단량체 알파 시누클레인의 구조적 앙상블은 생리 기능과 물리 화학적 특성에 영향을 미칩니다. 본 프로토콜은 밀리초 수소/중수소-교환 질량 분광법 및 후속 데이터 분석을 수행하여 생리학적 조건 하에서 본질적으로 무질서한 단백질의 단량체에 대한 형태 정보를 결정하는 방법을 기술한다.
단량체 알파 시누클레인의 구조적 앙상블은 생리 기능과 물리 화학적 특성에 영향을 미칩니다. 본 프로토콜은 밀리초 수소/중수소-교환 질량 분광법 및 후속 데이터 분석을 수행하여 생리학적 조건 하에서 본질적으로 무질서한 단백질의 단량체에 대한 형태 정보를 결정하는 방법을 기술한다.
알파 시누클레인 (aSyn)은 파킨슨 병의 특징 인 Lewy 몸과 신경 고리에 피브릴라 응집체가 풍부한 본질적으로 무질서한 단백질입니다. 그러나, 그의 생물학적 활성의 대부분은, 그것의 응집뿐만 아니라, 중앙적으로는 단백질의 가용성 단량체 형태를 포함한다. aSyn 생물학 및 병태생리학의 분자 메커니즘에 대한 해명은 구조적으로 고도로 분해된 방법을 필요로 하며 생물학적 조건에 민감하다. 그것의 본래 펼쳐진, 메타 안정한 구조는 단량체 aSyn을 많은 구조 생물학 기술에 다루기 어렵게 만든다. 여기에서는 이러한 접근법 중 하나의 적용이 설명됩니다 : aSyn과 같은 열역학적 안정성이 낮고 보호 인자가 약한 단백질을 연구하기 위해 밀리 초 시간 척도의 수소 / 중수소 교환 질량 분광법 (HDX-MS)이 설명됩니다. 밀리초 시간 척도에서 HDX-MS 데이터에는 aSyn의 용매 접근성 및 수소 결합 구조에 대한 정보가 포함되어 있으며, 이는 더 긴 라벨링 시간에 손실되어 궁극적으로 아미노산 수준까지 구조적 분해능을 산출합니다. 따라서 HDX-MS는 형태 역학 및 열역학, 분자 내 및 분자 간 상호 작용, 돌연변이 또는 환경 조건에 대한 변경의 구조적 영향에 대한 높은 구조적 및 시간적 해상도로 정보를 제공 할 수 있습니다. 광범위하게 적용가능하지만, 단량체 aSyn에서 밀리초 HDX-MS 측정을 획득, 분석 및 해석하는 방법이 입증된다.
파킨슨 병 (PD)은 전 세계 수백만 명의 사람들에게 영향을 미치는 신경 퇴행성 질환입니다1. 그것은 뇌의 흑질파 콤팩타 영역에서 Lewy 바디 및 Lewy 뉴라이트로 알려진 세포질 내포물의 형성을 특징으로합니다. 이들 세포질 내포물은 본질적으로 무질서한 단백질 aSyn2의 응집체를 함유하는 것으로 밝혀졌다. PD 및 다른 synucleinopathies에서, aSyn은 가용성 무질서 상태에서 불용성, 고도로 구조화 된 병적 상태로 변형된다. 그것의 본래 형태에서, 단량체성 aSyn은 그것의 N- 및 C-테르미니 사이 장거리 정전기 상호 작용 및 그것의 C-말단 및 비-아밀로이드 베타 성분 (NAC) 영역 3,4,5,6 사이의 소수성 상호작용에 의해 안정화된 광범위한 입체 형태를 채택한다. 돌연변이, 번역 후 변형 및 국소 환경의 변화와 같은 이러한 안정화 상호 작용의 중단은 단량체의 오폴딩으로 이어질 수 있으며, 따라서 응집 과정을 촉발시킬 수 있습니다
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1. aSyn의 단백질 발현 및 정제
2. HDX 버퍼 준비
참고: 트리스는 고온 계수를 갖기 때문에 HDX 반응이 수행되는 온도(이 프로토콜에서 20°C)에 맞게 pH 측정을 조정해야 합니다.
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본질적으로 무질서한 특성으로 인해 생리적 pH에서 aSyn의 복잡한 구조적 변화를 포착하는 것은 어렵습니다. HDX-MS는 백본 아미드 수소에서 동위원소 교환을 모니터링하여 단백질 형태 역학 및 상호 작용을 조사합니다. 높은 구조적 및 시간적 해상도에서이 정보를 얻는 몇 안되는 기술 중 하나입니다. 이 프로토콜은 광범위한 단백질 및 완충액 조건에 광범위하게 적용가능하며, 이는 단계 2.1.-2.2에 정의된 바와 같이 상태 A 및 상태 B8의 두 가지 다른 용액 조건에서 aSyn의 교환 동역학의 측정에 의해 예시된다.
먼저, aSyn에 대한 매핑 실험을 수행하였고, 도 1에 도시된 바와 같이 펩티드 커버리지 맵을 얻었다. 지도는 단백질 서열의 100%를 커버하고 3.79의 평균 중복성을 갖는다. 100% 커버리지 값은 단백질의 모든 아미노산이 단백질 소화물에서 발견되었음을 나타내며 aS.......
