설치류 근육 세포에서 심장 수축 기능 장애 및Ca 2+ 과도 현상 분석

Summary

분리된 쥐 근세포에서 칼슘(^{Ca 2+}) 과도 측정과 함께 근절 길이 검출을 통한 수축 기능의 측정을 설명하는 일련의 프로토콜이 제시됩니다. 심부전 동물 모델에서의 연구에 대한이 접근법의 적용도 포함됩니다.

Abstract

수축성 기능 장애 및^{Ca 2+} 과도 현상은 종종 심장 유발 손상 및/또는 리모델링에 대한 포괄적인 평가의 일부로 세포 수준에서 분석됩니다. 이러한 기능적 변화를 평가하기 위한 한 가지 접근법은 원발성 성인 심장 근세포에서 무부하 단축 및^{Ca 2+} 과도 분석을 활용합니다. 이 접근법을 위해, 성체 근세포는 콜라게나제 소화에 의해 분리되고,^{Ca 2+} 에 내성이 있게 된 다음, 라미닌 코팅 커버슬립에 부착된 다음, 무혈청 배지에서 전기 페이싱을 한다. 일반적인 프로토콜은 성인 쥐 심장 근육 세포를 사용하지만 다른 종의 원발성 근육 세포에 대해 쉽게 조정할 수 있습니다. 손상된 심장에서 근육 세포의 기능적 변화는 가짜 근육 세포 및 / 또는 시험관 내 치료 치료와 비교 될 수 있습니다. 이 방법론에는 세포실 및 플랫폼 구성 요소와 함께 근세포 페이싱에 필요한 필수 요소가 포함됩니다. 이 접근법에 대한 자세한 프로토콜은 원시 데이터 분석뿐만 아니라 비율 측정 지표 Fura-2 AM으로 측정 된 근절 길이 감지 및 셀룰러^{Ca 2+} 과도 현상에 의한 무부하 단축을 측정하는 단계를 통합합니다.

Introduction

심장 펌프 기능의 분석은 특히 심부전(HF)의 동물 모델에서 적절한 통찰력을 얻기 위해 다양한 접근법을 필요로 하는 경우가 많습니다. 심 초음파 또는 혈역학 적 측정은 생체 내 심장 기능 장애¹에 대한 통찰력을 제공하는 반면, 체외 접근법은 종종 기능 장애가 여기 결합 또는 활동 전위와 수축 기능 (예 : 여기 수축 [E-C] 결합)을 담당하는 근필라멘트 및 / 또는^{Ca 2+} 과도 현상의 변화로 인해 발생하는지 여부를 식별하는 데 사용됩니다. 시험관내 접근법은 또한 비용이 많이 들거나 힘든 생체내 치료 전략을 추구^{하기 전에 신경}호르몬, 벡터-유도된 유전적 변형 및 잠재적인 치료제2에 대한 기능적 반응을 스크리닝할 수 있는 기회를 제공한다.

HF ^5,6의 존재 및 부재 하에서 손상되지 않은 근세포에서의 무부하 단축 및^{Ca 2+} 과도 현상뿐만 아니라 손상되지 않은 섬유주³ 또는 투과화 된 근육 세포⁴에서의 힘 측정을 포함하여 시험관 내 수축 기능을 조사하기 위해 여러 접근법을 사용할 수 있습니다. 이러한 각 접근법은 심장 펌프 기능 ^2,7을 직접 담당하는 심장 근육 세포 수축 기능에 중점을 둡니다. 그러나, 수축 및 E-C 결합 둘 다의 분석은 단리된,^Ca2+ 내성 성인 근세포에서 근육 길이 및^Ca2+ 과도 현상의 단축을 측정함으로써 가장 자주 수행된다. 실험실은 이⁸단계를 위해 쥐 심장에서 근세포를 분리하기 위해 상세한 공개된 프로토콜을 활용합니다.

