Summary
De CAM-Delam-test om de gemetastaseerde capaciteit van kankercellen te evalueren is relatief snel, eenvoudig en goedkoop. De methode kan worden gebruikt voor het ontrafelen van de moleculaire mechanismen die de vorming van metastase reguleren en voor het screenen van geneesmiddelen. Een geoptimaliseerde test voor het analyseren van menselijke tumormonsters zou een klinische methode kunnen zijn voor gepersonaliseerde kankerbehandeling.
Abstract
De belangrijkste oorzaak van kankergerelateerde sterfgevallen is metastasevorming (d.w.z. wanneer kankercellen zich verspreiden van de primaire tumor naar verre organen en secundaire tumoren vormen). Delaminatie, gedefinieerd als de afbraak van de basale lamina en het keldermembraan, is het initiële proces dat de transmigratie en verspreiding van kankercellen naar andere weefsels en organen vergemakkelijkt. Het scoren van de delaminatiecapaciteit van kankercellen zou het gemetastaseerde potentieel van deze cellen aangeven.
We hebben een gestandaardiseerde methode ontwikkeld, de ex ovo CAM-Delam-test, om het vermogen van kankercellen om te delamineren en binnen te dringen te visualiseren en te kwantificeren, waardoor we metastatische agressiviteit kunnen beoordelen. Kortom, de CAM-Delam-methode omvat het zaaien van kankercellen in siliconenringen op het kuiken chorioallantoic membraan (CAM) op embryonale dag 10, gevolgd door incubatie van uren tot een paar dagen. De CAM-Delam-test omvat het gebruik van een interne bevochtigde kamer tijdens de incubatie van het kuikenembryo. Deze nieuwe benadering verhoogde de embryooverleving van 10% -50% naar 80% -90%, wat eerdere technische problemen met lage embryooverlevingspercentages in verschillende CAM-testen oploste.
Vervolgens werden de CAM-monsters met bijbehorende kankercelclusters geïsoleerd, gefixeerd en bevroren. Ten slotte werden cryostaat-gesegmenteerde monsters gevisualiseerd en geanalyseerd op keldermembraanbeschadiging en invasie van kankercellen met behulp van immunohistochemie. Door verschillende bekende gemetastaseerde en niet-gemetastaseerde kankercellijnen te evalueren die zijn ontworpen om groen fluorescerend eiwit (GFP) tot expressie te brengen, toonden de kwantitatieve resultaten van CAM-Delam aan dat de delaminatiecapaciteitspatronen metastatische agressiviteit weerspiegelen en in vier categorieën kunnen worden gescoord. Toekomstig gebruik van deze test, afgezien van het kwantificeren van delaminatiecapaciteit als een indicatie van gemetastaseerde agressiviteit, is het ontrafelen van de moleculaire mechanismen die delaminatie, invasie, de vorming van micrometastasen en veranderingen in de tumormicro-omgeving regelen.
Introduction
Ongeveer 90% van de sterfte bij kankerpatiënten wordt veroorzaakt door de gevolgen van kankermetastase, dat is de vorming van secundaire tumoren in andere delen van het lichaam waaruit de kanker oorspronkelijk is ontstaan1. Het is daarom van belang om metastatisch gerelateerde mechanismen te identificeren om potentiële doelwitten te vinden om de vorming van tumormetastasen te onderdrukken. Vervolgens is er behoefte aan modelsystemen waarin het metastatische proces kan worden geëvalueerd.
Tijdens metastase ondergaan kankercellen epitheliale naar mesenchymale overgang (EMT), een normaal cellulair proces waarbij epitheelcellen hun hechting en polariteitseigenschappen verliezen en in plaats daarvan een invasief mesenchymaal karakter krijgen2. Delaminatie maakt deel uit van het EMT-proces en omvat de afbraak van laminine in het keldermembraan, wat een voorwaarde is voor kankercellen om de primaire tumor te verlaten en andere weefsels binnen te dringen. De belangrijkste factoren die tijdens de vorming van metastase worden geupreguleerd, zijn matrix metalloproteinases (MMP's), ADAM (een disintergin en metalloproteinase), ADAMTS (ADAM met trombospondinemotieven) en membraantype MMP's (MT-MMP's)3,4. Deze factoren degraderen moleculen zoals laminine, dat tot expressie komt in alle keldermembranen, om celmigratie en invasie te vergemakkelijken.
Het chorioallantoïsche membraan (CAM) van een bevruchte eicel is een soort keldermembraan. Bevruchte kuikeneieren zijn gebruikt als metastatische modellen, waarbij kankercellen zijn gezaaid op de extra-embryonale CAM en later metastasevorming waargenomen in de kuikenembryo's5. Bovendien worden vaak in vivo muis gemetastaseerde modellen gebruikt, waarbij kankercellen in de muizen worden geïmplanteerd en metastasen in verschillende organen worden geanalyseerd6. Deze aanpak is tijdrovend, duur en kan ongemak veroorzaken voor de dieren. Om dit aan te pakken, hebben we de CAM-Delam-test ontwikkeld, een sneller en goedkoper model om de gemetastaseerde agressiviteit van kankercellen te evalueren. In dit model wordt het vermogen van kankercellen om de kuiken CAM af te breken (bijvoorbeeld de delaminatiecapaciteit) gecombineerd met potentiële invasie van kankercellen in het mesenchym en gebruikt als een meting van gemetastaseerde agressiviteit.
Het huidige artikel, gebaseerd op een eerdere publicatie7, beschrijft de CAM-Delam-test in detail, van bevruchte kuikeneierenbehandeling, kankercelkweek en zaaien, dissectie en analyses van CAM-monsters, tot het scoren van de delaminatiecapaciteit van kankercellen in vier categorieën: intact, veranderd, beschadigd en invasie. We geven ook voorbeelden van hoe deze test kan worden gebruikt om de moleculaire mechanismen te bepalen die het delaminatieproces reguleren.
