Method Article

Multichannel Thin-film Electrodes를 사용한 마우스의 시각적 유발 전위의 지형 EEG 기록

DOI:

10.3791/64034

⸱

June 23rd, 2022

 ,  , 
1Institute for Audioneurotechnology, Department of Experimental Otology, Hannover Medical School, 2Institute for Endocrinology and Diabetes, Center of Brain, Behavior and Metabolism, University of Lübeck

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

본 프로토콜은 마우스의 32-다중 채널 박막 전극을 사용하여 상시 두개 시각 유발 전위의 지형을 획득하고 분석하는 간단한 절차를 설명합니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

VEP(Visual Evoked Potentials)를 사용하면 전임상 마우스 모델에서 시각적 기능을 특성화할 수 있습니다. 비침습적 EEG, 피하 단일 전극 및 ECoG에서 완전 침습적 피질 내 다채널 시각 피질 기록에 이르기까지 마우스의 VEP를 측정하기 위한 다양한 방법이 존재합니다. 급성 실험 환경에서 국소 피질 내 미세 전극 측정 이전에 시각적 반응의 글로벌 지형 EEG 수준 특성화를 획득하는 것이 유용할 수 있습니다. 예를 들어, 한 가지 사용 사례는 국소 피질 내 수준에서 미치는 영향을 연구하기 전에 청각 장애 모델에서 VEP 지형의 전체 교차 모드 변화를 평가하는 것입니다. 다채널 유두개 EEG는 피질 시각 활동에 대한 이러한 개요 측정을 획득하는 강력한 방법입니다. 다채널 상두개 EEG는 예를 들어 피질 시각 기능의 교차 모드, 병리학적 또는 연령 관련 변화를 식별하기 위해 표준화되고 일관된 접근 방식을 통해 유사한 결과를 제공합니다. 현재 연구는 마취된 마우스에서 32채널 박막 EEG 전극 어레이를 사용하여 플래시 유발 VEP의 지형 분포를 얻는 방법을 제시합니다. 시간 및 주파수 영역의 분석과 결합된 이 접근 방식을 사용하면 다양한 급성 실험 설정과 결합할 수 있는 생쥐 피질 시각 기능의 지형 및 기본 시각적 특성을 빠르게 특성화하고 스크리닝할 수 있습니다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

마우스는 시력 및 안과 질환의 퇴행성 과정의 전임상 모델입니다 1,2,3,4. 시각 유발 전위(VEP)는 일반적으로 피질의 시각 기능을 측정하고, 예를 들어 병리학적 모델에서 시각적 퇴행을 평가하는 데 사용됩니다 5,6. VEP 잠복기, 전도 시간, 진폭, 다초점 특성 또는 피질 시각 유발 전위의 공간적 예리도는 시각 시스템의 기능적 무결성에 대한 진단 정보를 제공합니다 7,8,9.

생쥐의 경우, 비침습적 EEG, 피하 바늘 전극 및 두개골 이식 나사, 피질 내 ECoG를 사용한 완전 침습적 두개내 접근법, 피질 내 전극 기록 10,11,12,13,14,15,16,17에 이르기까지 다양한 복잡성의 방법으로 다양한 공간 규모에 걸쳐 피질 시각 유발 전위를 측정할 수 있습니다. 이러한 방법에는 서로 다른 강점과 약점이 있습니다. 예를 들어, 적은 수의 전극은 피질 VEP 분포에 대한 제한된 정보만 제공하는 반면, 피하 바늘 전극은 종종 일관된 기록 위치를 보장하지 못합니다. 더욱이, 이식된 나사 또는 완전 침습적 방법은 두개골의 손상, 관통 또는 제거를 필요로 하며 종종 지역 정보만 제공합니다.

급성 실험에서는 대뇌피질 시각 기능에 대한 첫 번째 전반적 개요가 필요한 경우가 많으며, 이는 결국 추가 실험 단계가 뒤따르고 국소 피질 내 기록과 비교됩니다. 예를 들어, 국소 피질 내 수준에 미치는 영향을 연구하기 전에 VEP 지형 및 피질 시각 활동에 대한 청각 장애 또는 청력 손실의 시각적 교차 모드 재구성의 EEG 수준 효과를 조사하기 위해 먼저 하나의 잠재적인 사용 사례가 활용됩니다18,19.

