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시험관 내에서 파골세포 재흡수를 시각화하고 정량화하는 간단한 구덩이 분석 프로토콜

DOI:

10.3791/64016

⸱

June 16th, 2022

 ,  ,  ,  , 
1Department of Oral and Maxillofacial Surgery, University Hospital Tübingen, 2Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery, University Hospital Tübingen, 3Department of Orthopaedic Surgery, University Hospital Tübingen

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Erratum

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Formal Correction: Erratum: A Simple Pit Assay Protocol to Visualize and Quantify Osteoclastic Resorption In Vitro
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Summary

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여기에서, 우리는 인산칼슘 코팅 세포 배양 플레이트를 이용한 재흡수 구덩이 분석을 위한 간단하고 효과적인 분석 절차를 제시한다.

Abstract

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성숙한 파골세포는 산과 효소의 분비를 통해 뼈를 분해할 수 있는 다핵 세포입니다. 그들은 다양한 질병 (예 : 골다공증 및 골암)에서 중요한 역할을하므로 연구의 중요한 대상입니다. 시험관 내에서, 그들의 활성은 재흡수 구덩이의 형성에 의해 분석 될 수있다. 이 프로토콜에서는 인산칼슘(CaP) 코팅된 세포 배양 플레이트를 사용하는 간단한 피트 분석 방법을 설명하며, 이는 쉽게 시각화되고 정량화될 수 있습니다. 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMCs)로부터 유래된 파골세포 전구체를 파골세포형성 자극의 존재 하에 코팅된 플레이트 상에서 배양하였다. 인큐베이션 9일 후, 파골세포를 고정시키고 형광 이미징을 위해 염색하는 한편, CaP 코팅은 칼세인에 의해 역염색되었다. 재흡수된 영역을 정량화하기 위해, 플레이트 상의 CaP 코팅을 5% AgNO3로 염색하고 브라이트필드 이미징에 의해 시각화하였다. 재흡수 구덩이 면적을 ImageJ를 사용하여 정량화하였다.

Introduction

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파골세포 (OCs)는 조혈 줄기 세포 (HSCs)로부터 유래 된 조직 특이적 대식세포이며, 조골 세포1과 함께 뼈 리모델링에 중추적 인 역할을합니다. 전신 또는 국부적으로 뼈를 파괴하는 성 호르몬 유도, 면역학적 및 악성 골 장애는 폐경기 관련 골다공증2, 류마티스 관절염3, 치주 질환4, 골수종 골 질환5, 및 골용해성 골 전이6를 포함하는 과도한 골형성 활성에 기인한다. 대조적으로, OC 형성 및 기능의 결함은 또한 골페트로시스7를 야기할 수 있다. HSCs는 대식세포 콜로니-자극 인자 (M-CSF, 유전자 기호 ACP5) 자극 하에 OC 선조로 분화를 겪는다. NF-κB 리간드 (RANKL, 유전자 기호 TNFSF11)의 M-CSF 및 수용체 활성화제 둘 다의 존재하에, OC 선조는 단핵 OCs로 더 분화되고 이어서 융합되어 다핵 OCs 8,9,10

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Protocol

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이 프로토콜은 지역 윤리위원회 (승인 번호 287/2020B02)에 의해 검토되고 승인되었습니다.

1. 인산칼슘이 코팅된 세포배양접시의 제조

  1. 칼슘 원액의 제조 (트리스 완충액 중 25 mM CaCl2·2H2O, 1.37 mM NaCl, 15 mMMgCl2·6H2O)
    1. 1.0 M 트리스 완충액을 준비하고 1 M HCl을 사용하여 pH를 7.4로 조정한다.
    2. 마그네틱 교반기에 유리 비커를 설치하고 1.0M Tris 버퍼 100mL를 첨가합니다.
    3. 0.368 g의 CaCl2·2H2O, 8.0 g의 NaCl, 및 0.305 g의MgCl2·6H2O를 칭량하고 트리스 완충액에 하나씩 용해시킨다.
    4. 1 M HCl을 사용하여 pH를 7.4로 조정하고 실온에서 보관하십시오.
  2. 인산염 원액의 제조 (11.1 mMNa2HPO4· H2O, 42 mM NaHCO3 트리스 완충액)

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Results

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세포 배양 플레이트의 바닥에 인산칼슘 코팅은 3-일 예비 석회화 및 1-일 석회화 단계를 포함하는 두 가지 코팅 단계로 수행되었다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 균일하게 분포된 인산칼슘은 96-웰 플레이트의 바닥에 얻어졌다. 코팅은 세척 단계를 수행한 후에 바닥에 매우 잘 부착되었다.

