단일 분자 연구를 위한 이중 광학 핀셋 및 미세 유체 공학 사용

요약

미세 유체 챔버를 통해 연구 된 시각적 단일 분자 생화학은 유리 배럴, 기밀 주사기, 튜브와 플로우 셀의 안정적인 연결 및 주사기와 튜브 사이에 스위칭 밸브를 배치하여 기포 제거를 사용하여 크게 촉진됩니다. 이 프로토콜은 DNA 거래 및 분자간 상호 작용의 시각화를 가능하게 하는 이중 광학 트랩을 설명합니다.

초록

시각 생화학은 벌크 단계 연구에서 발생하는 평균화에서 가려진 단일 효소 또는 효소 복합체의 확률적 특성을 관찰하기 위한 강력한 기술입니다. 시각화를 달성하기 위해 하나의 트랩이 고정되고 다른 트랩이 이동되는 이중 광학 핀셋이 도립 형광 현미경 스테이지에 위치한 다중 스트림 미세 유체 챔버의 한 채널에 초점을 맞춥니다. 광학 핀셋은 형광 표지 DNA의 단일 분자를 포획하고 유체가 챔버를 통과하여 갇힌 비드를 지나 DNA를 B-형태(최소 힘, 즉 0pN)로 늘리고 핵산이 검은색 배경에 흰색 끈으로 관찰됩니다. DNA 분자는 제어 된 방식으로 반응을 시작할 수 있도록 흐름에 수직 인 단계를 번역함으로써 한 흐름에서 다음 흐름으로 이동합니다. 성공을 달성하기 위해 광학적으로 투명한 채널이 있는 미세유체 장치는 주사기 펌프에 고정된 유리 주사기에 결합됩니다. 최적의 결과는 플로우 셀에 영구적으로 접착된 커넥터, 기계적으로 단단하고 내화학성이 있는 튜브, 층류를 방해하는 기포를 제거하는 스위칭 밸브에 연결된 튜브를 사용합니다.

서론

단일 분자 수준에서 실시간으로 단백질-DNA 상호 작용을 시각화하는 능력은 게^{놈 안정성에} 대한 중요한 통찰력을 제공했습니다^1,2. 한 번에 하나씩 단일 분자의 DNA로 작업하는 것 외에도 근처의 개별 분자 간의 거래를 볼 수있는 기능은 추가적인 통찰력을 제공합니다 ^3,4,5. 추가 DNA 분자를 조작하려면 추가 광학 트랩과 고품질의 다중 채널 미세 유체 유동 세포⁶가 모두 필요합니다.

둘 이상의 옵티컬 트랩을 생성하는 데 사용할 수 있는 몇 가지 방법이 있습니다. 여기에는 검류계 스캐닝 미러, 음향 광학 변조기 및 회절 광학이 포함되며, 이는 홀로그램 광학 핀셋 4,7,8,9를 생성합니다. 종종 스캐닝 미....

프로토콜

1. 폴리스티렌 비드를 사용한 레이저 트랩 정렬 및 테스트

참고: 설정에 대해서는 그림 1A,B를 참조하십시오.

주의 : 실험자는 레이저 빔을 정렬하는 동안 적절한 보호 안경이나 레이저 보안경을 착용해야합니다. 본 명세서에 기술된 광학 핀셋 시스템은 HeNe 및 IR 빔을 모두 사용하므로, 두 개의 개별 레이저 안전 글라스웨어 세트가 필요하다.

1. HeNe 빔 정렬
   1. 모든 광학 구성 요소를 브레드 보드에 놓습니다. 브레드 보드를 현미경에 대해 가능한 한 90° 각도에 가깝게 정렬합니다.
   2. 대물 렌즈와 텔란 렌즈가 포함된 결합 튜브를 현미경에 부착합니다(그림 1A-11,12).
      알림: 텔란 렌즈는 접안 렌즈의 중간 이미지 평면에 이미지의 초점을 맞추는 데 사용되는 렌즈 시스템입니다.
   3. HeNe 레이저를 켜고 셔터를 엽니다(그림 1A-18). 빔은 빛의 ....

