이온화 조사에 대한 반응으로 장 상피 재생

요약

위장관은 방사선 치료 암 치료 시 손상에 가장 민감한 기관 중 하나입니다. 그것은 동시에 그러한 모욕에 이어 가장 높은 재생 능력 중 하나를 가진 장기 시스템입니다. 제시된 프로토콜은 장 상피의 재생 능력을 연구하는 효율적인 방법을 설명합니다.

초록

장 상피는 단일 층의 세포로 구성되어 있지만 장 선와(intestinal crypt)의 바닥에 위치한 장 줄기 세포의 활성 증식에 의해 생성되는 여러 유형의 말기 분화 세포를 포함합니다. 그러나 급성 장 손상이 발생하는 동안 이러한 활성 장 줄기 세포는 세포 사멸을 겪습니다. 감마선 조사는 널리 사용되는 대장암 치료제로, 치료적으로는 효과적이지만 활성 줄기 세포 풀을 고갈시키는 부작용이 있습니다. 실제로 환자들은 방사선 치료를 받는 동안 부분적으로 활성 줄기 세포 고갈로 인해 위장 방사선 증후군을 자주 경험합니다. 장 선와에서 활성 장 줄기 세포의 손실은 일반적으로 정지 상태의 예비 장 줄기 세포 풀을 활성화하고 분비 및 장 세포 전구체 세포의 탈분화를 유도합니다. 이러한 세포가 아니라면 장 상피는 방사선 요법 및 기타 주요 조직 손상으로부터 회복하는 능력이 부족할 것입니다. 계통 추적 기술의 새로운 발전은 재생 중 세포의 활성화, 분화 및 이동을 추적할 수 있게 해주며, 장에서 이를 연구하는 데 성공적으로 사용되었습니다. 본 연구는 방사선 손상 후 마우스 장 상피 내 세포를 분석하는 방법을 제시하는 것을 목적으로 한다.

서론

인간의 장 상피는 완전히 평평하게 놓으면 배드민턴 코트의 절반 표면을 덮을 것입니다¹. 대신, 인간의 내장 내용물을 분리하는 이 단일 세포층은 일련의 손가락 모양의 돌기, 융모 및 움푹 들어간 곳, 장의 표면적을 최대화하는 선와로 압축됩니다. 상피의 세포는 crypt-villus 축을 따라 분화합니다. 융모는 주로 영양소를 흡수하는 장세포, 점액을 분비하는 잔 세포, 호르몬을 생성하는 장내분비 세포로 구성되며, 선와(crypt)는 주로 디펜신 생성 파네스 세포, 활성 및 예비 줄기 세포, 전구 세포 2,3,4,5로 구성됩니다. 또한, 이들 세포가 밑에 있는 중간엽 구획의 기질 및 면역 세포 및 내강의 미생물군과 갖는 양방향 통신은 장 항상성을 유지하고 손상 후 회복에 중요한 복잡한 상호 작용 네트워크를 생성합니다 ^6,7,8.

프로토콜

모든 마우스는 스토니 브룩 대학 (Stony Brook University)의 실험실 동물 자원 부서 (DLAR)에 수용되었습니다. Stony Brook University IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)는 동물 피험자와 관련된 모든 연구와 절차를 승인했습니다. 동물 피험자를 대상으로 한 실험은 승인된 동물 취급 프로토콜(IACUC #245094)에 따라 엄격하게 수행되었습니다.

참고: 마우스 균주 B6;129-Bmi1 tm1(cre/ERT)Mrc/J(Bmi1-Cre ER) 및 B6.129X1-Gt(ROSA)26Sor^tm1(EYFP)Cos/J(Rosa26^eYFP)를 상업적으로 얻고(재료 표 참조^{) Bmi1-Cre ER}을 얻기 위해 교차했습니다. Rosa26^eYFP (^Bmi1ctrl) 마우스는 앞서 기술한 바와 같이^56,57,58....

결과

쥐의 유전적 혈통 추적과 함께 12Gy 전신 방사선 조사(TBI)를 사용하면 장내 방사선 손상의 결과를 철저히 분석할 수 있습니다. 시작하려면 Bmi1-Cre^ER; Rosa26^eYFP 마우스는 Bmi1⁺ 예비 줄기 세포 집단 내에서 향상된 황색 형광 단백질(EYFP) 발현을 유도하는 단일 타목시펜 주사를 받았습니다. 타목시펜 주사 이틀 후, 마우스는 방사선 조사 또는 가짜 방사선 조사를 받았다. 안락사 3 시간 전에 생쥐에게 EdU를 주사했습니다. 안락사 후, 방사선 조사 후 0시간, 3시간, 6시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간 및 7일에 분석을 위해 소장 표본을 수집했습니다. 앞서 언급한 시간 경과의 대표적인 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 이미지(그림 1)는 손상에 대한 장 상피 반응을 보여줍니다. 0h 시점은 항상성 장 상피를 예시합니다(그.......