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본 기사에서, 다음의 절차가 기술된다: (1) 가장 높은 서열 커버리지를 얻기 위해 단량체성 aSyn에 대한 펩티드 매핑 실험을 수행하고, (2) 생리학적 조건 하에서 단량체성 aSyn에 대한 밀리초 HDX-MS 데이터를 획득하고, (3) 생성된 HDX-MS 데이터의 데이터 분석 및 해석을 수행한다. 제공된 절차는 일반적으로 실행이 간단하며, 각 라벨링 실험은 일반적으로 세 번의 반복실험과 8개의 시간 지점에 대해 약 8시간 동안 지속되며, 매핑 실험은 약 2시간 동안 지속됩니다. 여기에 사용된 완전 자동화된 계측을 감안할 때 1일 내에 전체 데이터 세트를 획득할 수 있습니다. 그러나 샘플을 취급하고 완충액을 준비 할 때는 측정이 원하는 상태에서 약하게 안정적인 단백질 (또는 단백질 영역)에서 파생되도록 주의해야합니다. 중요하게도, 이전의 연구는 동결 및 동결건조와 같은 상이한 저장 조건이 상이한 aSyn 단량체 순응제를 초래하고, aSyn 단량체 형태 앙상블10에 대한 샘플 취급의 잠.......
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저자는 경쟁 이익이 없다고 선언합니다.
NS는 University Council Diamond Jubilee Scholarship의 지원을 받습니다. JJP는 UKRI Future Leaders Fellowship [Grant number : MR / T02223X / 1]의 지원을 받습니다.
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| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1 × 100 mm ACQUITY BEH 1.7 & m C18 열 | Waters Corporation | 186002346 | 분석 컬럼 |
| Acetonitrile HPLC 등급 >99.9% HiPerSolv | VWR | 20060.420 | LC 이동상용 |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C5670 | Salt for HDX buffers |
| Chronos | Axel Semrau(Waters Corporation에서 구매667006090 | 여러 HDX-MS 시료를 자동으로 주입할 수 있는 스케줄링 소프트웨어. HDXDirector 또는 LEAP Shell | |
| 염화중수소 | Goss Scientific(Cambridge Isotope Laboratories) | DLM-2-50 | HDX 라벨링 완충액: |
| 산화중수소(99.9%)>O) | Goss Scientific(Cambridge Isotope Laboratories) | DLM-4 | 중수소수 |
| DynamX 3.0 | Waters Corporation | , 176016027 | 동위원소 할당 및 중수소 혼입 계산 |
| 효소 BEH 펩신 컬럼 | Waters Corporation | 186007233 | 펩신 분해 컬럼 |
| 포름산, 99.0% LC/MS 등급 | Fisher Scientific | 10596814 | LC 이동상용 |
| 구아니디늄 하이드로클로라이드 | 시그마 알드리치 | RDD001-500G | Chaotrope/Denaturant |
| HDfleX | 엑서터 대학교 | N/A | |
| https://ore.exeter.ac.uk/repository/handle/10871/127982 KCl | Sigma Aldrich | P3911 | HDX 버퍼용 염 |
| LEAP HDX-2 CTC PAL 샘플링 로봇 | Waters Corporation | 725000637 | 자동시료주입기 로봇 |
| Leucine enkephalin | Waters Corporation | 186006013 | 질량 분석 록스프레이 보정용. |
| MassLynx | Waters Corporation | 667004007 | 주입 방법 및 질량 분석기를 제어하는 소프트웨어 |
| 최대 회수 바이알 | , Waters Corporation | 600000670CV | 100 팩, 캡 포함 - LEAP HDX-2 |
| MgCl2 | Aldrich | M8266 | Salt for HDX buffers |
| Millipore 0.22 µ m 주사기 필터 | Millipore | N9CA7069B | 주사기 필터 |
| ms2min | Applied Photophysics Ltd | N/A | 고속 혼합 담금질 흐름 밀리초 HDX 기기 |
| NaCl | Sigma Aldrich | S9888 | HDX 버퍼용 소금 |
| Peltier 온도 컨트롤러 | LEAP Technologies Inc. | HP115-COOL/D | 펠티에 컨트롤러는 LEAP 로봇에서 챔버의 정확한 온도를 설정합니다. |
| ProteinLynx Global Server 3.0 | Waters Corporation | 715001030 | 펩타이드 식별 소프트웨어. 대체 소프트웨어는 다른 공급업체에서 구할 수 있습니다. |
| 시약 냄비 뚜껑 | Waters Corporation | 186004632 | 100 팩 |
| LEAP HDX-2 용 시약 냄비 | Waters Corporation | 186001420 | 100 팩 (뚜껑 제외) - LEAP HDX-2 |
| 중수소화 나트륨 (D2O에서 99.5 %), | Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories) | DLM-57 | HDX 라벨링 버퍼 스핀 |
| 필터 마이크로 원심 분리기 튜브 (3 kDa MWCO)의 완충액 | Amicon (Merck Sigma Aldrich) | UFC5003 | 단백질을 농축하기 위한 마이크로 원심분리기 튜브. 이를 통해 HDX-MS 실험을 위한 버퍼 교환 및 정확한 시료 로딩이 용이합니다. |
| Synapt G2-Si 질량 분석기 | Waters Corporation | 176850035 | 질량 분석기 |
| 총 회수 바이알 | Waters Corporation | 600000671CV | 100 팩 (캡 포함) - LEAP HDX-2 |
| Tris-HCl | Sigma Aldrich | T3253-250G | Buffer |
| Trizma base | Sigma Aldrich | T60040-B2005 | Buffer |
| Urea | Sigma Aldrich | U5378-1KG | Chaotrope/Denaturant |
| VanGuard 2.1 x 5 mm ACQUITY BEH C18 컬럼 | Waters Corporation | 186004623 | 트랩 탈염 컬럼 |
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