체외 괴사성 장염의 Apical-Out Enteroid 모델

요약

이 프로토콜은 극성이 역인 작은 장 장내염을 활용하여 정점 표면에 접근 할 수있는 apical-out 괴사 장염 (NEC) 인 - 접시 모델을 설명합니다. 우리는 NEC 관련 상피 파괴를 검출하기위한 면역 형광 염색 프로토콜 및 NEC-in-a-dish 프로토콜을 실시한 apical-out enteroids의 생존력을 결정하는 방법을 제공합니다.

초록

괴사 성 장염 (NEC)은 장내 염증과 괴사를 특징으로하는 조산아에 영향을 미치는 치명적인 질병입니다. 엔테로이드는 최근 위장 병리를 모델링하는 유망한 시스템으로 부상했습니다. 그러나 현재 사용되는 엔테로이드 조작 방법은 상피의 정점 표면 (3 차원 [3D])에 대한 액세스가 부족하거나 시간이 많이 걸리고 자원 집약적 인 (2 차원 [2D] 단층)입니다. 이러한 방법은 종종 모델이 생리적으로 번역 가능해지기 위해 미세 주입과 같은 추가 단계가 필요합니다. 여기에서, 우리는 장내 극성을 역전시켜 시험관 내에서 NEC를 연구하기위한 생리 학적으로 관련되고 저렴한 프로토콜을 설명하며, 그 결과 정점 표면이 바깥쪽으로 향하게됩니다 (apical-out). 노목스 또는 저산소 조건 하에서 종양 괴사 인자-알파 (TNF-α) 또는 리포폴리사카라이드 (LPS)에 노출된 후 장내 장벽 완전성 및 접합 단백질 발현을 검사하기 위한 면역형광 염색 프로토콜이 또한 제공된다. 24시간 동안 노목성 또는 저산소 LPS 또는 TNF-α에 노출된 3D apical-out enteroids의 생존력도 또한 평가된다. 저산소증과 함께 LPS 또는 TNF-α에 노출된 엔테로이드는 상피 구조의 파괴, 부착물 접합 단백질 발현의 손실 및 세포 생존력의 감소를 나타내었다. 이 프로토콜은 NEC 요법의 잠재적 상피 표적을 식별하고 치료제에 대한 조기 장 반응을 연구하는 생리학적으로 관련되고 비용 효율적인 플랫폼을 제시하는 새로운 apical-out NEC-in-a-dish 모델을 설명합니다.

서론

조산아의 최대 10 %에서 발생하는 소장의 심각한 염증성 질환 인 괴사 성 장염 (NEC)은 일반적으로 높은 이환률 및 사망률 ^1,2과 관련이 있습니다. 외과 적 개입이 필요한 매우 낮은 출생 체중 (<1500g) 유아의 사망률이 50 %에 근접하는 것은 드문 일이 아닙니다³. NEC의 정확한 병인은 현재 이해되지 않았지만, 수식 먹이기와 같은 위험 요소는 질병^2,4의 발달에서 dysbiosis^, 미성숙 장 상피 및 기능 장애 장 장벽과 같은 생리 학적 이상을 가진 화합물로 생각됩니다. 상당한 노력에도 불구하고, NEC의 예방 또는 치료에 거의 진전이 없었다 지난 십 년^{동안 5}. NEC 및 관련 장 상피 장벽 기능 장애를 연구하기위한 새로운 시험관 내 방법은 동물 모델의 연구 결과가 지금까지 침대 옆으로 잘못 번역 된 것처럼 질병의 병인에 대한 이해를 증진시키는 데 필요합니다⁶.

다수의

프로토콜

이 연구의 모든 동물 절차는 오클라호마 대학 건강 과학 센터 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다. 조산 비인간 영장류(NHP, 90% 임신, 올리브 비봉, 파피오 아누비스)로부터의 소장 편의 샘플을 별도의 연구를 위해 안락사 후 수득하였다(프로토콜 #101523-16-039-I).

1. 아피칼 아웃 엔테로이드 NEC-in-a-dish 모델 구축

1. 배지 및 엔테로이드 치료의 제조
   참고: 일단 표준 무균 기술에 따라 제조되면, 매체는 4°C에서 최대 1주일 동안 저장될 수 있다.
   1. 50mL의 인간 오가노이드 성장 배지와 50mL의 오가노이드 보충제를 혼합하여 무항생제 배지(AFM) 를 준비합니다(자료표 참조). 9,900 μL의 PBS에 0.5 M EDTA 100 μL를 첨가하여 5 mM 에틸렌디아민테트라아세트산/1x 인산염 완충 식염수(EDTA/PBS)를 제조하였다.
   2. Chill Dulbecco의 변형된 독수리의 배지/영양소 햄의 혼합물 F12 + 15 mM HEPES 버퍼(DMEM/F12)를 2-8°C에서 냉각시킨다.
   3. 100 μg의 TNF-α 분말을 1x PBS 1 mL에 현탁시켜 T....