Protocol
In het kort vat figuur 1 de algemene stappen in de CAM-Delam-test samen. Het onderstaande protocol is gebaseerd op 30 gekweekte bevruchte kippeneieren en het gebruik van twee verschillende kankercellijnen afzonderlijk gezaaid in drie ringen / ei en geanalyseerd op vier tijdstippen.
1. Ei-incubatie
- Gebruik bevruchte kuikeneieren van een lokale broederij, die meer dan 90% bemesting garanderen
OPMERKING: De eieren mogen niet langer dan 4 dagen bij kamertemperatuur (RT) zijn bewaard. In Zweden is ethische toestemming voor het experimentele gebruik van embryonale kippen alleen vereist vanaf embryonale dag (E) 14 en daarna. - Veeg indien nodig voorzichtig mechanisch vuil of veren op de eieren af met een droge papieren handdoek of nat in water.
- Reinig en steriliseer de ei-incubator met 70% ethanol voor gebruik (elke keer).
- Leg het gewenste aantal eieren in eierschalen en broed de kuikeneieren horizontaal uit in een eierinctuator bij 37,5-38 °C met een luchtvochtigheid van 70%. Beschouw dit als incubatiedag 0 (figuur 1A).
2. Voorbereiding van weegboot, plastic dozen en dissectie-instrumenten
- Gebruik 70% ethanol om 30 weegboten en 30 kleine plastic dozen (~ 0,4 l) met transparante doppen te steriliseren.
- Droog de weegboten en dozen een nacht in een laminaire kap (ON) en bewaar ze in een gesloten plastic doos tot verder gebruik op incubatiedag 3.
- Steriliseer 2 L gedestilleerde of gedeïoniseerde H2O per 30 bebroede eieren.
- Steriliseer twee schaar en drie paar tangen door 70% ethanol te spuiten. Droog de instrumenten aan de lucht en bewaar ze vervolgens in een gesteriliseerde doos tot incubatiedag 3.
OPMERKING: Deze acties (stappen 2.1-2.4) kunnen elke dag voorafgaand aan incubatiedag 3 worden uitgevoerd. Gebruik handschoenen om besmetting te voorkomen.
3. De eieren openen en overbrengen naar de interne bevochtigde kamer
LET OP: Gebruik handschoenen en een mondkapje om besmetting te voorkomen.
- Voeg ongeveer 50 ml gesteriliseerde H2O toe aan de gesteriliseerde plastic dozen. Bewaar de met water gevulde dozen met gesloten deksels, om verontreiniging te voorkomen, bij RT tot gebruik.
- Scheur op incubatiedag 3 de eierschaal met behulp van het scherpe deel van de schaar en knip een rechte opening in de schaal.
- Breek de eierschaal handmatig open boven een weegboot en verzamel het eiwit, de dooier en het bijgevoegde gezonde embryo in de weegboot (figuur 1B). Zoek naar een intact embryo met een kloppend hart, intacte dooier en ontwikkelde bloedvaten voor het experiment (>95% van de bebroede eieren). Gooi eieren weg met een misvormd embryo, een embryo zonder kloppend hart, een gebroken eigeel of beschadigde dooierbloedvaten.
- Breng de weegboot voorzichtig over in een interne bevochtigde kamer.
OPMERKING: Voor stap 3.2.-3.4., werk zo snel mogelijk om besmetting te voorkomen en gebruik indien mogelijk een laminaire kap. - Incubeer de interne bevochtigde kamer in de eierincuse (figuur 1C).
- Kweek de schaalloze eieren van dag 3 tot dag 10 in de eierincuse voordat ze worden gebruikt (zie stap 3.6.) en voeg indien nodig water toe aan de incubator om 70% luchtvochtigheid te behouden.
- Controleer de interne bevochtigde kamers door het transparante plastic deksel elke dag op dode embryo's of besmette schelploze eieren en verwijder ze uit de couveuse.
4. Bereiding van siliconenringen
- Om siliconenringen te bereiden, snijdt u een siliconenbuis met een binnen- en buitendiameter van respectievelijk 4 mm en 5 mm in ~ 1 mm dikte, bij voorkeur met behulp van een papiersnijder (figuur 1D).
- Breng de siliconenringen over in kleine glazen flessen (figuur 1D), dek af met metaalfolie en steriliseer ze met een autoclaaf of iets dergelijks.
OPMERKING: Vermijd herhaalde autoclavering van ongebruikte siliconenringen die mogelijk besmet zijn, omdat een dergelijke behandeling de capaciteit van de siliconenringen om zich aan het membraan te hechten vermindert, met daaropvolgende lekkage van de kankercel / collageen / RPMI-oplossing buiten de ringen. - Bewaar de steriele siliconenringen bij RT.
OPMERKING: Deze stap kan elke dag voorafgaand aan incubatiedag 10 worden uitgevoerd.
5. Bereiding van kankercellen
OPMERKING: Oplossingen zoals celkweekmedium, trypsine en 1x PBS worden bewaard bij 4 °C en moeten worden verwarmd tot 37 °C in een waterbad voordat ze aan de cellen worden toegevoegd. Spoel de flessen na verhitting af in 70% ethanol en droog voor gebruik.
- Kweek de kankercellijnen van belang in het relevante kweekmedium in een celkweekincubator bij 37 °C in aanwezigheid van 5% (v/v) CO2.
OPMERKING: Hier werden U251-GFP glioblastoom en PC-3U-GFP prostaatkankercellen gekweekt in volledige RPMI medium-RPMI medium aangevuld met 10% (v / v) foetaal runderserum (FBS) en 1% (v / v) penicilline-streptomycine (PS). - Plan de kweek van kankercellen zo dat ongeveer 50 × 106 kankercellen klaar zijn om te worden geoogst op incubatiedag 10 van de CAM-Delam-test.
- Verander het celkweekmedium om de 2-3 dagen, of wanneer de mediumkleur verandert van roze naar oranje / geel.