결과

트랩 정렬 및 강도의 초기 테스트는 1μm의 비형광 폴리스티렌 비드로 수행됩니다. 실험실에서 수행된 대부분의 연구는 형광을 사용하기 때문에 1μm, 드래곤 그린 폴리스티렌 비드(그림 1D, E)를 사용하여 트랩 강도를 추가로 테스트합니다. 그 후 작업은 DNA가 비스-삽입성 염료 YOYO-1^14,29로 염색되는 DNA-비드 복합체의 광학 트래핑으로 변경됩니다. 이러한 복합체가 미세유체 유동 셀에서 커버슬립 표면 위 10-15μm에 포획되면 비드를 지나는 유체 흐름이 DNA를 뻗어 나옵니다(그림 3B,C). 유체로 늘어난 DNA의 길이를 측정하여 예상 길이인 B형 길이까지 늘어나는지 확인하는 것이 중요합니다. 예를 들어, 박테리오파지 람다 DNA의 경우, 전장은.......

토론

흐름 시스템의 신중한 조립은 실험 ^4,6의 성공적인 결과에 매우 중요합니다. 프로토콜의 가장 어려운 측면 중 하나는 커넥터를 유리 표면에 부착하는 것입니다. 이를 위해 우리는 압입 피팅 튜브 커넥터와 나노 포트 어셈블리의 두 가지 접근 방식을 사용합니다. 압입 커넥터는 유리에 쉽게 부착된 후 집게를 사용하여 PTFE 튜브를 미리 형성된 구멍으로 밀어 넣습니다. 보다 안정한 부착이 필요한 경우, 나노포트 조립체의 접합이 바람직하다. 조심스럽게 사용하고 청소하면 영구 어셈블리가있는 단일 유리 플로우 셀을 1 년 이상 사용할 수 있습니다. 플로우 셀을 더 자주 교체해야 하는 경우 PDMS 플로우 셀을 우수하고 저렴한 대안으로 사용할 수 있습니다. 재사용이 가능하지만 PDMS는 팽창하기 쉽기 때문에 시간이 지남에 따라 유체 흐름 거동이 바뀔 수 있습니다.