^{Ca 2+} 일시적 및 근섬유 모두 손상되지 않은 근세포의 단축 및 재연장에 기여하며 수축성 기능 장애에 기여할 수 있습니다 ^2,7. 따라서, 이 접근법은 시험관내 기능 분석에 Ca²⁺ 사이클링 기계와 미오필라멘트를 포함하는 온전한 근세포가 필요할 때 권장된다. 예를 들어, 온전한 단리된 근세포는^{유전자 전달9}을 통해 근필라멘트 또는^Ca2+ 순환 기능을 변형시킨 후 수축 기능을 연구하는 데 바람직하다. 또한, 다운스트림 제2 메신저 신호전달 경로의 영향 및/또는 치료제²에 대한 반응을 연구할 때 신경호르몬의 기능적 영향을 분석하기 위해 온전한 근세포 접근법이 제안된다. 단일 근육 세포에서 부하 의존적 힘의 대안적인 측정은 저온 (≤15 ° C)에서 막 투과화 (또는 스키닝) 후에^Ca2+ 과도 기여를 제거하고 근섬유 기능¹⁰에 초점을 맞추기 위해 가장 자주 수행됩니다. 손상되지 않은 근세포에서 부하 의존적 힘과^{Ca 2+} 과도 현상의 측정은 특히 신경 호르몬 신호 전달에 대한 반응을 측정하거나 치료제에 대한 스크린과 같이 더 높은 처리량이 필요한 경우 접근법¹¹의 복잡하고 기술적 인 도전으로 인해 드뭅니다. 심장 섬유주의 분석은 이러한 기술적 문제를 극복하지만 비근세포, 섬유증 및/또는 세포외^{기질 리모델링의} 영향을 받을 수도 있습니다2. 신생아 근세포 및 유도성 만능줄기세포(iPSC)로부터 유래된 근세포는 아직 성체 근필라멘트 단백질의 완전한 보체를 발현하지 못하고 일반적으로 성체 막대형 근세포에 존재하는 근필라멘트 조직의 수준이 부족하기 때문에 상술한 각각의 접근법은 성체 근세포를 함유하는 제제를 필요로^한다2. 현재까지 iPSC의 증거는 성체 이소 형으로의 완전한 전환이 배양^{12에서 134} 일 이상을 초과한다는 것을 나타냅니다.

HF에 대한 이 수집의 초점을 감안할 때, 프로토콜에는 실패한 것과 실패하지 않는 손상되지 않은 온전한 근세포에서 수축 기능을 구별하기 위한 접근 방식과 분석이 포함됩니다. 대표적인 예는 앞서 설명한 신장 상부 축착 후 18-20주 후에 연구된 쥐 근세포로부터 제공된다(^5,13). 그런 다음 가짜 처리 된 쥐의 근육 세포와 비교합니다.

여기에 설명된 프로토콜 및 이미징 플랫폼은 HF 발달 동안 막대 모양의 심장 근세포에서 단축 및^{Ca 2+} 과도 현상의 변화를 분석하고 모니터링하는 데 사용됩니다. 이 분석을 위해, 2 x 10^{4 Ca2+}-내성, 막대-형상의 근세포를 22^mm2 라미닌-코팅된 유리 커버슬립(CSs) 상에 플레이팅하고, 앞서⁸에 기술된 바와 같이 밤새 배양하였다. 이 이미징 플랫폼을 위해 조립된 구성 요소는 최적의 이미징에 사용되는 미디어 및 버퍼와 함께 재료 표에 제공됩니다. 소프트웨어를 사용한 데이터 분석 가이드와 대표 결과도 여기에 제공됩니다. 전체 프로토콜은 별도의 하위 섹션으로 나뉘며, 처음 세 섹션은 분리된 쥐 근세포 및 데이터 분석에 초점을 맞추고 세포 Ca²⁺ 과도 실험 및 근세포에서의 데이터 분석이 이어집니다.

Protocol

설치류에 대해 수행 된 연구는 실험실 동물의 인도적 관리 및 사용에 관한 공중 보건 서비스 정책을 따랐으며 미시간 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다. 이 연구를 위해, 근육 세포는 체중이 200g⁵ 인 3-34 개월 된 Sprague-Dawley 및 F344BN 쥐≥ 분리되었습니다. 남성과 여성 요금이 모두 사용되었습니다.