- Optioneel: Induceer hypoxie door de kankercellen te behandelen met CoCl2 om de moleculaire mechanistische effecten op delaminatie 1 dag voor het oogsten van de cel te onderzoeken.
LET OP: CoCl2 heeft een matige toxiciteit. Behandel met zorg een zuurkast en volg de instructies van de fabrikant.- Bereid verse 20 mM CoCl2-stamoplossing door 0,0258 g op te lossen in 10 ml gesteriliseerde gedestilleerde H20 in een conische buis van 15 ml omwikkeld met aluminiumfolie ter bescherming tegen licht.
- Meng in een conische buis van 50 ml 250 μL van de 20 mM CoCl 2-stamoplossing in 25 ml RPMI-medium aangevuld met 1% (v/ v) PS (maar zonder FBS) per celkweekschaal met een diameter van 15 cm. Vortex zachtjes.
- Verwijder het volledige RPMI-medium uit de celkweekschalen.
- Was de cellen met gesteriliseerde 1x PBS 2x.
- Voeg 25 ml RPMI-medium toe met 200 μM CoCl2-cel trypsinisatie (zie stap 5.6).
- Bereid op eierincubatiedag 10 1 ml collageen/RPMI-mix (verhouding 1:3), met 250 μL collageen type I (5 mg/ml) en 750 μL celkweek RPMI medium aangevuld met 10% FBS en 1% (v/v) PS. Houd het collageen/RPMI-mengsel op ijs.
- Trypsiniseer de kankercellen om de cellen te isoleren door eerst het celkweekmedium te verwijderen en 2x te wassen met 1x PBS.
- Voeg 3 ml trypsine-oplossing (0,05%) per celkweekschaal met een diameter van 15 cm toe en incubeer gedurende 2-3 minuten in een celkweekincubator totdat de cellen loskomen. Gebruik een omgekeerde microscoop op tafelblad om de losgemaakte cellen te zien. Tik indien nodig voorzichtig op de zijkant van de kolf om de resterende geclusterde of gehechte cellen los te maken.
- Inactiveer trypsine door 5 ml volledig RPMI-medium toe te voegen aan elke celkweekschaal en verzamel de celsuspensie van alle celkweekschotels in een buis van 50 ml.
- Tel de kankercellen volgens de Trypan Blue-uitsluitingsmethode om levende van dode cellen te onderscheiden met behulp van een celteller. Voeg 10 μL van de celsuspensie toe aan 10 μL van 0,4% trypan blauwe vlek. Meng het monster door een paar keer op en neer te pipetteren en laad vervolgens 10 μL van het celmengsel per kamer in de monsterdia in de celteller. Herhaal het cel tellen 3x om het celnummer/ml te verifiëren.
- Bereken en centrifugeer het juiste volume celkweeksuspensie met 50 x 106 levende kankercellen in een buis van 50 ml bij 500 × g gedurende 5 minuten.
- Gooi het supernatant weg en meng de celkorrel met 1 ml collageen/RPMI-mix. Omdat collageen een gelatineus materiaal is, mengt u de cellen heel langzaam en voorzichtig met een pipet van 1 ml om te voorkomen dat cellen verloren gaan bij de vorming van bubbels.
- Houd de voorbereide celsuspensie op ijs en breng deze naar het werkgebied van het ei.
OPMERKING: Vermijd het te lang op ijs houden van de voorbereide kankercellen. De voorbereide kankercellen moeten binnen 15-25 minuten op de CAM worden geplaatst.
6. Zaaien van de kankercellen op de CAM
LET OP: Gebruik handschoenen en een mondkapje om besmetting te voorkomen.
- Haal op incubatiedag 10 de interne bevochtigde kamers met de bebroede schaalloze eieren uit de broedmachine.
OPMERKING: Ongeveer 90% van het initiële aantal van de bebroede eieren kan worden gebruikt; zie figuur 2. - Open de interne bevochtigde kamer en plaats maximaal zes siliconenringen op de CAM met behulp van een gesteriliseerde tang.
OPMERKING: Vermijd het plaatsen van de siliconenringen in de buurt van elkaar of in de buurt van grotere bloedvaten. - Meng de kankercelsuspensie door te pipetteren om een gelijkmatige verdeling van kankercellen te krijgen en voeg 20 μL (1 × 106 cellen) van de voorbereide kankercelsuspensie toe in een siliconenring (figuur 1E). Houd bij het toevoegen van de cellen de pipetpunt boven de CAM om ervoor te zorgen dat het membraan niet wordt beschadigd.
OPMERKING: Volgens eerdere bevindingen7 kunnen verschillende kankercellen in afzonderlijke ringen op dezelfde CAM worden gezaaid. - Sluit de interne bevochtigde kamer en plaats deze in de eierincuse.
7. Isolatie van de CAM met bijbehorende kankercellen
- Na 14 uur, 1,5 dagen, 2,5 dagen en 3,5 dagen incubatie, haal ongeveer zeven interne bevochtigde kamers eruit en open de deksels één voor één.
- Ontleed met een schaar de gekweekte kankercellen die aan de CAM zijn bevestigd (zogenaamde CAM-Delam-monsters) door buiten de siliconenring te snijden (figuur 1F).
- Breng het geïsoleerde CAM-Delam-monster onmiddellijk met een tang over op 4% paraformaldehyde (PFA) in 0,1 M fosfaatbuffer (PB) in een petrischaaltje voor fixatie van het weefsel. Gedurende 1 uur bewaren op ijs of bij 4 °C.
OPMERKING: Bewaar 4% PFA-oplossing bij 4 °C gedurende maximaal 5 dagen. LET OP: PFA is giftig. Gebruik bij het hanteren van PFA-poeder en PFA-oplossingen een zuurkast en draag een gezichtsmasker en handschoenen. Vermijd het inademen van poeder- of oplossingsdampen. Volg de instructies van de fabrikant. - Onthoofd de kippenembryo's en gooi ze weg als biologisch afval in specifieke bakken.