박막 다중 전극 어레이를 사용한 다중 채널 EEG 기록은 마우스 두개골 20,21,22,23,24에서 체계화된 VEP 지형을 제공할 수 있습니다. 이러한 상두개 기록은 두개골의 무결성을 그대로 유지하고 피질 표면의 직접적인 조작을 피함으로써 ECoG 기록에 비해 이점을 가질 수 있습니다. 또한, 박막 다중 전극은 표준화된 전극 구성을 제공하여 인간의 표준화된 EEG 시스템과 유사한 실험 간에 시각적으로 유발된 시공간 뇌 활동을 비교할 수 있습니다25. 또한 표준화된 프레임워크는 일반적인 EEG 분석 도구 상자(예: Fieldtrip, Chronux, EEGLAB 및 ERPLAB)를 사용하여 시간 및 주파수 영역 또는 연결성 측면에서 마우스 EEG를 분석할 수 있도록 합니다 26,27,28,29,30,31.

본 프로토콜은 32채널 박막 전극을 사용하여 마우스의 지형 VEP 기록 절차를 설명합니다. 이것은 급성 실험의 일부로 사용될 수 있으며, 특정 뇌 영역의 피질 내 미세 전극 기록과 같은 추가 실험 단계가 뒤따를 수 있습니다. 여기에서는 마우스의 32채널 박막 전극을 사용하여 에피크라니아 플래시 유발 VEP를 안정적으로 기록하는 방법을 보여줍니다. 또한 시간 및 주파수 영역에서 지형 VEP 기록의 예시적인 분석이 제시됩니다.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

모든 동물은 독일(TierSchG, BGBl. I S. 1206, 1313) 및 유럽 연합(ETS 123; Directive 2010/63/EU) 동물 연구에 대한 지침. 동물 실험은 독일 주 당국(니더작센 주 소비자 보호 및 식품 안전 사무국, LAVES)의 승인을 받았으며 대학 동물 복지 담당관의 모니터링을 받았습니다. 본 연구에는 3개월 된 수컷 C57BL/6J 마우스가 사용되었습니다.

1. 동물 세부 정보

  1. 특정 연구 질문에 적합한 마우스에서 VEP 측정을 수행합니다.
  2. 생리학에서 생쥐 균주의 특성은 마취제 민감성, 발작 민감성, 연령 또는 유전적 배경의 변화에 의해 실험에 영향을 미칠 수 있음을 알고 있어야 합니다.
    참고: 유전적 배경이 다른 마우스 균주는 종종 다른 감각 장애(예: C57BL/6 진행성 난청)를 유발할 수 있으며, 이는 눈에 띄지 않을 수 있지만 시각 처리에 간접적으로 영향을 미칠 수 있습니다(예: 교차 모드 영향19).

2. 전신 마취 유도

  1. 기록 부위에 수술 부위를 준비합니다. 마우스의 수술 전 체중을 확인합니다.
  2. 100mg/kg 케타민 염산염, 4mg/kg 자일라진 염산염 및 5mg/kg 카프로펜의 용량으로 케타민/자일라진, ip로 마취를 유도합니다( 재료 표 참조).
  3. 주입 직후 마우스를 케이지에 다시 넣으십시오.
  4. 적외선 가열 램프( 재료 표 참조)를 적절한 거리에 놓고 최소 5분 동안 전신 마취가 완전히 유도될 때까지 기다립니다.
  5. 자발적인 움직임의 멈춤과 오른쪽 반사의 상실을 관찰하십시오. 발가락 핀치 반사의 손실을 확인하십시오.

3. 전신 마취의 생리학적 모니터링 및 유지

  1. 마우스를 기록 사이트로 옮겨 가열 패드에 놓습니다.
  2. 온도 조절 시스템에 부착된 직장 온도 프로브를 사용하여 심부 체온을 37.6-37.8 °C로 유지합니다.
  3. 마우스의 최적 체온을 확인하십시오. 발열 패드 외에도 필요한 경우 실내 온도를 높여 열 손실을 최소화합니다.
  4. ECG 모니터링을 위해 오른쪽 어깨와 왼쪽 뒷다리 근처에 두 개의 피하 은선 전극(직경 0.2mm, 재료 표 참조)을 배치합니다.
  5. 은선 ECG 전극을 ECG 증폭기에 부착합니다.
  6. 실험 중에 오실로스코프에서 심박수 및 ECG 파동을 모니터링합니다( 재료 표 참조).
    참고: 적절한 케타민/자일라진 마취 중 심박수는 160-250bpm32,33 사이일 수 있습니다. 심박수는 마우스의 변형, 연령 및 생리적 상태에 따라 달라질 수 있습니다.
  7. 발가락 꼬집 반사 및 활력 징후를 확인하십시오. 발가락 꼬집음 반사 반응이 없다는 것은 충분한 수준의 마취를 나타냅니다.
  8. 시술 중 눈의 상태와 질을 면밀히 모니터링하고 점안액이나 젤을 바르십시오.
  9. 생리적 매개변수, 심박수, 반사 신경 및 EEG 활동을 정기적으로 확인하여 적절한 마취 수준을 모니터링합니다.
  10. 전신 마취 수치가 너무 낮아지면 케타민/자일라진(i.p.)을 추가로 투여합니다.
  11. 전신 마취 기간과 전신 마취를 유지하기 위해 사용되는 추가 케타민/자일라진의 후속 투여 횟수를 최소화하기 위해 실험 단계를 빠르게 진행합니다.

