Method Article

치료 유도 노인성 암 세포에서 다중 형광 노화 마커의 동시 이미징 및 유동 세포 측정 기반 검출

DOI:

10.3791/63973

⸱

July 12th, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Johannes Kepler University Linz, 2Charité - University Medicine Berlin, 3Max-Delbrück-Center for Molecular Medicine in the Helmholtz Association

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기서 우리는 단일 세포에서 다중 노화 관련 마커의 시각화 및 정량화를 위한 유세포 측정 기반 방법을 제시한다.

Abstract

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화학 요법 약물은 암세포에서 돌이킬 수없는 DNA 손상을 유도하여 아폽토시스 또는 조기 노화를 유발할 수 있습니다. 세포사멸 세포 사멸과는 달리, 노화는 암세포의 번식을 억제하는 근본적으로 다른 기계이다. 수십 년간의 과학적 연구는 암세포와 기질 세포를 조절하는 종양 및 미세 환경에서 노인성 암 세포의 복잡한 병리학 적 효과를 밝혀 냈습니다. 새로운 증거는 노화가 암 치료 중 강력한 예후 인자이므로 암 샘플에서 노화 세포의 신속하고 정확한 검출이 필수적임을 시사합니다. 이 논문은 암세포에서 치료 유도 노화 (TIS)를 시각화하고 검출하는 방법을 제시합니다. 미만성 거대 B 세포 림프종 (DLBCL) 세포주를 마포스파미드 (MAF) 또는 다우노루비신 (DN)으로 처리하고, 노화 마커, 노화-관련 β-갈락토시다제 (SA-β-gal), DNA 합성 마커 5-에티닐-2'-데옥시우리딘 (EdU), 및 DNA 손상 마커 감마-H2AX (γH2AX)에 대해 조사하였다. 유세포 분석기 이미징은 단기간에 고해상도 단일 세포 이미지를 생성하여 암세포의 세 가지 마커를 동시에 시각화하고 정량화하는 데 도움이 될 수 있습니다.

Introduction

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다양한 자극은 세포 노화를 유발하여 세포가 안정된 세포 주기 정지 상태로 진입하게 할 수 있습니다. 이러한 자극에는 내재적 신호 변화 또는 외적 스트레스가 포함됩니다. 내재적 신호에는 진행성 텔로미어 단축, 텔로미어 구조의 변화, 후성유전학적 변형, 프로테오스타시스 장애, 미토콘드리아 기능장애, 종양유전자의 활성화가 포함된다. 외인성 스트레스에는 염증 및/또는 조직 손상 신호, 방사선 또는 화학적 치료, 영양 결핍 1,2,3,4가 포함됩니다. 뚜렷한 유형의 노화 중에서 가장 일반적으로 볼 수 있고 잘 연구 된 것은 복제 노화, 종양 유전자 유도 노화 (OIS), 방사선 유도 노화 및 치료 유도 노화 (TIS)입니다. OIS는 비정상적인 종양유전자 활성화에 의해 생성된 복제 스트레스에 의해 야기되는 유전독성 손상에 대한 급성 세포 반응이며, 신생물성 병변으로부터 본격적인 종양으로의 병리학적 진행을 어느 정도 예방할 수 있다. TIS는 종양 세포가 화학 요법 약물 또는 이온화 방사선 5,6

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Protocol

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1. 세포 노화를 유도하기 위해 마포스파미드 또는 다우노루비신 처리를 이용한 DLBCL 세포주

참고: 이 프로토콜은 부착성 암세포에도 적용됩니다. 세포 크기에 따라, 시드 1-2 × 10개의 5개 세포를 6-웰 플레이트의 하나의 웰에 넣고 플레이트를5 %CO2, 37°C 인큐베이터에서 밤새 처리 전에 인큐베이션한다. 프로토콜 단계는 서스펜션 셀과 동일하지만 두 가지 예외가 있습니다. 먼저, 세포는 단계 3.4 후에 플레이트 밖으로 트립신화될 필요가 있다. 둘째, 세척 단계는 트립신화 전에 원심분리 없이 수행된다.

  1. DLBCL 세포를 계수하고 1 × 10 6 세포/mL를 웰당 배지 4 mL에 넣고6 -웰 배양 플레이트에 넣는다. DLBCL 세포를 10% 소 태아 혈청(FBS)과 100 U/mL 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 RPMI-1640 배지에서 배양하십시오.
  2. MAF (5 μg / mL) 또는 DN (20 ng / mL)을 세포 배양물에 넣고 플레이트를 부드럽게 흔들어 혼합하십시오.
    참고: MAF 및 DN은 안정적이지 않습니다. DMSO에 용해시킨 후, 원액을 분취하여 -20°C에서 보관해야 한다. 동결 / 해....