1. 수축 기능 연구를 위한 근세포 페이싱

1. 분리 된 근육 세포의 각 세트에 대해 신선한 M199 기반 배지를 만듭니다 (재료 표). 페이싱 1일 전에, 플레이트 2 x 10^{4 Ca} 2+-내성, 막대 모양의 근세포를 앞서 설명한 바와 같이 22^mm2 라미닌 코팅 유리 커버슬립(CSS^{) 상에} 8.
2. 챔버를 준비하려면 각 챔버를 10% 표백제에 1시간 동안 담그십시오. 그런 다음 30-45분 동안 흐르는 수돗물로 챔버를 세척한 다음 30분 동안 5분마다 증류수를 교체한 다음 30분 동안 5분마다 탈이온수를 교체하고 탈이온수에서 최종 헹굼합니다.
3. 깨끗한 표면에서 챔버를 20-30분 동안 건조시킵니다(보충 그림 1A-C). 다음으로, UV는 생물안전 캐비닛에서 챔버를 각 방향으로 5분 동안 처리합니다(총 = 20분). 이 단계는 사전 멸균 된 챔버에는 필요하지 않습니다.
   주의 : UV 노출을 최소화하기 위해 해당 지역을 떠나십시오.
4. 챔버에서 덮개를 제거하고 각 웰에 3mL의 M199 기반 배지(재료 표 참조)를 추가하고(보충 그림 1B) 덮개를 교체하고 37°C 인큐베이터에서 5% CO2 및 20%_O2로 챔버를 예열합니다.
5. 250 ° C의 뜨거운 비드 멸균기에서 20-25 초 동안 집게를 소독하십시오. 예열 된 자극 챔버를 인큐베이터에서 생물 안전 캐비닛으로 옮깁니다.
6. 심장 근육 세포가 포함 된 각 커버 슬립 (CS)을 멸균 집게를 사용하여 자극 챔버의 개별 웰로 옮깁니다. CS를 한 번에 4개씩 전사한 후 나머지 4개의 CS를 전사하기 전에 10분 동안 가열하여 매체 온도를 유지합니다.
7. 바나나 잭을 한쪽 끝의 자극 챔버(보충 그림 1C)와 다른 쪽 끝의 자극기(보조 그림 1D)에 부착합니다.
8. 자극기 주파수를 0.2Hz로 설정하고 전압(~12V)을 설정하여 우물 내의 모든 막대 모양의 심장 근육 세포의 ~10%-20%에서 수축을 달성합니다. 수축하는 근육 세포의 수를 결정하려면 챔버를 4x에서 10x 배율의 도립 현미경 아래에 놓습니다.
9. 자극 챔버를 5%_CO2 의 37°C에서 인큐베이터에 놓는다(보충 그림 1E). 37°C, 5% CO2 인큐베이터에서 20-25분 동안 예열된 배지를 사용하여₁₂ 시간마다 배지를 교체합니다. 12시간마다 미디어를 교체한 상태에서 최대 3일 동안 전기 자극을 계속합니다.