4. 전극 배치 및 녹음 설정

  1. 기록 부위에서 발가락 꼬집음 반사를 확인하여 적절한 마취 깊이를 재평가합니다.
  2. 전기 면도기로 정수리를 면도합니다.
  3. 자유로운 시야를 허용하려면 실험 중에 마우스를 정위 프레임에 고정하지 마십시오.
  4. 리도카인을 바르십시오(동물 관리에 대한 지역 기관 지침에서 추가로 요구하는 경우).
  5. 두피를 1cm 정도 정중선으로 절개합니다.
  6. 작은 혈관 클램프를 사용하여 피부를 양쪽으로 집어넣어 피부를 제자리에 고정하고 두개골을 노출시킵니다.
  7. 면봉과 식염수 NaCl(0.9%)로 두개골 표면을 청소합니다.
  8. EEG를 위한 은선 참조 전극(직경 0.2mm)을 코 위(nose reference) 또는 귀 뒤(유양돌기)에 피하로 부착합니다.
  9. 프로브 커넥터를 통해 노즈 참조를 헤드스테이지에 연결합니다( 재료 표 참조) 참조 출력.
  10. 다음으로, 프로브 커넥터를 통해 헤드스테이지에 부착되고 전극 홀더에 부착된 어댑터를 사용하여 EEG 전극을 헤드스테이지에 부착합니다( 재료 표 참조).
  11. 각 실험에 대해 표준화된 전극 위치를 보장하기 위해 브레그마를 기준 위치로 하여 두개골에 다중 채널 박막 EEG 전극( 재료 표 참조)을 배치합니다.
  12. 식염수 한 방울을 사용하여 전극의 위치를 조정하십시오. 두개골 표면이 아직 젖어 있는 동안 전극은 쉽게 움직일 수 있습니다. 그런 다음 면봉으로 두개골을 조심스럽게 말리십시오.
  13. 식염수가 마르고 전극이 두개골에 단단히 부착될 때까지 기다립니다.
  14. 전극이 피부에 부착되지 않도록 작은 실리콘 오일 한 방울로 전극을 덮으십시오. 이 단계는 녹음 후 전극을 쉽게 제거하는 데 도움이 됩니다.
    알림: 전극과 두개골의 접촉이 악화되지 않도록 실리콘 오일을 너무 많이 바르지 않도록 주의하십시오.
  15. 보호하고 전기 노이즈를 최소화하기 위해 전극 위의 피부를 닫으십시오.
  16. 피부 절개 부위가 다시 열리는 것을 방지하기 위해 작은 한 방울의 조직 접착제( 재료 표 참조)를 피부에 바르십시오.