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도 1: 96-웰 세포 배양 플레이트 상의 인산칼슘 코팅의 대표적인 밝은 필드 이미지. 코팅은 3-일 예비 석회화 단계 및 1-일 석회화 단계를 포함하는 두 개의 코팅 단계로 수행되었다. 눈금 막대는 200μm를 나타냅니다.

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Discussion

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여기서는 PBMCs로부터 시험관내에서 유도되고 확장된 OCs를 이용한 파골세포 재흡수 분석에 대한 간단하고 신뢰할 수 있는 방법을 설명한다. 사용된 CaP 코팅된 세포 배양 플레이트는 실험실에서 이용 가능한 재료를 사용하여 쉽게 제조되고 시각화될 수 있다. 이 프로토콜에 채택된 분류되지 않은 PBMCs 이외에도, 뮤린 단핵구 세포(21 ) 및 골수 대식세포 세포(17 )로부터 생성된 OCs는 또한 피트 분석을 위해 유사한 합성 기질 상에서 배양되었으며, 따라서 이들 세포 공급원은 상응하는 문헌을 참조하는 이러한 접근법으로 이동될 수 있다.

이 프로토콜을 위해, 우리는 값 비싼 상업적으로 이용 가능한 분석 플레이트 대신 간단한 실험실 내 제작 된 CaP 코팅을 사용했습니다. 뼈와 상아질 조각은 재흡수 구덩이 분석을위한 두 가지 일반적이고 저렴한 재 흡수 가능한 물질이지만 가용성과 .......

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Disclosures

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저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgements

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이 작품은 부분적으로 중국 장학금위원회 (CSC No. 201808440394)가 자금을 지원했습니다. W.C.는 CSC에 의해 자금을 조달했다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AgNO3SERVA 전기영동 GmbH35110질산은
a-MEMGibco32561-029MEM 알파, GlutaMAX, 뉴클레오시드 없음
암포테리신 B Biochrom03-028-1B암포테리신 B 용액
CaCl2Sigma-Aldrich21097-50G염화칼슘 이수화물
CalceinSigma-AldrichC0875Calcein
FBSSigma-AldrichF7524소 태아 혈청
FicollCytiva17144002Ficoll Paque Plus
고정 완충액Biolegend420801Paraformaldehyde
HClMerk1.09057.1000염산
Hoechst 33342PromokinePK-CA707-40046Hoechst 33342
M-CSFPeproTech300-25재조합 인간 M-CSF
MgCl2Sigma-Aldrich7791-18-6염화마그네슘
Na2HPO4AppliChem GmbHA2943,0250di- 인산수소나트륨 무수
NaClMerkS7653-250G소금
NaHCO3MerkK15322429소다의 중탄산
PBSLonza17-512FDulbecco의 인산염 완충 식염수(1X), 칼슘 및 마그네슘 없는 DBPS
펜-연쇄상구균LonzaDE17-602E페니실린-스트렙토마이신 혼합물
팔로이딘-알렉사 플루어 546인비트로겐A22283알렉사 플루어 546 팔로이딘
RANKLPeproTech310-01재조합 인간 sRANK 리간드 (E.coli 유래)
TrisSigma-Aldrich93362Tris (hydroxymethyl) aminomethan
Triton X-100Sigma-AldrichT8787Alkyl Phenyl Polyethylene Glycol
TrypLE ExpressGibco12605010재조합 세포 해리 효소
염

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jacome-Galarza, C. E., et al. Developmental origin, functional maintenance and genetic rescue of osteoclasts. Nature. 568 (7753), 541-545 (2019).
  2. Moller, A. M. J., et al. Aging and menopause reprogram osteoclast precursors for aggressive bone....

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Pit AssayOsteoclastic ResorptionCalcium Phosphate CoatingOsteoclast DifferentiationPBMC IsolationResorption Pit QuantificationVon Kossa StainingFluorescence ImagingM CSF RANKLImageJ Analysis

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