토론

이 프로토콜은 강력하고 재현 가능한 방사선 손상 모델을 설명합니다. 이를 통해 손상 후 7일 동안 장 상피의 변화를 정확하게 분석할 수 있습니다. 중요하게도, 선택된 시점은 손상의 중요한 단계를 반영하며 장의 뚜렷한 변화(손상, 세포자멸사, 재생 및 정상화 단계)를 특징으로 합니다⁶⁰. 이 방사선 조사 모델은 확립되고 신중하게 평가되어 방사선 요법을 받는 환자가 경험하는 것을 모방할 수 있는 적절한 손상 징후를 보여줍니다⁶¹. 대장 암 및 부인과 암 환자의 절반 이상이 복부 방사선 치료를받습니다 40,62,63. 표적 방사선 요법을 위한 진보된 방법에도 불구하고, 환자들은 건강한 장 조직의 방사선 조사를 경험하며, 이는 여기에 제시된 전신 방사선 조사 모델에서 관찰된 것과 매우 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1mL 주사기	BD
309659-16G 재사용 가능한 소형 동물 먹이 바늘: 스트레이트	VWR	20068-630-27G
x 1/2" 바늘	BD
305109-28G x 1/2" Monoject 1mL 인슐린 주사기	Covidien
1188128012-5-Ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU)	Santa Cruz Biotechnology	sc284628A	멸균 DMSO:물(1:4 v/v)에 10mg/mL, 분취 및 -20°C에 보관; C
아제르 사이언티픽  10% 중성 완충 포르말린	Fisher Scientific	22-026-213-B6.129X1-GT
(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J	잭슨 실험실	균주 #:006148
B6; 129-BMI1TM1(CRE/ERT)Mrc/J	The Jackson Laboratory	Strain #:010531
소 혈청 알부민 분획 V, 열 충격	Millipore-Sigma	3116956001
Chicken anti-GFP	Aves	GFP-1020
Click-IT plus EdU Alexa Fluor 555 이미징 키트, Invitrogen	Thermo Fisher Scientific	C10638	-
옥수수 기름	Millipore-Sigma	C8267-Decloaking
Chamber	Biocare Medical	DC2012-Dimethyl
sulfoxide (DMSO)	Fisher BioReagents	BP231-100	감광성
DNase-free proteinase K	Invitrogen	C10618H
당나귀 안티 닭 AF647	Jackson ImmunoResearch	703-605-155
DPBS	Scientific	21-031-CV-Eosin
	Fisher Scientific	S176
형광 현미경 Nikon Eclipse 90i 밝고 형광, 대물렌즈: 10X, 20X	Nikon
Fluoromount 수성 장착 매체	Millipore-Sigma	F4680-25ML
감마 셀 40	Exactor Best Theratronics Ltd.	-	0.759 Gy min-1
Goat anti-rabbit AF488	Jackson ImmunoResearch	111-545-144
Hematoxylin Solution, Gill No. 3	Millipore-Sigma	GHS332
HM 325 Rotary Microtome from	Thermo Scientific Fisher Scientific	23-900-668
Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide)	Thermo Fisher Scientific	H3569	희석 1:1000
과산화수소 용액, ACS, 29-32%, 스펙트럼 케미	컬 Fisher Scientific	18-603-252	-
현장 세포 사멸 검출 키트, 플루오레세인(로슈)	밀리포어-시그마	11684795910
액체 차단제 Super PAP PEN, Mini	Fisher Scientific	DAI-PAP-S-M
탄산리튬(분말/인증 ACS), 피셔 케미컬	Fisher Scientific	L119-500	0.5g/1L dH2O
Luer-Lok 주사기 멸균, 일회용, 10 mL	VWR	89215-218	-
메탄올	VWR	BDH1135-4LP
Pharmco 제품  에틸 알코올, 200 PROOF	Fisher Scientific
NC1675398-Pharmco-Aaper 281000ACSCSLT 아세트산 ACS 등급	Capitol Scientific	AAP-281000ACSCSLT-Rabbit
anti-Ki67	BioCare Medical	CRM325
Richard-Allan Scientific Cytoseal XYL 장착 매체	Fisher Scientific	22-050-262
과학 산업 인큐베이터-65도에서 슬라이드를 굽는 지니	Fisher Scientific	50-728-103
시트르산 나트륨 디하이드레이트	Fisher Scientific	S279-500
스테인리스 스틸 해부 키트	VWR	25640-002
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Tamoxifen	Millipore-Sigma	T5648	멸균 옥수수 기름에 30 mg/mL, -20°C에서 신선 또는 단기 보관이 바람직합니다. C, 빛에 민감한
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