- Verwijder de 4% PFA-oplossing en voeg 30% sucrose in 0,1 M PB toe aan de CAM-Delam-monsters en breng gedurende 1 uur in evenwicht bij 4 °C.
- Verwijder onder een dissectiemicroscoop voorzichtig de siliconenring met een tang. Knip met een schaar het CAM-Delam-monster in een rechthoekige vorm met de kankercellen in het midden (figuur 1G).
- Breng met een tang de CAM-Delam-monsters over naar bevroren sectiemedium in een petrischaal om overtollige sucrose te verwijderen en vervolgens naar inbeddingsvormpjes in bevroren sectiemedium.
- Plaats onder een dissectiemicroscoop het CAM-Delam-monster in een U-vorm in verticale richting in de inbeddingsvorm met behulp van een naaldachtig instrument (figuur 1G).
- Vries de CAM-Delam monsters in en bewaar ze bij −80 °C.
8. Cam-Delam-monsters doorsnijden
- Sectie van de bevroren CAM-Delam-monsters op 10 μm op 5-6 opeenvolgende dia's met behulp van cryosectie.
- Bewaar de dia's met secties bij −80 °C of gebruik ze direct voor immunohistochemische kleuring.
9. Immunohistochemische kleuring
- Breng de dia's van −80 °C gedurende 5 minuten naar RT voordat u met het immunoprotocol begint.
- Maak een lijn met een hydrofobe marker op de dia's waar de secties eindigen. Laat ze een paar minuten drogen.
- Plaats de glaasjes in een bevochtigde (H2O) kamer en bedek de secties met ~200-500 μL blokkerende oplossing (10% foetaal kalfsserum en 0,1% natriumazide in Tris-gebufferde zoutoplossing met 0,1% Triton X-100 [TBST]) en incubeer gedurende 15-30 min.
OPMERKING: Laat vanaf deze stap de dia's op geen enkel moment drogen. - Giet de blokkerende oplossing af en vervang deze door 100-150 μL van het primaire antilichaam van belang verdund in de blokkerende oplossing en incubateer ON bij 4 °C. Gebruik bij voorkeur konijn anti-laminine-111 antilichaam om de basale lamina samen met een kankercelmarker te definiëren, indien niet met behulp van GFP of andere fluorescerende gelabelde kankercellijnen.
OPMERKING: Hier werd ook een konijn anti-von Willebrand Factor gebruikt om bloedvaten in de CAM te detecteren. - Bereid drie glazen cuvetten gevuld met TBST-buffer.
- Giet de primaire antilichaamoplossing af, breng de glaasjes over op de glazen cuvetten en was ten minste 3x gedurende 5 minuten elk in TBST.
- Verwijder overtollige TBST van de dia en van het hydrofobe barrièregebied met een zacht papieren zakdoekje.
- Bedek de dia met 100-150 μL van een geschikt secundair fluorescerend antilichaam verdund in blokkerende oplossing in combinatie met 4',6-diamidino-2-fenylindool, dihydrochloride (DAPI) en incubeer in het donker bij RT gedurende 1 uur.
- Giet de secundaire antilichaamoplossing af, breng de glaasjes over op de glazen cuvetten en was ten minste 3x gedurende 5 minuten elk in TBST.
- Verwijder overtollige TBST van de dia en van het hydrofobe barrièregebied met een zacht papieren zakdoekje.
- Monteer de dia's door 1-2 druppels fluorescerend montagemedium op de dia te plaatsen en plaats voorzichtig een glazen afdekplaat, waarbij luchtbellen worden vermeden.
- Laat de dia's minstens 1 uur drogen bij 4 °C voordat u ze analyseert en bewaar de dia's 4 °C.
10. Microscopie beeldvorming en delaminatie scoren
- Fotografeer de secties met een epifluorescentiemicroscoop uitgerust met een digitale camera, bij voorkeur bij 10x vergroting (figuur 1H).
- Analyseer de secties met behulp van de volgende CAM-Delam-scorecategorieën (figuur 3):
- Zoek naar intacte basale lamina zonder zichtbare veranderingen.
- Zoek naar veranderde maar onbeschadigde basale lamina.
- Zoek naar beschadigde basale lamina zonder celinvasie.
- Zoek naar beschadigde basale lamina met celinvasie.
Representative Results
Figuur 1 toont de belangrijkste stappen in de CAM-Delam assay7. Het gebruik van interne bevochtigde kamers (figuur 1C) verbeterde de overlevingskans van de kuikenembryo's aanzienlijk van <50% tot 90% op incubatiedag 10 en van ~ 15% tot 80% op incubatiedag 13 (figuur 2).
