3D 볼륨 뷰 이미지를 사용한 터널링 나노튜브의 검출 및 정량화

Summary

터널링 나노 튜브 (TNT)는 주로 인접한 세포를 연결하여 세포 간 통신을 촉진하는 개방형 F- 액틴 막 나노 튜브입니다. TNT를 다른 세포 돌출부와 구별하는 주목할만한 특징은 세포 사이의 나노 튜브의 호버링 특성입니다. 여기에서는 컨포칼 z-스택 이미지의 3D 볼륨 뷰를 구성하여 TNT의 특성을 분석합니다.

Abstract

최근의 발견에 따르면 세포는 나노 크기의 액틴-막 도관, 즉 "터널링 나노 튜브"(TNT)를 통해 직접적이고 장거리 세포 간 전달을 수행합니다. TNT는 50nm에서 1μm 사이의 직경을 가진 이웃 세포 사이의 연속성을 매개하는 개방형 지질 이중층으로 둘러싸인 막 확장으로 정의됩니다. TNT는 처음에는 신경 세포에서 입증되었지만 연속적인 연구에서 신경 퇴행성 질환, 바이러스 감염 및 암과 같은 여러 세포 유형 및 질병에서 TNT의 존재가 밝혀졌습니다. 여러 연구에서 이웃 세포 사이의 폐쇄형, 전기 결합 막 나노 구조를 TNT 또는 TNT 유사 구조로 언급했습니다.

종말점에서의 막 연속성 측면에서 미세 구조의 해명은 기술적으로 어렵습니다. 또한, 세포-세포 통신에 대한 연구는 특정 마커가 없기 때문에 종래의 방법을 사용한 TNT의 특성 분석 측면에서 도전적이다. TNT는 주로 F- 액틴 기반의 개방형 막 돌출부로 정의됩니다. 그러나 한 가지 주요 한계는 F- 액틴이 모든 유형의 돌출부에 존재하여 TNT를 다른 돌출부와 구별하기가 어렵다는 것입니다. F- 액틴 기반 TNT의 주목할만한 특징 중 하나는 이러한 구조가 지층을 건드리지 않고 두 세포 사이를 맴돌고 있다는 것입니다. 따라서, 별개의 F- 액틴 염색 TNT는 세포 사이의 호버링에 기초하여 필로 포디아 및 신경 돌기와 같은 다른 돌출부와 편리하게 구별 될 수있다.

우리는 최근 액틴 의존성 엔도 사이토 시스를 통한 올리고머 아밀로이드 -β_1-42 (oAβ)의 내재화가 활성화 된 p21- 활성화 키나아제 -1 (PAK1)을 자극하여 SH-SY5Y 신경 세포 사이에서 phospho-PAK1과 공동 발현되는 F- 액틴 함유 TNT의 형성을 매개한다는 것을 보여주었습니다. 이 프로토콜은 oAβ 처리된 신경 세포에서 F-액틴 및 포스포-PAK1-면역염색 막 돌출부의 캡처된 z-스택 이미지에서 TNT를 식별하고 특성화하기 위한 3D 부피 분석 방법을 설명합니다. 또한, TNT는 F- 액틴 - 및 β -III 튜 불린 - 면역 염색 막 도관을 기반으로 한 신경 돌기 및 신경 세포 파생물을 개발하는 것과 구별된다.

Introduction

터널링 나노 튜브 (TNT)는 F- 액틴 기반의 주로 개방형 막 도관이며화물 및 세포 기관의 세포 간 이동에 중요한 역할을합니다¹. TNT의 독특한 특징은 지층과의 접촉없이 이웃 세포를 연결한다는 것입니다. 길이는 10-300 μm 이상이며 직경은 50 nm에서 1 μm ^2,3 사이입니다. TNT는 일시적인 구조이며 수명은 몇 분에서 몇 시간 사이입니다. TNT는 PC12 뉴런 세포¹에서 처음 입증되었습니다. 나중에 수많은 연구에서 시험관 내 및 생체 내^여러 세포 유형에서 존재하는 것으로 나타났습니다 ^4,5. 여러 연구에서 신경 퇴행성 질환, 암 및 바이러스 감염 ^6,7,8과 같은 다양한 질병 모델에서 TNT의 병리학 적 중요성이 밝혀졌습니다.

TNT의 ....

Protocol

참고: DMEM/F-12 배지에서 배양된 SH-SY5Y 세포를 7일 동안 10μM 레티노산으로 분화시키고 37°C(5%_CO2)에서 2시간 동안 1μM oAβ 올리고머로 처리했습니다. 처리 후, 세포를 카르노프스키의 고정 용액으로 고정하고, 포스포-PAK1 (Thr423)/PAK2 (Thr402) 항체 및 F-액틴-결합 팔로이딘으로 이중 면역염색하였다. 나중에 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 컨포칼 z-스택 이미지를 촬영했습니다. TNT는 수동 계수로 정량화되었으며 3D 볼륨 뷰 이미지를 구성하고 지층을 건드리지 않고 두 세포 사이를 호버링하는 특성에서 구조를 식별하여 다른 신경돌기/세포 돌출부와 구별되었습니다(그림 1).

1. 세포 배양 및 분화

1. SH-SY5Y 뉴런 세포를 DMEM/F12(Ham's) 배지에서 10% 태아 소 혈청(FBS) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신-네오마이신 혼합물(PSN)로 1:1로 배양합니다. 바닥에 부착된 접시 중앙에 #14 커버슬립으로 구성된 1.5mm 웰이 있는 35mm 이미징 접시에 세포를 파종합니다. 이미징 접시에 세포를 12,000 cells/^cm2 의 농도로....