2. 성체 쥐 심장 근세포의 수축 기능 분석

1. 실험 전에 37°C 인큐베이터에서 겔 팩과 배지를 30분 동안 예열합니다.
2. 재료 표에 나열되고 보충 그림 2에 표시된 수축 기능 플랫폼 구성 요소를 켜고 진한 빨간색(590nm) 필터가 있는 도립 현미경이 있는 진동 방지 테이블(보충 그림 2A-1)(보충 그림 2A-2,3) 및 CCD 컨트롤러에 연결된 CCD 카메라(보충 그림 2A-4)(보충 그림 2A-5 및 보충 그림 2C-5) 및 PC 컴퓨터와 통합됩니다(보충 그림 2B-14).
3. 연동 펌프에 튜브를 조립합니다(보충 그림 2A-8; 보충 그림 2A-8), 예열된 젤 팩을 튜브 홀더로 옮기고(보충 그림 2A-9), 진공을 켜고(보충 그림 2A-11) 세포 자극기의 전원을 켭니다(보충 그림 2B-13).
4. 매체가 있는 50mL 튜브를 절연 튜브 홀더(보충 그림 2A-9)에 놓고 연동 펌프 튜브를 통해 ~0.5mL/분으로 관류를 시작합니다(보충 그림 2E-8).
5. 소량의 예열된 배지를 소형 계량 보트(~2mL)에 추가합니다. 근육 세포를 포함하는 하나의 CS를 자극 챔버에서 계량 보트로 옮깁니다. 자극 챔버를 5%_CO2 배양기에서 37°C로 되돌린다.
6. 계량 보트에서 CS를 제거하고 밑면을 부드럽게 닦습니다. CS를 새로 그리스를 칠한 CS 챔버(보충 그림 2A, F-10, 검은색 화살표)로 옮기고 CS에 한 방울의 미디어(~200μL)를 부드럽게 추가합니다.
7. CS 위에 백금 전극 마운트를 놓고 (보충 그림 2F, 회색 화살표) 집게를 사용하여 새 CS를 맨 위에 놓습니다. CS 샌드위치 위에 상단 마운트(보충 그림 2F, 흰색 화살표)를 놓은 다음 2개 또는 4개의 #0 팬 헤드 나사를 설치하여 챔버 조립을 완료합니다.
8. 펌프 튜브 전체에 매체가 있으면 튜브를 예열기에 부착한 다음 예열기를 단계 2.7에서 조립된 CS 챔버에 연결합니다. 0.5mL/분으로 관류를 시작하고 챔버 아래에 티슈 와이프를 놓아 누출이 없는지 확인합니다.
9. CS 챔버를 스테이지 어댑터에 놓습니다. 관류 매체는 진공 시스템에 연결된 튜브로 챔버의 반대쪽 끝에 수집됩니다. 가열 시스템(보충 그림 2A, D-7)을 켜고 챔버, 대물렌즈 및 예열기를 ~5-10분 동안 평형화하여 37°C의 일정한 매체 온도를 달성합니다. 이 평형 시간 동안 현미경에서 40x 물 침지 대물렌즈로 근세포를 시각화합니다.
10. 막대 모양의 세포의 80%가 수축하는 데 필요한 설정(일반적으로 35-40V)의 1.5배로 전압을 설정하여 페이싱 자극기(보충 그림 2B-13)를 활성화합니다. 자극 주파수를 0.2Hz로 설정하여 수축 기능과 근세포 생존을 최적화합니다.
11. 지속적으로 관류되고 진행되는 근육 세포에서 수축성 단축 및 재 연장 흔적을 수집합니다. 단축 측정값을 수집하려면 CCD 컨트롤러(보충 그림 2B-5,C)와 I/O 컨트롤러 보드가 있는 전용 컴퓨터(보충 그림 2B-14, 재료 표 참조)에 연결된 CCD 카메라(보충 그림 2A-4)를 사용하십시오. 이 플랫폼은 쥐 근세포에서 육종 단축을 측정하지만, 유사한 결과가 근세포의 세로 가장자리에서 수집 된 근세포 측정에서 얻어진다 (Ecklerle et ^al.14 참조).
12. 근절 단축 추적을 수집하려면 컴퓨터에서 소프트웨어를 열고 확인을 선택한 다음 파일 > 새로 만들기를 선택합니다. [추적> Sarcomere 길이> 사용자 제한 편집 ]을 선택한 다음 일반적으로 2.0μm에서 1.5μm 사이의 최대값과 최소값을 설정하여 화면 템플릿을 준비합니다. 근세포에서 측정하기 전에 0.01mm 격자선으로 CCD 카메라를 보정합니다(그림 1D).
13. 근절 길이 추적을 기록하려면 파일 > 새로 만들기를 선택합니다. 수축하는 근세포를 식별하고 줄무늬 패턴이 수직이 되도록 카메라의 세로 축을 따라 근세포를 배치합니다(그림 1B).
14. 컴퓨터 마우스를 사용하여 관심 영역(ROI) 상자(분홍색 상자)를 근세포 위에 놓습니다(그림 1C). 수집 및 시작을 선택하여 수축 기능을 기록합니다. 낮은 자극 주파수 (≤0.5Hz)에서 각 근육 세포에서 60 초 동안 단축을 기록합니다.
15. CS당 5-10개 세포에서 근절 단축을 기록합니다. 연구에 작용제/길항제 치료가 포함된 경우 1 cell/CS에서 측정을 수행합니다. 별도의 예열된 매체와 다중 채널 연동 펌프에 로드된 다른 전용 관류 튜브를 준비하고 2.9.-2.14단계를 따릅니다. 근육 세포 수축 기능에 대한 약물 또는 신경 호르몬 전달의 영향을 측정합니다.
16. 주파수 범위에 걸친 단축을 측정하려면 각 주파수에서 근육 세포의 페이스를 측정하여 기록 전에 정상 상태 단축을 얻습니다⁵. 이러한 연구의 경우 관류 속도를 두 배로 늘리고 새로운 주파수에서 자극 후 15-20초 기록을 시작하여 0.2Hz 및 2Hz 범위의 주파수에 대해 일관된 정상 상태 수축 반응을 얻습니다. 일반적으로 주어진 자극 주파수 범위에서 단축을 위해 2개 이하의 근세포/CS를 기록합니다.
17. 기록을 분석할 때 신뢰할 수 있는 신호 평균 데이터를 얻기 위해 최소 7개의 수축/셀을 기록합니다(3단계 참조).