Figuur 1: Belangrijkste stappen van de CAM-Delam-test. (A) Incubeer bevruchte kippeneieren horizontaal zonder rotatie. (B,C) Kraak op dag 3 van de incubatie de eieren en plaats ze in steriele weegboten (B) en plaats de boten in een interne bevochtigde kamer voor verdere incubatie (C). (D) Bereid siliconenringen voor. (E) Plaats op dag 10 van de incubatie de siliconenringen op de CAM en zaad 1 x 106 kankercellen in de ringen met behulp van een pipet. (F,G) Ontleed op verschillende tijdstippen (uren tot dagen) de CAM met aangehechte kankercellen, (F) fixeer in PFA, behandel met sucrose, plaats in bevroren sectiemedium, (G) en vries in -80 °C. (H) Een voorbeeld van een gesegmenteerde CAM met bijbehorende GFP + kankercellen (groen) en laminine immunohistochemische kleuring (rood). Schaalbalken = 2 mm (E,F), 1 mm (G) en 100 μm (H). Dit cijfer komt uit Palaniappan et al.7. Afkortingen: CAM = chorioallantoic membrane; PFA = paraformaldehyde; GFP = groen fluorescerend eiwit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Overleving van kippenembryo's in relatie tot incubatiemethode. (A,B) Op incubatiedag 10 verdubbelde de overleving van kippenembryo's in interne HC's (gemiddelde waarde 89,33; N = 105) vergeleken met incubatie in petrischalen (A; gemiddelde waarde 40; N = 64) en niet-bevochtigde kamers (B; gemiddelde waarde 48,67; N = 46). (C,D) Op incubatiedag 13 werd nog steeds een hoge overlevingskans waargenomen met HC (gemiddelde waarde 81,67; N = 105), terwijl een grote afname van de embryooverleving werd opgemerkt met behulp van PD (C; gemiddelde waarde 11,33; N = 64) en N-HC (D; gemiddelde waarde 18,33; N = 46). Statistische significantie werd getest met behulp van een ongepaarde tweezijdige t-test. De foutbalken geven de standaarddeviatie aan. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Dit cijfer is aangepast van Palaniappan et al.7. Afkortingen: HC = bevochtigde kamer; PD = Petrischaaltjes; N-HC = niet-bevochtigde kamer; E X = Incubatiedag X. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Analyses van verschillende kankercellijnen die GFP tot expressie brengen (U251 glioblastoom, PC-3U prostaat, SW620 colon en A549 long) met behulp van dit protocol werden eerder gemeld door Palaniappan et al.7. De resultaten van de CAM-Delam-test omvatten verschillen in morfologie van de basale lamina, gedetecteerd door laminine, en invasie van kankercellen, gedefinieerd als cellen die de basale laminalaag van het kuiken hebben gekruist in de mesodermale laag van het kuiken (figuur 3). Deze resultaten tonen aan dat het vermogen van kankercellen om basale lamina af te breken en het mesenchym binnen te dringen, kan worden gescoord in een van de vier categorieën: 1) intacte basale lamina zonder zichtbare veranderingen (figuur 3B), 2) veranderde maar onbeschadigde basale lamina (figuur 3C), 3) beschadigde basale lamina zonder celinvasie (figuur 3D) en 4) beschadigde basale lamina met celinvasie (figuur 3E) ). Een andere observatie was dat, wanneer kankercellen een veranderde of beschadigde basale lamina veroorzaakten, de CAM ook werd verdikt met een toename van de vorming van bloedvaten, gedefinieerd door antilichaamkleuring tegen von Willebrand's Factor, die wordt gesynthetiseerd in bloedvaten8 (Figuur 4C-H). Deze twee fenotypen, een verdikte CAM en verhoogde vorming van bloedvaten, werden niet waargenomen wanneer de CAM intact was (figuur 4A,B).
Figuur 3: CAM-Delam scoring. (A-E) Een CAM-Delam scorevoorbeeld gebaseerd op de integriteit van de CAM basale lamina, gevisualiseerd door anti-laminine (rood), en potentiële invasie van GFP-expresserende kankercellen (groen). (A) Controle CAM zonder kankercellen. (B-E) In de reacties op kankercellen kunnen vier categorieën worden gescoord die de morfologie van de basale lamina beschrijven: (B) intact laminine, (C) veranderd maar onbeschadigd laminine (aangegeven door een sterretje), (D) beschadigd laminine maar zonder invasie van kankercellen (pijlen), beschadigd laminine met celinvasie (pijlpunten). Schaalbalk = 100 μm (A-E). Dit cijfer komt uit Palaniappan et al.7. Afkortingen: CAM = chorioallantoic membrane; GFP = groen fluorescerend eiwit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Evaluatie van CAM-verdikking en bloedvatvorming. (A-H) Een voorbeeld van visualisatie van CAM-verdikking en bloedvatvorming, gedetecteerd door anti-Von Willebrand Factor (rood), als reactie op de lamina van verschillende kankerceltypen. (A,B) Controle CAM zonder kankercellen. (C,D) Als reactie op een niet-gemetastaseerde kankercellijn (gescoord als Intact) werd geen duidelijke verdikking van het mesenchym of verhoogde bloedvatvorming gedetecteerd. (E-H) Als reactie op gemetastaseerde kankercellen die resulteerden in veranderd of beschadigd laminine, werd het mesenchym verdikt (aangegeven door dubbele pijlpunten) en werd verhoogde bloedvatvorming waargenomen (aangegeven door pijlen). Schaalbalk = 100 μm. Dit cijfer is aangepast van Palaniappan et al.7. Afkortingen: CAM = chorioallantoic membrane; GFP = groen fluorescerend eiwit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
U251 glioblastoom en PC-3U prostaatkankercellen zijn twee voorbeelden van kankercellijnen met totaal verschillende delaminatiecapaciteiten (figuur 5). PC-3U-cellen veroorzaakten beschadigd laminine na 1,5 dag, met duidelijke invasie na 2,5 dagen (figuur 5A). Daarentegen veroorzaakten U251-cellen slechts kleine veranderingen van laminine na 1,5-3,5 dagen, maar veroorzaakten nooit zichtbare schade aan laminine (figuur 5B).
Figuur 5: Visualisatie van de delaminatiecapaciteit van prostaat (PC-3U) en glioblastoom (U251) kankercellen. (A) PC-3U-cellen veroorzaakten kleine veranderingen van laminine na 14 uur, schade aan laminine na 1,5 dagen (pijl) en de start van invasie na 2,5 dagen, die na 3,5 dagen werd verhoogd (pijlpunten). (B) U251-cellen veroorzaakten een kleine verandering van laminine na 1,5-3,5 dagen. De rechter panelen tonen grafieken die de CAM-Delam score weergeven. De y-as geeft het aantal monsters aan en de x-as geeft de tijdspunten van cultuur aan. Schaalbalk = 100 μm (A,B). Dit cijfer is aangepast van Palaniappan et al.7. Afkortingen: CAM = chorioallantoic membrane; GFP = groen fluorescerend eiwit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
De CAM-Delam assay kan worden gebruikt om moleculaire mechanismen te definiëren die het delaminatieproces reguleren. Een voorbeeld is het gebruik van CoCl2-behandeling om hypoxie te induceren met of zonder de combinatie van remmende matrixmetalloproteinasen (MMP) met behulp van de brede MMP-remmer GM6001 (figuur 6). Na behandeling met CoCl2 kregen niet-gemetastaseerde kankercellen van U251 het vermogen om delaminatie en invasieve cellen te induceren, wat werd onderdrukt wanneer de behandeling met CoCl2 werd gecombineerd met de MMP-remmer GM6001 (figuur 6). De CAM-Delam-test kan dus nuttig zijn bij het definiëren van moleculen en moleculaire routes die het delaminatieproces beïnvloeden.
