이 연구는 Schizosaccharomyces pombe에서 다중 복제 억제 유전자 스크리닝을위한 프로토콜을 설명합니다. 이 스크린은 게놈 전체 플라스미드 라이브러리를 사용하여 질의 돌연변이 균주와 관련된 기능 상실 표현형의 억제인자 클론(들)을 식별합니다. ell1 null 돌연변이체의 신규한 유전자 억제인자를 이 스크린을 사용하여 확인하였다.
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방법 논문
Schizosaccharomyces pombe에서 다중 복제 억제 인자의 식별을위한 유전자 스크리닝
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
유전적 상호작용의 식별은 다른 유전자와의 기능적 관계 및 생물학적 경로 및 과정에 대한 조직에 대한 통찰력을 제공함으로써 유전자의 기능을 해독하는 강력한 도구입니다. 대부분의 유전자 스크리닝은 처음에 사카로마이세스 세레비시아에에서 개발되었지만, 이러한 유전자 스크리닝을 수행하기 위한 보완적인 플랫폼은 Schizosaccharomyces pombe에 의해 제공되었다. 유전적 상호작용을 확인하는 데 사용되는 일반적인 접근법 중 하나는 기능 상실 돌연변이에서 게놈 전체의 높은 복제 수 플라스미드 라이브러리에서 클론을 과발현한 다음 돌연변이 표현형을 억제하는 클론을 선택하는 것입니다.
이 논문은 S. pombe에서 이 '다중 복제 억제' 기반 유전자 스크리닝을 수행하기 위한 프로토콜을 설명합니다. 이 스크린은 S. pombe 에서 Ell1 전사 신장 인자의 부재와 관련된 유전 독성 스트레스 민감성 표현형의 다중 복제 억제 인자를 식별하는 데 도움이되었습니다. 스크리닝은 질의 ell1 널 돌연변이 균주를 높은 카피 수 S. 폼베 cDNA 플라스미드 라이브러리로 형질전환하고, 유전독성 스트레스 유도 화합물인 4-니트로퀴놀린 1-옥사이드(4-NQO)를 함유하는 EMM2 플레이트 상에서 억제인자를 선택함으로써 시작되었다. 이어서, 플라스미드를 2개의 후보 억제 콜로니로부터 분리하고, 제한 효소에 의해 분해하여 삽입 DNA를 방출하였다. 삽입 DNA 단편을 방출하는 플라스미드를 ell1 결실 균주로 재변형시켜 4-NQO 및 기타 유전독성 화합물의 존재 하에 ell1 결실 돌연변이체의 성장을 회복시키는 이들 억제 플라스미드 클론의 능력을 확인하였다. 결실 표현형의 구조를 보여주는 플라스미드는 ell1 결실 관련 유전독성 스트레스 민감성 표현형의 억제를 담당하는 유전자(들)를 확인하기 위해 시퀀싱되었습니다.
서론
유전적 상호작용의 네트워크는 유전자에 대한 기능적 정보를 제공하고 이러한 유전자가 생체 내에서 관여할 수 있는 경로와 생물학적 과정을 설명합니다. 또한 서로 다른 유전자가 서로 상호 작용하는 방식에 대한 통찰력을 제공하여 특정 표현형 1,2,3을 생성 할 수도 있습니다. 수년에 걸쳐 연구자들은 근본적인 생물학적 질문에 답하고 인간의 질병을 연구하기 위해 다양한 유전자 검사를 설계했습니다. 유전적 상호작용의 확인을 위한 스크리닝은 여러 가지 방법으로 수행될 수 있다. 서로 다른 유전자 스크리닝에서 확인된 유전적 상호작용은 유전자 간의 뚜렷한 기계론적 관계를 나타낼 수 있다. 또한 연구에 따르면 공통된 유전 적 상호 작용 세트는 동일한 경로 또는 복합체 4,5에 속하는 단백질을 암호화하는 유전자에 의해 공유됩니다. 따라서, 유전적 상호작용 네트워크는 세포에서 기능적 조직을 확립하는데 사용될 수 있으며, 여기서 가장 유사한 프로파일을 공유하는 유전자는 동일한 복합체 또는 경로에 속하고, 다소 덜 유사한 프로파일을....
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프로토콜
1. cDNA 라이브러리를 질의 S. pombe 돌연변이 균주로 형질전환하여 멀티카피 억제인자를 스크리닝하는 방법
참고: 표준 리튬-아세테이트 방법27을 따라 S. pombe cDNA 라이브러리를 몇 가지 수정을 통해 질의 S. pombe ell1Δ 균주로 변환했습니다.
- S. pombe ell1 Δ균주를 아데닌, 류신 및 우라실의 각각 225μg/mL가 보충된 YE 배지(표 1) 플레이트에서 32°C에서 성장시킨다. 위의 플레이트에서 ell1Δ 균주의 접종물로 가득 찬 루프를 아데닌, 류신 및 우라실이 각각 225μg/mL가 보충된 15-20mL의 YE 배지에 접종합니다. 이를 진탕(200-250 rpm)하면서 32°C에서 밤새 배양한다.