3. 분리된 근육세포의 수축 기능에 대한 데이터 분석

1. 시작하려면 파일을 선택하고 기록된 추적을 선택한 다음 열기를 선택합니다. 기본 추적의 탭 1 (왼쪽)을 선택한 다음 추적 맨 위에 있는 노란색 패널을 Sarc-Length로 설정합니다. 추적 및 2.12단계에서 준비한 화면 템플릿을 선택합니다.
2. 해석 템플릿을 준비하려면 t0의 정의 상자에서 작업, 단조 과도 해석 옵션, TTL 이벤트 마크 를 선택하고 메뉴에서 기준선(정지 근절 길이), t0에 대한 출발 속도(dep v), 피크(피크 높이 및 %피크 높이/기준선 또는 bl%피크 h), tPeak에 대한 반환 속도(ret v), t0를 사용하면 피크까지 50%(TTP 50_%), tPeak를 사용하여 기준 50%(TTR_50%)까지 걸리는 시간입니다. 템플릿 > 식별자 와 함께 분석 템플릿 저장을 선택하여 이러한 분석 옵션을 저장합니다. 각 추적을 분석하기 전에 이 분석 템플릿을 로드합니다.
3. 데이터 분석을 시작하려면 분석 범위에서 > 게이트 마크> 과도 상태 추가 > 변환을 선택합니다> 이제 0.2Hz에서 진행되는 근육 세포에 대해 -0.01 초에서 1.20 초까지의 시간 범위를 설정하십시오 (그림 2A, 원시 흔적의 하단 부분에 빨간색 표시). 더 높은 주파수에서 자극되는 근육 세포에 대해 더 짧은 시간 범위를 선택하십시오.
4. 작업 > 평균 이벤트를 선택하여 신호 평균 추적을 생성합니다. 신호 평균 기록이 원래 기본 트레이스 아래에 나타납니다.
5. 신호 평균 추적의 탭 1(화면 왼쪽)을 선택한 다음 위쪽 메뉴에서 표시를 선택한 다음 과도 추가를 선택합니다. 상단 메뉴 및 단조 과도 분석에서 연산을 선택하여 신호 평균 디스플레이 패널에 기준선 육종 길이, 피크 높이, bl%피크 h, dep v, ret v, TTP 50% 및 TTR_50%에 대한 신호 평균 값을 표시합니다.
6. 각 근절 과도 분석을 스프레드시트로 전송하여 여러 근세포의 복합 분석을 위해 [ > 단조 과도 분석 > 클립보드 전류] 내보내기를 선택합니다. 이 데이터를 각 추적의 스프레드시트에 붙여넣습니다.
7. 신호 평균 트레이스를 복사하려면 > 현재 트레이스 > 클립보드 > 옵션 내보내기 를 선택하고 소수 자릿수를 5로 설정한 다음 탭 구분 기호를 선택하고 확인을 클릭하고 확인을 클릭합니다. 각 근세포 기록에 대한 신호 평균 트레이스를 두 번째 스프레드시트에 붙여넣습니다.