결과

장내 염증을 모델링하기 위해 엔테로이드를 사용하는 것은 괴사 성 장염의 맥락에서도 이제는 일반적입니다. 그러나 현재 사용되는 대부분의 방법은 엔테로이드의 정점 표면에 대한 접근이 부족하여 경구 치료제로 궁극적으로 사용하기위한 화합물의 생리적 관련성을 부정하거나 엔테로이드 유래 단층과 마찬가지로 기술적으로 어렵고 시간이 많이 걸립니다. NEC의 현재 시험관내 엔테로이드 모델의 유용성을 증가시키기 위해, 우리는 엔테로이드의 극성을 역전시키고, 24 시간 저산소증 및 LPS 또는 TNF-α과 결합하여 apical-out NEC-in-a-dish 모델을 생성하였다. 면역형광 염색은 루멘을 향한 핵(청색)의 정점 국소화와 상피의 외부 가장자리에서 빌린³²(적색, 정점 마커)의 검출을 확인하였다(도 1A). 200 μg/mL LPS, 50 ng/mL TNF-α 또는 저산소증 단독에 대한 노출은 대조군에 비해 총 세포 형태학, E.......

토론

장 상피 크립트에서 유래 된 엔테로이드 모델의 최근 개발은 괴사 성 장염 병인을 연구하는보다 생리학적으로 관련된 시험관 내 조직을 허용합니다. 장 상피의 모든 주요 분화된 세포 유형을 포함함에도 불구하고, 3D 엔테로이드는 여전히 몇 가지 중요한 제한의 대상이 된다. 종래의, 기저측성-아웃 엔테로이드는 3D ECM 하이드로겔 돔에 현탁되며, 그 조성 및 밀도는 조직 배양 환경⁽³⁹) 내에서 정상적인 확산을 제한할 수 있다. 중요하게도, 이들 엔테로이드는 세포의 정점 표면에 대한 제한된 접근을 공급하는데, 이는 생체내에서 LPS의 장세포 TLR4 결합과 같은 발광 박테리아 및 항원과 상호작용할 수 있는 표면이다.

NEC의 병태생리학은 불분명하지만, 조산기 장 상피에서 정점 TLR4의 발현 및 활성화의 증가는 두드러진 역할을 하는 것으로 생각된다⁴⁰. TLR4 활성화.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.5 M EDTA, pH 8.0	Fisher Scientific	15575-020
1.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브	Fisher Scientific	05-408-129
15 mL 원추형 튜브	VWR	89039-666
CellTiter-Glo 3D 세포 생존도 분석	Promega	G9681
Corning Costar 초저 부착 24-웰 마이크로플레이트	Fisher Scientific	07-200-602
커버 유리 24 mm x 60 mm	Thermo Scientific	102460
당나귀 안티 마우스 IgG (H+L) 고도의 교차 흡착 2차 항체, Alexa Fluor 488	Thermo Scientific	A-21202
당나귀 안티 토끼 IgG 항체, Cy3 conjugate	Sigma-Aldrich	AP182C
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Ham's Mixture F-12 (DMEM-F12) with 15 mM HEPES buffer	STEMCELL Technologies	36254
E-cadherin 항체 (7H12)	Novus Biologicals	NBP2-19051
포름알데히드 용액 4%, 완충형, pH 6.9	Millipore Sigma	1004960700
Glycerol	Sigma-Aldrich	56-81-5
ImageJ	피지	N/A
IntestiCult 오가노이드 성장 배지 (인간)	STEMCELL Technologies	06010
Leica SP8 컨포칼 현미경	Leica Biosystems
대장균 O111:B4의 지질다당류, 겔 여과 크로마토그래피로 정제	Millipore Sigma	L3012-10MG
현미경 슬라이드	Fisher Scientific	12-544-7
Normal Donkey Serum	Sigma-Aldrich	566460
Nunc MicroWell 96-well, Nunclon 델타 처리, 평면 바닥 마이크로플레이트	Thermo Scientific	136101
PBS(인산염 완충 식염수), 1x [-] 칼슘, 마그네슘, pH 7.4	Corning	21-040-CM
Fisher Scientific	P36983	을 사용한 유리 퇴색 방지 장착제
재조합 항-빌린 항체 [SP145]	Abcam	ab130751
재조합 인간 TNF-&알파; 단백질 100 &마이크로; g	Bio-Techne	210-TA-100/CF
SpectraMax iD3 다중 모드 마이크로플레이트 리더	분자 장치
Thermo Forma Series II Water-Jacketed Tri-Gas Incubator, 184L	Fisher Scientific	3140
TO-PRO-3 요오드화물(642/661)	Thermo Scientific	T3605
Triton X-100	Sigma-Aldrich	9002-93-1
튜브, 0.5 mL, 플랫 캡	Thermo Scientific	AB0350
Tween-20	Sigma-Aldrich	9005-64-5

NucBlue 연장