5. EEG 기록 및 VEP 측정

  1. 1-9000Hz 사이의 와이드 필터로 획득하는 동안 EEG 신호를 필터링합니다. 아티팩트 제어를 위해 와이드 필터 설정을 사용합니다. 나중에 오프라인 처리 중에 노이즈 및 적절한 필터링을 수행합니다.
  2. 고주파 전기 노이즈, 50/60Hz 아티팩트 및 ECG 아티팩트를 확인하여 진행 중인 EEG 활동의 신호 품질을 확인합니다. 동물 및 장비에 적절한 접지 및 참조 연결을 적용하거나 적절한 차폐를 적용하십시오.
  3. EEG 활동을 관찰하여 마취 깊이를 확인하십시오. 파열 억제 EEG 활동의 발생을 특징으로 하는 '너무 깊은' 마취 상태를 피하십시오. 실험의 시간 경과를 고려하고 녹음하는 동안 마취가 너무 가볍지 않은지 확인합니다.
  4. LED 스트로보스코프(또는 다른 유형의 시각적 자극)를 사용하여 초단파 섬광을 생성합니다( 재료 표 참조)(그림 1).
  5. 마우스 앞에서 양안 시각 자극을 위해 스트로보스코프를 30cm 거리에 놓습니다.
    알림: 마우스와 스트로보스코프는 실험하는 동안 어둡고 방음이 잘 되는 방에 넣습니다.
  6. 자극하기 전에 5분 동안 쥐를 어둠에 적응시킵니다.
  7. Elicit 스트로보스코프는 TTL 펄스로 스트로보스코프를 트리거하여 깜박입니다.
    알림: 스트로보스코프의 높은 전압으로 인해 자극 아티팩트가 발생할 수 있습니다. 이는 거리를 늘리거나 전극을 차폐하여 감쇠할 수 있습니다.
  8. 광원(즉, 스트로보스코프)을 트리거하기 위해 자극 PC에 의해 제어되는 다기능 I/O 장치( Table of Materials 참조)로 하드웨어 TTL 트리거를 생성합니다.
  9. TTL 신호를 수집 시스템에 병렬로 전송하여 자극 시작에 대한 고정밀 타임스탬프를 제공합니다.
  10. 플래시와 동기화되는 TTL 출력을 LED 스트로보스코프에서 피드백으로 보내고 정확한 자극 시작 트리거 타임스탬프를 위한 두 번째 제어로 보냅니다. 녹음과 함께 등록하십시오.
  11. 자극 속도를 설정합니다(예: 자극 간 간격 = 2초). 자극 반복 횟수를 설정합니다(예: n = 150회 반복).
  12. 스트로보스코프에서 강도를 수동으로 조정합니다(예: 512lm의 고정 값에서 3000μs의 발광 시간).
    참고 : 그러나 이것은 특정 실험 질문에 맞게 조정되어야합니다.
  13. 자극 프리젠테이션을 시작하고, 기록 소프트웨어( 재료 표 참조)로 EEG 신호를 기록하고, 기록 PC에 데이터를 저장합니다.

6. 실험 완료, 전극 제거 및 전극 세척

  1. 녹음이 더 긴 프로토콜의 일부인 경우 추가 실험 단계를 계속합니다.
  2. 실험이 끝나면 기관 지침23,34에 따라 동물을 안락사시킵니다.
  3. EEG 전극을 주의해서 제거하십시오(재사용할 수 있으므로).
  4. 천천히 액체를 가하여 두개골에서 전극을 제거하십시오.
    알림: 전극은 두개골 표면에 달라붙을 수 있습니다. 제거하는 동안 백금 부위가 손상되지 않도록 하십시오.
  5. 등장성 식염수 NaCl(0.9%)로 실험한 후 전극을 세척하고 단백질 제거제 및 소독 용액( 재료 표 참조)에 30분 동안 담그십시오.
  6. 전극 어레이를 건조하고 보호된 장소에 보관하십시오.

7. 기본 VEP 신호 처리: 시간 및 주파수 도메인

  1. 원시 데이터 파일을 해석 소프트웨어로 가져옵니다( 재료 표 참조).
  2. 버터워스 대역통과 영위상 필터를 사용하여 1-100Hz 사이의 EEG 신호를 필터링합니다.
    참고: 해당 연구 질문 27,35,36에 따라 적절한 필터 유형과 매개변수를 선택하십시오.
  3. 신호를 1000Hz로 다운샘플링합니다.
  4. EEG 신호를 여러 번의 시도로 분류하고 시도의 평균을 구하여 시각적 유발 전위를 산출하고 N1 피크 잠복기를 결정합니다.
    참고: 필요한 경우 재참조(re-referencing)를 오프라인으로 수행할 수 있습니다(예: 공통 평균 참조, 양극성 참조, 로컬 평균 "라플라시안" 참조)23.
  5. 특정 관심 지점에서 전압 값을 결정하고 분석 소프트웨어를 사용하여 전압 분포 맵을 플로팅합니다.
  6. 모든 전극 채널의 공간 표준 편차를 계산하여 전역 필드 전력37 을 계산합니다.
  7. Chronux Toolbox28,31을 사용하여 다중 테이퍼 시간-주파수 스펙트로그램을 계산할 수 있습니다. 300ms 윈도우 크기와 30ms 스텝 크기의 대역폭 곱 TW = 3 및 K = 5 테이퍼를 사용합니다.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

다채널 EEG로 시각적 유발 전위를 기록하면 마우스의 VEP 진폭, 잠복 시간 또는 주파수 성분의 지형을 평가할 수 있습니다. 그림 2A 는 3개월 된 수컷 C57BL/6J 마우스의 상시두개 32채널 EEG로 기록된 섬광 유발 VEP 지형의 예를 보여줍니다. 가장 강력한 시각적 유발 활동은 시각 피질 위의 후두 영역에서 발생합니다.