유리 및 PDMS 플로우 셀.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
100x 대물렌즈	라이카	506318 또는 506038	오일 이멀젼 렌즈; 이미징 및 광학 트래핑만 해당됩니다. 형광 이미징에 최적화된 Plan APO 대물렌즈
10X 대물	렌즈 Leica	506263	정렬 중 레이저 빔 스폿을 찾는 데 사용; 플로우 셀에서 초점 및 X-Y 위치를 찾는 데 사용
1mm 형광 비드	Bangs Labs	FSDG004	탭 성능, 초점 위치 결정에 사용
1mm 폴리스티렌 비드	Bangs	Labs CPO1004	트랩 성능 평가 및 biotinylated 분자에 대한 결합에 사용되는
63x 대물	렌즈 Leica	506081	정렬 중 레이저 빔 스폿을 찾고 플로우 셀에서 초점 및 X-y 위치를 찾는 데 사용됩니다. 100X와 동일한 후면 조리개 직경을 가지므로 광학 트래핑에 사용할 수 있습니다. 오일 이멀젼 렌즈
정렬 레이저	Lumentum	1100 시리즈	광학 빔
정렬 카메라	Amscope	MU303	빔 위치 이미징을위한 간단하고 저렴하며 소프트웨어 제어
및 이미지 캡처 소프트웨어	Hamamatsu	HCImage	빠른 파장 전환을 용이하게하기 위해 카메라와 Lambda DG4의 활동을 조정합니다
Orca flash 4	Hamamatsu	c13440-20cu	CCD 카메라 단분자 실험 이미징
C-마운트 빔 정렬 카메라	용 스폿 이미징 솔루션	DE50CMT	정렬 중 레이저 빔 이미징을위한 최적의 카메라 위치 제공
Orca Flash 4 카메라			용 C-마운트IR 차단 필터를 제자리에 고정할 수 있는 리테이너 링이 있습니다. 이를 통해 광학 트랩에서 반사된 IR 빔을 제거하고 갇힌 물체를 보다 선명하게 이미징할 수 있습니다.
Cy5  형광 필터 큐브	Semrock	cy5-404a-lsc-zero	Lambda DG4와 함께 Cy5 이미지화에만 사용됨
Fitc-Txred  형광 필터 큐브	Semrock	fitc/txred-2x-b-000	Lambda DG4와 함께 사용하여 FITC 및 TXRed
Fluidics 튜빙	Grace Bio	46004	PEEK의 대안으로 PTFE 튜브; 일부 플로우 셀(flow cells)에서 잘 작동합니다. Grace Bio fit 튜빙 커넥터를 사용하는 경우 PDMS 플로우 셀 또는 유리 플로우 셀과 함께 사용할 수 있습니다
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이미지 분석 소프트웨어	Media cybernetics	Image Pro Premiere	이미지 분석 및 단일 분자 추적
이미지 분석 소프트웨어	Fiji/NIH Image/Image J	Shareware	이미지 분석 및 단일 분자 추적
이미지 디스플레이 카드	Melles Griot	06 DLA 001	Thorlabs의 대체 제품: VRC5
침수 오일	Zeiss	444960	Immersol 518 F 형광 무료
레이저 빔 정렬 도구	Thor labs	FMP05/M;dgo5-1500-h1; BHM1	빔이 수평이고 올바른 높이에 있는지 확인하는 데 사용됩니다.
레이저 빔 뷰어	캐나다 Photonics 연구소	IR 3150	거울 및 대상에 IR 빔 스팟을 이미지화하는 데 사용됩니다.
레이저 파워 미터	Thor labs		레이저 출력 및 트랩 강도 측정
레이저 안전 안경 (HeNe)	Thor labs	LG7 또는 8	블록 파장의 빛의 >3 OD 단위 >600 nm
레이저 안전 안경 (IR)	Thor labs	LG11	파장 ³의 >7 OD 단위의 빛을 차단합니다. 1000 nm
Mcherry  형광 필터 큐브	Semrock	mcherry-a-lsc-zero	Lambda DG4와 함께 사용하여 mcherry 이미지만 사용
현미경	Leica	DMIRE2	DIC 포트를 제거하여 Dichroic 트래핑/정렬 미러를 수용
현미경 제어 소프트웨어	UCSF/셰어웨어	uManager	현미경 제어, 대물렌즈의 초점 정렬 및 스테이지 제어
나노포트 어셈블리	IDEX	N333	플로우 셀에 결합된 커넥터
광학 테이블 지원	Thor Labs	PA52502	능동 격리 테이블 지원
광학 및 렌즈	Solar TII	다양한	간섭 미러, 망원경 및 렌즈 시스템용으로 맞춤 설계된
PDMS 플로우 셀	ufluidix		사용자 사양에 따라 제작된 맞춤형 플로우 셀; 이미징 채널이 명확함(그림 2B 및 D)
PEEK 튜빙	IDEX	1532	플로우 셀 및 스위칭 밸브에 대한 탁월한 연결 제공
Pinkel 형광 필터 큐브	Semrock	lf488/543/635-3x-a-000	여러 형광단을 빠르게 이미지화하기 위해 Lambda DG4와 함께 사용
프레스 핏 튜빙 커넥터	GraceBio	46003	유리에 잘 결합하는 접착제가 있는 투명 실리콘 커넥터
, 스캐닝 미러,	GSI Lumonics	VM500	두 번째 광학 트랩을 제어하는 데 사용됩니다. GSI Lumonics는 더 이상 존재하지 않습니다. Cambridge Scientific
Stage	Leica
Stage micrometer	Electron Microscopy Sciences	68042-08	빔 및 시스템 캘리브레이션의 위치 지정을 위한 온스크린 눈금자 제공
스위칭 밸브	IDEX	V-101T	유체 흐름의 방향 제어 및 플로우 셀로의 기포 유입 제거
주사기 및 밸브 매니폴드	기계 공장	없음	맞춤형
주사기 펌프	Harvard Apparatus	PHD 2000	플로우 셀을 통한 유체 흐름 제어
주사기 펌프 소프트웨어	Harvard Apparatus	70-6000	Flow control은 유체 흐름의 원활하고 프로그래밍 가능한 제어를 제공합니다
주사기	81320		Gas-tight, PTFE Luer Lock, glass barrels with 테프론 코팅 플런저
테이블 탑	Thor Labs	T36H	광학 테이블 탑 또는 브레드 보드
트래핑 레이저	Newport/Spectra Physics	J 시리즈; BL106C	Nd:YAG 레이저; 1064 nm; 5W 레이저

카메라 카메라 제어 는 . 용 . 이 발생하지 않음 , , , , 에서 유사한 미러를 구입할 수 있습니다. Hamilton