Figuur 6: Delaminatiepatronen als reactie op U251-cellen die alleen of samen met eenMMP-remmer aan CoCl 2 worden blootgesteld. (A-C) U251-cellen gekweekt gedurende 3,5 dag op de CAM tijdens verschillende omstandigheden. A) U251-cellen die alleen werden gekweekt, veroorzaakten geen schade aan laminine. (B) Gekweekte U251-cellen voorbelicht op CoCl2 (24 uur) voorafgaand aan wassen en celzaaien op de CAM geïnduceerde laminineschade en celinvasie. (C) Voorbehandeling met een breedspectrum MMP-remmer GM6001 (gedurende 1 uur), gevolgd door cocl2-blootstelling (24 uur) vóór het wassen en zaaien van U251-cellen op de CAM, onderdrukte het effect van de CoCl2-behandeling en er werd geen duidelijke laminineschade of invasie van kankercellen gedetecteerd. Schaalbalk = 100 μm (A-C). Panelen (B) en (C) zijn van Palaniappan et al.7. Afkortingen: CAM = chorioallantoic membrane; GFP = groen fluorescerend eiwit; CoCl2 = kobaltchloride; MMP = matrix metalloproteinase. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
Dit artikel beschrijft de CAM-Delam-test om de gemetastaseerde agressiviteit van kankercellen te evalueren, bepaald door basale laminamodulaties en potentiële celinvasie in het mesenchym te scoren binnen een periode van uren tot enkele dagen. Een eerder technisch probleem voor verschillende CAM-testen was de lage overleving van kuikenembryo's. Dit probleem werd opgelost door het gebruik van een interne bevochtigde kamer tijdens embryo-incubatie te introduceren, waardoor de overleving van het embryo van 10% -50% tot 80% -90% 7 werd verhoogd. Het gebruik van een interne bevochtigde kamer kan daarom waardevol zijn in CAM-assays in het algemeen, evenals in andere ex ovo-kuikenexperimenten.
De gepresenteerde scoringstijdpunten bij 14 uur, 1,5 dagen, 2,5 dagen en 3,5 dagen na het zaaien van 1 x 106 kankercellen op de CAM zijn gebaseerd op rigoureuze methodeontwikkeling met behulp van zes verschillende kankercellijnen en zijn voldoende om het bereik van niet-delaminerend tot delaminerend-met-invasiecapaciteiten van kankercellijnen te onderscheiden. Een minimum gebruik van vier eieren met drie ringen in elk tijdspunt en per cellijn wordt voorgesteld, en dit moet ten minste eenmaal worden herhaald of volgens experimentele ontwerpen en statistische vereisten. Een voordeel van de CAM-Delam-test is het verkrijgen van informatieve resultaten met betrekking tot de delaminatiecapaciteit van kankercellen binnen enkele dagen om de agressiviteit van kankercellen en het potentiële risico op metastasevorming te schatten. De snelle levering van resultaten wordt vergemakkelijkt door het monitoren van de afbraak van de basale lamina als gevolg van de binnendringende kankercellen en de daaropvolgende microtumoren / tumorknoppen en orgaanmetastasen. Traditioneel worden CAM-modellen gebruikt om de vorming van orgaanmetastasen te analyseren, wat ongeveer 2 weken duurt om te worden bepaald9. Door zeven verschillende kankercellijnen te gebruiken, hebben we eerder7 geverifieerd dat de delaminatiescore is gekoppeld aan het vermogen van kankercellen om metastasen te vormen in knaagdiermodellen 10,11,12,13,14, wat de voorspellende waarde van de CAM-Delam-test ondersteunt. Bovendien hebben muismodellen een nog langere tijd nodig, enkele weken tot maanden, voordat metastasen kunnen worden onderzocht15,16. Kortom, deze ontwikkelde CAM-Delam-test, gericht op het scoren van delaminatiecapaciteit en niet op het onderzoeken van latere tumorvorming in het kuikenembryo, is daarom een goede aanvulling op bestaande cam-invasie- en muistumormodellen.
Een beperking in de CAM-Delam-test kan de onduidelijke visualisatie van de basale lamina zijn als de kankercellen zelf laminine tot expressie brengen. Als dat zo is, kunnen andere markers worden gebruikt die de basale lamina aangeven, zoals E-cadherine, 7. Andere CAM-invasiestudies hebben type IV collageen gebruikt om de CAM en pan-cytokeratine en vimentine te visualiseren om binnendringende kankercellen en de vorming van microtumoren / tumorknoppen te identificeren17,18.