그림 2B 는 플래시 발병 전후의 서로 다른 시점에서 두개골에 대한 전압 분포를 보여줍니다. VEP의 가장 강한 N1 진폭은 중앙 후두 부위 위의 자극 후 50ms에서 발생합니다. 그 다음에는 잠재적인 반전과 자극 후 300ms에서 후두부와 전두부 영역에 걸쳐 양의 피크가 나타납니다. 그림 1B 의 버터플라이 플롯은 46ms에서 VEP N1 구성 요소의 피크 대기 시간과 발병 후 약 300ms...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 기사에서는 박막 전극으로 두개골 외측 다채널 EEG를 기록하는 방법과 마우스에서 시각적 유발 전위의 일관된 지형적 표현을 획득하는 방법에 대해 설명합니다. 여기서, 우리는 양안 섬광 자극을 예시적으로 보여주었지만, 이 접근 방식은 예를 들어 더 큰 디스플레이를 사용하여 다른 유형의 시각적 자극(즉, 단안, 공간 격자, 초점 시야)에도 적용할 수 있습니다.

프로토콜에서 중요한 단계는 전극의 위치 지정입니다. 실험 간의 비교가 가능하도록 정확하고 일관된 전극 위치가 보장되어야 합니다. 중요한 것은 나중에 비교할 수 있도록 전극 위치를 문서화해야 한다는 것입니다(즉, 현미경 이미지 작동). 다양한 유형의 박막 전극 및 구성(다른 유통업체에서)을 사용할 수 있지만, 정의된 전극 구성을 결정하고 실험에서 역비교를 위해 이를 고수하는 것이 좋습니다. 두 번째 중요한 측면은 두개골과의 좋은 전극 접촉입니다. 접촉 품질은 전극 임...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 경쟁하는 재정적 이해관계나 기타 이해상충이 없음을 선언합니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 독일 연구 재단(Deutsche Forschungsgemeinschaft, Cluster of Excellence 2177 "Hearing4all", 프로젝트 번호 390895286)의 지원을 받았습니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Bepanthen 5% DexpantheolBayerOphtamic gel
Cheetah 소프트웨어 5.11Neuralnyx버전 5.11신경 생리학적 신호용 녹음 소프트웨어
Digital Lynx SXNeuralynxDigital Lynx 16SX녹음 시스템
ECG 차동 증폭기OtoconsultWDA2 V1.0
전기 면도기AesculapGT420
전극 홀더TSE 시스템430005-HE
검사등HeineHL 5000차가운 광원 램프
가열 패드 + 온도 제어 시스템CWETC-1000 마우스
Histoacryl 0.5 mLB.Braun조직 접착제
적외선 열 램프 SanitasSIL 06
케타민 10% WDT케타민하이드로클로라이드
LED 스트로보스코프 MonarchNova Strobe PBL시각적 자극
Matlab 2021aThe Mathworks2021a자극 제어 및 분석
Moria Vessel ClampFine Science Tools18320-11
마우스 EEG 전극 NeuroNexusH32(망상)32채널 EEG 전극. 두께: 20 μ m; 길이 : 8.6 mm; 너비 6.8mm. 플래티넘 사이트: 500 μ m 지름
마우스 프레임 맞춤형 정보 요청 시 제공
다기능 I/O 장치National InstrumentsPCIe-6353 with BNC 2090A아날로그 자극 생성, 출력, 트리거
NaCl 0.9%B.Braun이소톤, 멸균, 비발열성
Neuralynx HS36 NeuralynxHS-36헤드스테이지
Neuronexus 프로브 커넥터NeuralynxADPT-HS36-N2T-32A전극 커넥터
오실로스코프TektronixTDS 2014B
Progent Intensive CleanerMenicon단백질 제거제 및 소독 용액 경질 가스 투과성 렌즈
녹화 PC HPHP Z800레코딩 PC
Rimadyl (Carprofen)ZoetisCarprofen
Silicon Oil M 1000Carl Roth4045.1
Silver wire 과학 제품AG-8W직경 203 &마이크로; m; ECG 및 참조 전극
방음 챔버IAC 음향
입체 MicromanipulatorTSE 시스템430005-M/PEEG 전극 배치
자극 PCDellDell Precision T5810자극 PC
외과 현미경ZeissOp-Mi Focus
수술 테이프3M1527-01.25cm x 9.1m
Thilo-Tears 3 mg/gAlcon Pharma GmbHOphtamic gel
Vaselin LichtensteinWinthropWhite vaselin 연고
Xylazin 2%   BernburgXylazinehydrochlorid
Xylocaine 스프레이 (10mg/분홍)아스펜리도카인

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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