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Results

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보상 매트릭스는 단색 제어 샘플의 기록된 데이터를 로딩하여 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 생성되었다. 보충 그림 S1에 나타난 바와 같이, EdU에서 C12 FDG로의 무시할 수 없는(계수 값 ≥0.1) 광 유출은 누화 계수 값 0.248로 검출된 반면, 다른 채널들 사이의 누화는 유의하지 않았다. 네 개의 상이한 DLBCL 세포주를 5 μg/mL MAF 또는 20 ng/mL DN로 처리하여 세포 노화를 유도하고 기존의 SA-β-gal 염색 또는 이미징 유세포 분석기 방법을 사용하여 분석하였다.

KARPAS422, WSU-DLCL2 및 OCI-LY1 세포의 70% 이상이 SA-β-gal 양성으로 나타나는 노화 상태에 들어간 반면, SU-DHL6은 MAF 및 DN에 의한 노화 유도에 완전히 내성을 보였다(보충 그림 S2A). 주목할 만하게, MAF 및 DN은 또한 극적으로 비록 아니지만 모든 DLB.......

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Discussion

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이 방법은 화학 요법 치료시 네 개의 다른 DLBCL 세포주의 노화 진입 능력을 밝은 필드 이미징 및 유세포 측정 기반 정량화로 조사했습니다. 단일 세포 수준에서, 우리는 처리 된 KARPAS422 및 WSU-DLCL2 세포에서 주요C12 FDG + EdU-Ki67 + 노인성 집단을 성공적으로 검출했으며, OCI-LY1 세포에서는 SU-DHL6 세포주가 치료에 내성을 갖는 반면, OCI-LY1 세포에서는 더 적은 정도까지 성공적으로 검출했습니다. 세포주 사이의 노화 진입 능력의 차이는 그들의 뚜렷한 게놈 결함16,17에 의해 설명될 수 있다. 그러나, 부적절한 세포 배양 밀도 또는 약물 농도는 또한 노화 유도성에 영향을 미칠 수 있다. 세포 밀도 및 약물 농도의 연속 희석은보다 포괄적 인 검사를 위해 신중하게 선택해야합니다. 주목할 만하게, 이 방.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작품은 Johannes Kepler University Linz (BERM16108001)의 Yong Yu에 대한 보조금으로 지원되었습니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Alexa Fluor 647 anti-H2A.X Phospho (Ser139) 항체Biolegend613407
Anti-Ki-67 Mouse Monoclonal 항체 (Alexa Fluor 647)Biolegend350509
C12FDG (5-Dodecanoylaminofluorescein Di-β-D-Galactopyranoside)Fisher Scientific11590276
Chloroquin -diphosphatSigma aldrichC6628
클렌저 (Coulter Clenz)Beckman Coulter8546929
Click-iT EdU Pacific Blue Flow Cytometry Assay KitThermo ScientificC10418
DaunorubicinMedchemexpressHY-13062A
Debubbler (70% Isopropanol)Millipore1.3704
이미지 분석 소프트웨어 (Amnis  아이디어  6.3)LuminexCN-SW69-12
기기 및 이미징 소프트웨어 (Amnis  이미지스트림X  Mk II 이미징 유세포 분석기 시스템 및 INSPIRE 소프트웨어)Luminex100220
KARPASDSMZACC 31
mafosfamide cyclohexylamineNiomechD-17272
OCI-LY1DSMZACC 722
ParaformaldehydeFisher Scientific11473704
PETG (2-Phenylethyl-β -D-thiogalactosid) 시그마 알드리치P4902
사포닌시그마 알드리치47036
칼집밀리포어BSS-1006-B
ImageStream용 SpeedBead 키트 Luminex400041
살균기 (0.4-0.7% 차아염소산염)VWR JT9416-1
SU-DHL6DSMZACC 572
WSU-DLCL2DSMZACC 575

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S. The essence of senescence. Genes and Development. 24 (22), 2463-2479 (2010).
  2. Di Micco, R., et al. Oncogene-induced senescence is a DNA damage response triggered by DNA hyper-replication. Nature. 444 (7119),....

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Imaging Flow CytometrySenescence MarkersTherapy Induced SenescenceFluorescent Marker DetectionDLBCL Cell LinesGamma H2AX DetectionEdU IncorporationC12 FDG StainingSingle Cell ImagingNuclear Foci Quantification

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