본 프로토콜은 표면 항원 및 단백질 화물의 후속 프로파일링과 함께 말초 혈액 및 고형 조직으로부터 세포외 소포를 추출하는 방법을 설명한다.
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방법 논문
혈장 및 고형 조직에서 추적 가능하고 기능화된 세포외 소포의 분리 및 분석
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
순환 및 조직 상주 세포외 소포(EV)는 새로운 테라노스틱 바이오마커로서 유망한 표적을 나타내며 유기체 항상성 유지 및 광범위한 질병의 진행에 중요한 역할을 합니다. 현재 연구는 엔도솜 기원을 가진 내인성 엑소좀의 특성화에 초점을 맞추고 있지만, 원형질막에서 흘러나오는 미세소포는 모세포의 막 시그니처를 요약하는 풍부한 표면 분자를 특징으로 하는 건강과 질병 분야에서 점점 더 주목을 받고 있습니다. 여기서는 혈장 및 뼈와 같은 고형 조직에서 EV를 추출하고 특성화하기 위한 차등 원심분리를 기반으로 재현 가능한 절차가 제시됩니다. 이 프로토콜은 EV의 표면 항원 및 단백질 화물의 후속 프로파일링을 추가로 설명하며, 따라서 파생을 추적할 수 있고 잠재적 기능과 관련된 구성 요소로 식별됩니다. 이 방법은 생물학적, 생리학적, 병리학적 연구에서 EV의 상관적, 기능적, 기계론적 분석에 유용할 것입니다.
서론
세포외 소포체(EV)는 다양한 생리학적 및 병리학적 사건2에서 중요한 역할을 하는 세포 방출 지질 이중층으로 둘러싸인 세포외 구조1를 정의하기 위해 제안되었다. 건강한 세포에서 방출되는 EV는 크게 두 가지 주요 범주, 즉 세포내 세포내 트래피킹 경로3를 통해 형성된 엑소좀(또는 작은 EV)과 세포의 원형질막4의 바깥쪽 출아에 의해 발달하는 미세소포(또는 대형 EV)로 나눌 수 있다. 많은 연구가 시험관 내에서 배양된 세포에서 채취한 EV의 기능에 초점을 맞추고 있지만5, 순환계나 조직에서 유래한 EV는 더 복잡하고 이질적이어서 생체 내 유기체의 실제 상태를 반영하는 이점이 있다 6. 또한, 거의 모든 종류의 조직이 생체 내에서 EV를 생산할 수 있으며, 이러한 EV는 조직 내에서 메신저 역할을 하거나 다양한 체액, 특히 말초 혈액에 의해 전달되어 전신 통신을 촉진할 수 있다7. 순환계와 조직 속의 전기차는 질병 진단과 치료의 표적이기도 하다
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프로토콜
동물실험은 제4군의과대학 기관동물관리이용위원회 가이드라인과 ARRIVE 가이드라인에 따라 수행하였다. 본 연구에서는 8주령의 C57Bl/6 마우스(암컷 또는 수컷 모두 선호 없음)를 사용했습니다. 혈장 및 조직 EV를 분리하는 단계는 그림 1에 나와 있습니다. 플라즈마는 체액으로부터 EV 분리 절차를 설명하기 위해 대표적으로 사용됩니다. 상악골은 고형 조직으로부터 EV 분리 절차를 설명하기 위해 대표적으로 사용됩니다.
1. 혈장 및 상악골 시료의 제조
- 아래 단계에 따라 혈장 샘플을 준비합니다.
- 표준 실험실 저울을 사용하여 마우스의 체중을 결정하십시오.
- 20 μL, 2 mg/mL의 헤파린을 1.5 mL 원심분리기 튜브에 넣고 믹서 장치( 재료 표 참조)를 사용하여 헤파린이 튜브 벽에 부착되도록 합니다.
알림: 항응고 튜브를 사용하여 혈액을 직접 채취할 수도 있습니다. - 펜토바르비탈 나트륨 50mg/kg을 복강내 주사하여 마우스를 마취합니다( 재료 표 참조). 엄지와 집게 손가락으로 쥐의 목을 잡은 후 새끼 손가락으로 꼬리와 왼쪽 ....
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결과
실험 워크플로에 따라 EV는 말초 혈액 및 고형 조직에서 추출할 수 있습니다(그림 1). 생후 8주령 마우스의 상악골은 약 0.1 ± 0.05 g이며, 마우스로부터 약 300 μL의 혈장을 채취할 수 있다. 프로토콜 단계에 따라 각각 0.3mg 및 3μg의 EV를 수집할 수 있습니다. TEM과 NTA에 의해 분석된 바와 같이, EV의 전형적인 형태학적 특성은 직경이 50-300nm 범위인 둥근 컵 모양의 막 소포입니다(그림 2). FC는 유용한 대조군 하에서 막 염료 표지 EV를 검출할 수 있으며, FC 분석은 모 세포에서 유래했음을 암시하는 EV에서 발현된 특정 막 마커의 백분율을 보여줍니다(그림 3). 웨스턴 블롯 분석은 혈장 EV와 골 EV의 단백질 함량을 대표하는 PGD와 PKM2의 발현을 각각 보여주며, 대사 상태를 나타냅니다(
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토론
EV의 특징, 운명 및 기능을 연구할 때 높은 수율과 낮은 오염으로 EV를 분리하는 것이 중요합니다. 밀도 구배 원심분리(DGC), 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 및 면역포획 분석(immunocapture assay)과 같은 EV를 추출하기 위한 다양한 방법이 있습니다 4,20. 여기서 가장 일반적으로 사용되는 방법 중 하나 인 차등 원심 분리가 사용되었습니다. 이것의 장점은 시간이 많이 걸리지 않고, 제한된 샘플에서 쉽게 분리할 수 있는 높은 수율의 EV를 생성하고, 사용된 샘플 소스를 기반으로 방법을 수정할 수 있다는 것입니다. 순환하는 EV의 기능을 분석하려면 혈청보다 생체 내 EV의 실제 상태를 더 잘 반영할 수 있는 혈장을 선택하는 것이 좋습니다. 이는 많은 혈소판 유래 EV가 혈청 수집을 위한 혈전 형성 과정 동안 방출되는 반면, 혈소판은 혈장(22)으.......
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공개 사항
저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (32000974, 81870796, 82170988 및 81930025)과 중국 박사후 과학 재단 (2019M663986 및 BX20190380)의 보조금으로 지원되었습니다. AMFU (National Experimental Teaching Demonstration Center for Basic Medicine)의 도움에 감사드립니다.
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참고문헌
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- Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Théry, C.
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재인쇄 및 허가