Results

여기에서는 컨포칼 z-스택 이미지에서 3D 볼륨 뷰를 구성하여 SH-SY5Y 신경 세포에서 oAβ 유도 TNT를 식별하고 특성화합니다(그림 1). 세포를 F-액틴 및 포스포-PAK1로 이중 면역염색하였다. 면역염색된 세포의 공초점 z-스택 이미지를 분석하여 TNT를 식별했습니다(그림 2). 또한, DIC 이미지를 분석하여 F-액틴- 및 포스포-PAK1 염색된 TNT 구조가 세포 사이의 막 도관임을 확인하였다(도 3). 또한, 세포를 F-액틴 및 β-III 튜불린으로 이중 면역염색하였다(도 4). TNT 유사 F- 액틴 및 β-III 튜 불린 이중 양성 막 도관은 F- 액틴 양성 TNT와 구별되었습니다 (그림 4). phospho-PAK1(또는 활성화된 PAK1) 및.......

Discussion

지난 2 년 동안 여러 연구자들은 TNT¹⁸의 구조를 이해하고 특성화하려고 노력해 왔습니다. 특정 마커의 부족은 진행을 방해하고 TNT를 식별, 특성화 및 정량화하는 데 사용할 수 있는 편리하고 표준화된 방법에 대한 수요가 증가하고 있습니다. TNT는 두 세포 사이를 맴도는 F-액틴 기반 막 도관으로 정의됩니다. 연구에 따르면 β 튜 불린 양성, 폐쇄 종말, 발달 신경 돌기는 두 개의 먼 세포 사이를 맴돌며 TNT 유사 구조와 유사합니다^12,13. 따라서 TNT는 액틴에 대해서만 양성이고 멀리 떨어진 두 세포 사이를 맴도는 막 도관이라는 점에서 신경돌기 및 기타 TNT 유사 구조와 식별되고 구별됩니다. 연구자들은 종종 이미징 전에 고정 중에 손상되지 않은 TNT 구조를 얻는 것이 어렵다는 것을 발견합니다²⁴. 이 문제를 극복하기 위해 우리는.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
#1.5 커버 슬립으로 만든 14mm 웰 크기의 35mm 접시	Cellvis	D35-14-1.5-N	염색 실험을 위한 세포 시드에 사용되는 이미징 접시
Aβ (1-42) 1mg	AnaSpec	#64129	세포를 치료하기 위한 아밀로이드 베타의 올리고머
Alexa flour 488 Goat Anti-rabbit IgG (H+L)	Invitrogen	A11070	phospho-PAK1
에 대한 2차 항체생물 안전 작업대	Thermo Scientific (MSC Advantage)	51025411	세포 배양
CO2 인큐베이터	Thermo Electron Corporation (Heraeus Hera Cell 240)	51026556	체온 또는 체온 근처에서 세포 성장용
컨포칼 레이저 스캐닝 현미경	ZEISS (Carl Zeiss)	LSM 880	초해상도
DABCO [1,4-Diazobicyclo-(2,2,2) octane]	Merck	8034560100	Anti-bleaching reagent
DAPI(4′,6-diamidino-2-phenylindole)	Sigma	D9542-1MG	Neuclear stainer
DMEM media	Gibco	11965092	100uM의 A&beta 제조에 사용됩니다. (1-42)
DMEM/F12 (DMEM과 Ham의 1:1 혼합' s F12)	Gibco	12500062	SH-SY5Y
DMSO (Dimethyl sulphide) 세포 배양 등급	Cryopur	CP-100	세포 배양 등급 레티노산
DMSO (Dimethyl sulphide) 분자 등급	Himedia	MB058	건조 된 A &beta의 용해제 중 하나로 사용됩니다. (1-42)
소 태아 세럼	Gibco	16000044	배양 배지의 주요 보충제 (미국 유래)
포르말린 고정액 (중성 완충 10 %)	시그마 알드리치	HT5014-120ML	카르노프스키 고정액
글루타르알데히드 (등급 I, H2O의 25%)	카르		노프스키 고정액
HFIP(1,1,1,3,3,3-헥사플루오로-2-프로판올) 용액	TCI	H024	의 성분A&beta를 용해하는 데 사용됩니다. (1-42) 1mg
이미지 처리/분석 소프트웨어: FIJI (ImageJ)	National Institute of Health(NIH)		이미지를 처리/분석하고 "volume viewer"라는 플러그인을 사용하여 TNT와 신경돌기를 구별하는 데 사용됩니다.
동결 건조기	그리스도, 알파	2.4 LDplus	0.05 mg A&beta의 분취액; (1-42)는 -20 °에 저장할 수 있습니다. C 동결 건조 후 만
페니실린-스트렙토 마이신-네오 마이신 혼합물	Thermo fisher Scientific	15640055	항생제 혼합물
Phalloidin-iFlor 555	Abcam	ab176756	F-actin 결합 염색
Phospho-PAK1 (Thr423) / PAK2 (Thr402) [토끼]	CST	# 2601	1 차 항체
Tubulin Beta 3 (TUBb3)에 대한 다클론 항체	clone	PAE711Hu01	1 차 항체
레티노 산	Sigma-Aldrich	R2625-50MG	분화 시약
사포닌	Merck	8047-15-2	면역 염색의 배양 완충액에 사용되는 세제
수조 초음파 발생기 (Quart, 배수 밸브 히터)	초음파 세척기	3.0 L / 3.2	A&beta를 용해하는 데 사용되는 Sonicator; (1-42) 스톡, 100 µ를 준비하는 동안 DMSO를 첨가한 후; M A&베타; (1-42)
ZEN Microscopy software	ZEISS (칼 자이스)		스마트 자동화로 컨포칼 현미경 이미지를 획득하는 이미징 소프트웨어