Delaminatie is een normaal cellulair proces, zowel tijdens de ontwikkeling als later in het leven, waardoor cellen een epitheel kunnen verlaten en naar andere weefsels kunnen migreren. Voorbeelden van delaminerende cellen tijdens de ontwikkeling zijn neurale top en olfactorisch baanbrekende neuronen 19,20; op latere leeftijd is wondgenezing afhankelijk van delaminatie21. Tijdens kanker wordt dit proces in de verkeerde cellen en/of op het verkeerde moment geupreguleerd. De CAM-Delam-methode kan dus van nut zijn om de moleculaire mechanismen te ontrafelen die delaminatie reguleren, wat van belang zou zijn voor zowel fundamentele biologische als ziektekennis. Dergelijke delaminatiestudies omvatten het toevoegen van factoren die van belang zijn voor de kankercellen die op de CAM zijn gezaaid of het bestuderen van genetisch gemodificeerde kankercellen. Een voorbeeld dat hier wordt gepresenteerd, is CoCl 2-voorbehandeling van de niet-gemetastaseerde cellijn U251 om hypoxie te induceren, wat leidt tot de inductie van een gemetastaseerd agressief vermogen dat kan worden onderdrukt door een breedspectrum MMP-remmer. Het vinden van belangrijke moleculen die delaminatie regelen, verhoogt dus de mogelijkheid om remmers te ontwerpen om dit proces te onderdrukken. In verband hiermee is een ander potentieel gebruik voor het CAM-Delam-protocol in drugsscreening voor de onderdrukking van delaminatie en celinvasie. Bovendien is in de kliniek de evaluatie van de ernst van kanker een cruciaal onderdeel voor diagnose, planning van behandeling en zorg. Momenteel is het TNM-stadiëringssysteem (T, tumorgrootte; N, knoop-of de kanker is uitgezaaid naar de lymfeklieren; M, metastase op afstand) wordt gebruikt om de ernst van de kanker te evalueren22. De CAM-Delam-test definieert een innovatieve benadering om de agressiviteit van kankercellen en het potentiële risico op de vorming van metastasen te evalueren en kan een nuttige aanvulling zijn op het TNM-stadiëringssysteem. Opmerkelijk is dat TNM-stadiëring is gebaseerd op de analyses van vaste weefselmonsters, terwijl een potentiële klinische CAM-Delam-benadering vers of vers ingevroren weefsel zou onderzoeken in combinatie met technieken om bevroren cellen te doen herleven23.
Disclosures
De auteurs hebben geen tegenstrijdige belangen om bekend te maken.
Acknowledgments
We danken de volgende onderzoekers van de universiteit van Umeå voor hun hulp bij relevante kankercellijnen en antilichamen: L. Carlsson (von Willebrand Factor-antilichaam), J. Gilthorpe (U251) en M. Landström (PC-3U). We bedanken ook Hauke Holthusen in het Gilthorpe lab voor het genereren van de HEK293-TLR-AAVS1 stabiele cellijn. Het werk in het Gunhaga-laboratorium werd ondersteund door de Zweedse Kankerstichting (18 0463), Umeå Biotech Incubator, Norrlands Cancerforskningsfond, de Zweedse Onderzoeksraad (2017-01430) en de medische faculteit van de universiteit van Umeå.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EQUIPMENT | |||
| Centrifuge | Rotanta 480 R, Hettich zentrifugen | ||
| Countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | ||
| Cryostat | HM 505 E, Microm | ||
| Digital camera | Nikon DS-Ri1 | ||
| Dissection Microscope | Leica M10 | For CAM-sample dissection and positioning in molds | |
| Egg incubator | Fiem | Many other sources are available. Must be cleaned and sterilized with 70 % ethanol before each use | |
| Epifluorescence microscope | Nikon Eclipse, E800 | Equiped with a digital camera, for scoring delamination and cell invasion. | |
| Fine forceps | Many sources are available | Must be sterilized before use | |
| Freezer -80 °C | Thermo Fisher Scientific | 8600 Series | Model 817CV |
| Inverted microscope | Nikon Eclipse TS100 | For cell culture work | |
| Scissors (small) | Many sources are available | Must be sterilized before use | |
| MATERIALS | |||
| anti-Laminin-111 | Sigma-Aldrich | L9393 | Primary anti-rabbit antibody (1:400) |
| anti-rabbit Cy3 | Jackson Immuno Research | 111-165-003 | Secondary antibody (1:400) |
| anti-von Willebrand Factor | DAKO | P0226 | Primary antibody (1:100) |
Cobalt(II) chloride |
Sigma-Aldrich | 232696-5G | CAUTION: moderate toxicity chemical. Handle with care only in fume hood. Follow manufacturers instructions |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-10MG | 4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (1:400) |
| Fertilized chicken eggs | Strömbäcks Ägg, Vännäs, Sweden | Any local egg supplyer | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10500-064 | |
| Fluorescence mounting medium | Allent Technologie | S302380-2 | Avoid bubble formation when mounting. Allow to dry at +4 °C |
| Glass chambers for silicon rings | Many sources are available | We used 15 mL glass chambers. Around 20 silicon rings fit in one chamber. Avoid crowding, since the rings may stick together and aggravate work. | |
| Glass coverslips | VWR International | 631-0165 | |
| GM6001 MMP Inhibitor | Sigma-Aldrich | CC1010 | |
| Microscope slides for immunohistochemistry | Fisher Scientific | 10149870 | |
| NEG-50 frozen medium | Cellab | 6506 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 30525-89-4 | CAUTION: highly toxic. Handle with care only in fume hood, follow manufacturers instructions. Use all protective clothing. |
Peel-A-Way Embedding Molds |
Polysciences | 18985 | |
| Penicillin–streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| Petri dishes | Sarstedt | 83.3903 | 15 cm in diameter for cell culture |
| Plastic box | Esclain | ||
| PureCol EZ Gel Collagen | Cellsystems | 5074-35ML | 5 mg/mL. Gelatinous material. Pipette very slowly and carefully to avoid cells being lost in the bubble formations. |
| RPMI medium | Thermo Fisher Scientific | 21875034 | |
| Silicon rings | VWR International | 228-1580 | Inner/outer diameter: 4/5 mm. Should be sterilized before use. Avoid repeated autoclaving of unused rings. |
| Trypan blue | Fisher Scientific | T10282 | |
| Trypsin | Life Technologi | 15400054 | 0.50% |
| Weighing boats | VWR International | 611-0094 | |
| SOLUTIONS | |||
| Collagen-RPMI media mixture (1 mL) | Compelete RPMI Media 750 µL |
||
| PureCol EZ Gel Collagen 250 µL |
|||
| Mix and use immediately | |||
| Complete RPMI media (500 mL) | RPMI Media 445 mL |
||
| FBS 50 mL |
|||
| Penicillin–streptomycin 5mL |
|||
| Store at 4 °C | |||
| PB (0.2 M; 1 000 mL) | Na2HPO4 (MW 141.76) 21.9 g |
||
| NaH2PO4 (MW 137.99) 6.4 g |
|||
| add deionized water up to final volume of 1000ml | |||
| Store in RT | |||
| PFA (4 %) in 0.1 M PB (100 mL) | Deionized water 50 mL |
||
| 0.2 M PB 50 mL |
|||
| Paraformaldehyde (PFA) 4g |
|||
| heat to 60 °C in water bath | |||
| add 5 M NaOH 25 µL |
|||
| Stir to dissolve the PFA powder | |||
| Store at 4 °C | |||
| TBST (1 000 mL) | 50mM Tris pH 7,4 50 mL |
||
| 150mM NaCI 30 mL |
|||
| 0,1% Triton X-100 10 mL |
|||
| H2O (MQ) 900 mL |
|||
| Trypsin (0.05 %; 10 mL) | 1x PBS 9 mL |
||
| 10x Trypsin (0.5 %) 1 mL |
|||
| 10 mL in total, Store at 4 °C |
References
- Vasantharajan, S. S., et al. The epigenetic landscape of circulating tumour cells. Biochimica et Biophysica Acta - Reviews on Cancer. 1875 (2), 188514 (2021).
