렙토마이신으로 배양한다. 높은 역가 바이러스 생산을 위해 상대적으로 낮은 통과 수의 세포를 사용하십시오 (이상적으로는 P30 미만).
- 시드 4 x 106 세포를 100 mm 조직 배양 플레이트에서 완전한 성장 배지 10 mL에 넣고 5% CO2 및21% O2 의 대기를 갖는 가습 조직 배양 인큐베이터에서 밤새 성장시킨다.
- 각 형질감염에 대해, 1.5 mL 원심분리 튜브의 무혈청 DMEM 배지 1 mL에 다음과 같은 비율의 진입 및 패키징 플라스미드를 사용하여 희석된 플라스미드 DNA (1 mg/mL 스톡스)를 묽는다:
엔트리 벡터 = 10 μg
psPAX2.0 = 7.5 μg
pMD2.G = 5 μg - 10초 동안 소용돌이치고 튜브를 실온에서 30초 동안 10,000 x g로 회전시켜 수집한다. ....
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결과
유전자 전달 후, hESCs의 높은 생존력은 필연적으로 요구된다. hESCs의 전기천공에 따른 세포 사멸을 감소시키기 위한 프로토콜의 노력 및 최적화에도 불구하고, 낮은 형질감염 효율(20)과 함께 이들 세포의 전기천공 후에도 50% 이상의 세포 사멸이 여전히 관찰된다. 렌티바이러스 매개 유전자 전달은 유전자 전달의 높은 효율을 가져올 뿐만 아니라 형질도입 후 높은 수준의 세포 생존율을 입증합니다. 아래의 결과는 두 가지 접근법을 제시합니다 : 하나는 GFP를 리포터로 사용하고 hESC 유래 NPC에서 일시적인 발현을, 다른 하나는 장기 분화 실험을위한 hESCs의 안정적인 선택을 위해 퓨로 마이신을 사용합니다.
첫 번째 실험 세트에서, 렌티바이러스 입자는 2세대 렌티바이러스 패키징 플라스미드 psPAX2.0 및 pMD2.G와 함께 GFP를 리포터로 사용하여 pll3.7 벡터를 운반하는 shRNA를 공동형질감염시킴으로써 생성되었다. 렌티.......
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토론
연구 또는 임상 목적을 위해 줄기 세포를 유 전적으로 변형시키는 능력은 hESC의 생물학에 대한 기술과 기본적인 이해에 의해 제한됩니다. 리포펙션 및 전기천공과 같은 마우스 ESC에서 상당한 잠재력을 보인 기술은 hESC에 대해 매우 효율적이지 않으며, 이는 통상적인 방법(20)에 의한 유전자 전달에 대해 악명 높게 어렵다. 이 개념은 기존 기술의 최적화뿐만 아니라 hESC에서 형질감염 효율을 증가시키기위한 새로운 방법의 개발로 이어졌습니다. 이러한 새로운 개발의 초점은 hESC에 대한 효율적이고 안정적인 유전자 전달이었으며 장기간에 걸쳐 hESC의 성장, 다능성 및 분화 잠재력에 최소한의 영향을 미치지 않았습니다. 이러한 엄격한 기준을 충족하는 다양한 새로운 개발 중에는 hESCs21,22로의 렌티바이러스 매개 유전자 전달이 있다. 특정 유전자를 발현하는 렌티바이러스 입자의 제조를.......
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공개 사항
저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.
감사의 글
이 연구는 아랍 에미리트 대학 (UAEU), 보조금 # 31R170 (건강 과학을위한 Zayed 센터) 및 # 12R010 (UAEU-AUA 보조금)의 연구 보조금에 의해 지원되었습니다. 우리는 Randall Morse 교수 (Wadsworth Center, Albany, NY)가 스타일과 문법을 위해 원고를 편집 할 수 있도록 도와 주신 것에 감사드립니다.
모든 데이터는 요청시 사용할 수 있습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 2-메르캅토에탄올 | 인비트로겐 | 31350010 | |
| 38.5 mL, 멸균 + 인증 무료 오픈탑 Thinwall Ultra-Clear 튜브 | Beckman Coulter | C14292 | |
| Accutase | Stem Cell Technologies | 7920 | |
| bFGF 재조합 인간 | 인비트로겐 | PHG0261 | |
| Corning Matrigel 베이스먼트 멤브레인 매트릭스, LDEV-free | Corning | 354234 | |
| Cyclopamine | Stem Cell Technologies | 72074 | |
| DMEM 미디어 | Invitrogen | 11995073 | |
| DMEM 영양 혼합물 F12 | Invitrogen | 11320033 | |
| DPBS w/o: Ca and Mg | PAN Biotech | P04-36500 | |
| 태아 혈청 | Invitrogen | 10270106 | |
| GAPDH (14C10) Rabbit mAb 항체 | CST | 2118S | |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | Stem Cell Technologies | 7174 | |
| HyClone Non Essential Amino Acids (NEAA) 100X 용액 | GE 헬스케어 | SH30238.01 | |
| L 글루타민, 100X | Invitrogen | 2924190090 | |
| L2HGDH 다클론 항체 | Proteintech | 15707-1-AP | |
| L2HGDH shRNA | Macrogen | Seq: CGCATTCTTCATGTGAGAAAT | |
| Lipofectamine 3000 kit | Thermo Fisher | L3000001 | |
| mTesR1 complete media | Stem Cell Technologies | 85850 | |
| Neurobasal medium 1X CTS | Invitrogen | A1371201 | |
| Neuropan 2 보충제 100x | PAN Biotech | P07-11050 | |
| Neuropan 27 보충제 50x | PAN Biotech | P07-07200 | |
| 페니실린 스트렙토마이신 SOL | Invitrogen | 15140122 | |
| pLKO.1 TRC 벡터 | Addgene | 10878 | |
| pLL3.7 벡터 | Addgene | 11795 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| 폴리브레인 감염 시약 | Sigma | TR1003- G | |
| 폴리에틸렌이민, 분지형 | 시그마 | 408727 | |
| psPAX2.0 | Addgene | 12260 | |
| Purmorphamine | Tocris | 4551/10 | |
| Puromycin | Invitrogen | ||
| ROCK 억제제 Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | |
| SB 431542 | Tocris | 1614/10 | |
| 트립신 .05% EDTA | 인비트로젠 | 25300062 | |
| XAV 939 | 토크리스 | 3748/10 |
참고문헌
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: Somatic differentiation in....
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재인쇄 및 허가