- 다음날, 원하는 보충제와 함께 100mL의 새로운 YE 배지에서 밤새 배양물을 0.3의 OD 600nm(600nm에서의 광학 밀도)로 희석하고, OD600nm가 중간 로그 상에 도달할 때까지 200-250rpm에서 진탕하면서 32°C에서 배양한다.
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결과
S. pombe에서 ell1 결실 관련 유전독성 스트레스 민감도의 다중 복제 억제인자에 대한 스크리닝
질의 ell1 결실 돌연변이 균주의 기능 상실 표현형의 멀티카피 억제인자를 확인하기 위해 위에서 설명한 프로토콜을 사용하여 유전자 스크리닝을 수행하였다. 4-NQO 유전독성제의 존재 하에서 관찰된 ell1 결실 균주의 성장 관련 민감도를 멀티카피 억제인자를 선택하기 위해 기능 상실 표현형으로서 채택하였다. 도 1은 유전자 스크린의 개략적인 표현을 나타낸다. 스크린을 시작하기 위해, 4-NQO의 존재 하에 그의 이소제닉 야생형 균주 (h-ura4-D18 leu1-32 ade6-M210 can1-1 ell1Δ::kanMX6)의 유전독성 스트레스 민감도를 그의 이소제닉 야생형.......
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토론
효모는 진핵 생물에 걸쳐 진화 적으로 보존되는 기본적인 생물학적 과정과 경로를 조사하는 데 널리 사용되었습니다. 다양한 생화학적, 유전적 및 분자적 절차에 대한 순응성과 함께 유전 및 게놈 도구의 가용성은 효모를 유전 연구를 위한 훌륭한 모델 유기체로 만듭니다34,35,36. 수년에 걸쳐, 효모 연구자들은 개별 유전자의 기능뿐만 아니라 이들이 관여 할 수있는 경로 및 생물학적 과정을 밝힐 수있는 유전 적 상호 작용을 식별하기 위해 다양한 유전자 스크리닝을 설계했습니다10,11,17,37. 유전적 상호작용을 식별하는 일반적이고 유용한 스크.......
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공개 사항
저자는 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 인도 정부 생명공학부의 연구 보조금(보조금 번호. BT / PR12568 / BRB / 10 / 1369 / 2015)를 Nimisha Sharma로. 저자는 S. pombe cDNA 라이브러리를 선물한 Charles Hoffman 교수(미국 보스턴 칼리지)와 효모 플라스미드에 대해 Susan Forsburg 교수에게 감사를 표합니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 4-NQO | 시그마 | N8141 | |
| 아세트산, 빙하 | 시그마 | 1371301000 | |
| 아데닌 황산염 | Himedia | GRM033 | |
| 한천 | Himedia | GRM026 | |
| 아가로 로즈 | Lonza | 50004L | |
| 염화 암모늄 | Himedia | MB054 | |
| BamHI | Fermentas | ER0051 | |
| 비오틴 | Himedia | RM095 | |
| 붕산 | Himedia | MB007 | |
| 염화칼슘 | 시그마 | C4901 | |
| 클로로포름 : 이소 아밀 알코올 24 : 1 | 시그마 | C0549 | |
| 구연산 | Himedia | RM1023 | |
| 어 고환의 단일 가닥 DNA | |||
| EDTA 시 | 그마 | 324503 | |
| 염화제이철 육수화물 | Himedia | RM6353 | |
| 포도당 | Amresco | 188 | |
| 이오노시톨 | Himedia | GRM102 | |
| 이소프로판올 | 퀄리겐 | Q26897 | |
| 류신 | Himedia | GRM054 | |
| 리튬 아세타태 | 시그마 | 517992 | |
| 염화마그네슘 육수화물 | Himedia | MB040 | |
| 몰리브딕산 | Himedia | RM690 | |
| 니코틴산 | Himedia | CMS177 | |
| PEG, MW 4000 | Sigma | 81240 | |
| 펜토틴산 | Himedia | TC159 | |
| 페놀 | Himedia | MB082 | |
| 플라스미드 추출 키트 | Qiagen | 27104 | |
| 염화칼 | 시그마 | P9541 | |
| 칼륨 수소 프탈레이트 | 머크 | DDD7D670815 | |
| 요오드화 칼륨 | 히메디아 | RM1086 | |
| RNAse | 발효 | EN0531 | |
| SDS | 히미디어 | GRM205 | |
| 수산화나트륨 | 히메디 | GRM1183 | |
| 황산나트륨 | Himedia | RM1037 | |
| Tris free Base | Himedia | MB209 | |
| Uracil | Himedia | GRM264 | |
| 효모 추출물 분말 | Himedia | RM668 | |
| 아연 황산염 Heptahydrate | Merc | DJ9D692580 |
참고문헌
- Zuk, O., Hechter, E., Sunyaev, S. R., Lander, E. S. The mystery of missing heritability: Genetic interactions create phantom heritability. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (4), 1193-1198 (2012).
- Bloom, J. S., Ehrenreich, I. M., Loo, W. T., Lite, T. -L. V., Kruglyak, L.
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재인쇄 및 허가