- Acloque, H., Adams, M. S., Fishwick, K., Bronner-Fraser, M., Nieto, M. A. Epithelial-mesenchymal transitions: the importance of changing cell state in development and disease. Journal of Clinical Investigation. 119 (6), 1438-1449 (2009).
- Itoh, Y. Membrane-type matrix metalloproteinases: their functions and regulations. Matrix Biology. 44-46, 207-223 (2015).
- Przemyslaw, L., Boguslaw, H. A., Elzbieta, S., Malgorzata, S. M. ADAM and ADAMTS family proteins and their role in the colorectal cancer etiopathogenesis. BMB Reports. 46 (3), 139-150 (2013).
- Chu, P. Y., Koh, A. P., Antony, J., Huang, R. Y. Applications of the chick chorioallantoic membrane as an alternative model for cancer studies. Cells Tissues Organs. 211 (2), 222-237 (2021).
- MacDonald, I. C., Groom, A. C., Chambers, A. F. Cancer spread and micrometastasis development: quantitative approaches for in vivo models. Bioessays. 24 (10), 885-893 (2002).
- Palaniappan, T. K., Slekiene, L., Jonasson, A. K., Gilthorpe, J., Gunhaga, L. CAM-Delam: an in vivo approach to visualize and quantify the delamination and invasion capacity of human cancer cells. Scientific Reports. 10 (1), 10472 (2020).
- Carrillo, M., Kim, S., Rajpurohit, S. K., Kulkarni, V., Jagadeeswaran, P.
- Leupold, J. H., Patil, N., Allgayer, H. The chicken egg chorioallantoic membrane (CAM) model as an in vivo method for the investigation of the invasion and metastasis cascade of malignant tumor cells. Methods in Molecular Biology. 2294, 17-26 (2021).
- Jia, Y., et al. Recombinant human endostatin endostar inhibits tumor growth and metastasis in a mouse xenograft model of colon cancer. Pathology and Oncology Research. 18 (2), 315-323 (2012).
- Liu, B., et al. RNAi-mediated inhibition of presenilin 2 inhibits glioma cell growth and invasion and is involved in the regulation of Nrg1/ErbB signaling. Neuro-Oncology. 14 (8), 994-1006 (2012).
- Qin, T., et al. Tumor necrosis factor superfamily 15 promotes lymphatic metastasis via upregulation of vascular endothelial growth factor-C in a mouse model of lung cancer. Cancer Science. 109 (8), 2469-2478 (2018).
- Ren, L., et al. Characterization of the metastatic phenotype of a panel of established osteosarcoma cells. Oncotarget. 6 (30), 29469-29481 (2015).
- Zang, G., Mu, Y., Gao, L., Bergh, A., Landstrom, M. PKCzeta facilitates lymphatic metastatic spread of prostate cancer cells in a mice xenograft model. Oncogene. 38 (22), 4215-4231 (2019).
- Francia, G., Cruz-Munoz, W., Man, S., Xu, P., Kerbel, R. S. Mouse models of advanced spontaneous metastasis for experimental therapeutics. Nature Reviews Cancer. 11 (2), 135-141 (2011).
- Jung, J. Human tumor xenograft models for preclinical assessment of anticancer drug development. Toxicology Research. 30 (1), 1-5 (2014).
- Liu, M., et al. The histone methyltransferase EZH2 mediates tumor progression on the chick chorioallantoic membrane assay, a novel model of head and neck squamous cell carcinoma. Translational Oncology. 6 (3), 273-281 (2013).
- Steinmann, S., et al. DAPK1 loss triggers tumor invasion in colorectal tumor cells. Cell Death & Disease. 10 (12), 895 (2019).
- Andrieu, C., et al. MMP14 is required for delamination of chick neural crest cells independently of its catalytic activity. Development. 147 (7), (2020).
- Palaniappan, T. K., Slekiene, L., Gunhaga, L., Patthey, C. Extensive apoptosis during the formation of the terminal nerve ganglion by olfactory placode-derived cells with distinct molecular markers. Differentiation. 110, 8-16 (2019).
- Thiery, J. P., Acloque, H., Huang, R. Y., Nieto, M. A. Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease. Cell. 139 (5), 871-890 (2009).
- Pineros, M., et al. Essential TNM: a registry tool to reduce gaps in cancer staging information. The Lancet Oncology. 20 (2), 103-111 (2019).
- Walsh, A. J., Cook, R. S., Sanders, M. E., Arteaga, C. L., Skala, M. C. Drug response in organoids generated from frozen primary tumor tissues. Scientific Reports. 6, 18889 (2016).