4. 쥐 성인 심장 근육 세포에서 Ca²⁺ 과도 현상 기록

1. Ca 2+ 과도 상태를 측정하기 전에 추가 형광 이미징 구성 요소와 함께 단계 2.2에 설명된 플랫폼 구성 요소를 켭니다(재료 표의^{Ca 2+} 이미징 분석을 위한 추가 구성 요소 참조; 보충 그림 2A-5,6; 2B-12).
2. 디메틸설폭사이드(DMSO)에 1mM Fura-2AM과 0.5M 프로베네시드를 포함하는 Fura-2AM 스톡 용액을 준비합니다. 프로베네시드는 Fura-2AM 누출을 최소화합니다¹⁵.
3. 스톡 용액을 6-웰 플레이트의 한 웰에서 2.5mL의 배지( 재료 표 참조)에 5μM Fura-2AM 및 2.5mM 프로베네시드로 희석합니다. 플레이트의 추가 웰 3개에 2.5mL 배지(Fura-2AM 없음)를 추가하고 플레이트를 알루미늄 호일로 덮고 배지를 37°C로 예열합니다.
4. Cs 함유 근세포를 페이싱 챔버로부터 Fura-2AM을 함유하는 웰로 옮기고, 덮개를 덮고, 플레이트를 4분 동안 5%_CO2 를 갖는 37°C 인큐베이터로 되돌린다. 관류 펌프에 튜브를 장착하고 2.4단계에 설명된 대로 Fura-2AM 로딩 기간 동안 매체로 관류합니다.
5. 형광 광퇴색을 줄이고 형광 신호를 최적화하기 위해 실내 조명을 끄거나 최소화합니다. 인큐베이터로부터 6-웰 플레이트를 제거하고, 이어서 배지 단독을 함유하는 3개의 웰 각각에서 CS를 10초 동안 세척한다. CS를 예열된 매체가 들어 있는 소형 계량 보트로 옮깁니다(Fura-2AM이 추가되지 않음).
6. CS의 밑면을 부드럽게 닦은 후 새로 그리스를 칠한 CS 챔버에 CS를 장착합니다. CS에 미디어 한 방울을 부드럽게 추가한 다음 전극 마운트를 CS 위에 조립한 다음 두 번째 CS와 상단 마운트를 조립합니다. #0 팬 헤드 나사를 사용하여 2.6.-2.7단계에 설명된 대로 셀 챔버 조립을 완료합니다.
7. 매체로 채워진 펌프 튜브를 예열기에 연결하고 예열기를 CS 챔버에 연결하고 2.8단계에 설명된 대로 스테이지 어댑터에 넣습니다. 진공 튜브 시스템으로 매체를 수집하고 가열 시스템(보충 그림 2A,D-7)을 켜서 37단계-2.8.9단계에 설명된 대로 챔버를 37°C로 평형을 이룹니다.
8. 2.10단계에 설명된 대로 35-40V 및 0.2Hz로 설정된 페이싱 자극기(보충 그림 13B-2.10)를 활성화합니다.
9. Ca²⁺ 과도 상태를 기록하기 전에 컴퓨터 키보드 근처에 장착된 작은 손전등이나 북라이트를 켜서 키보드를 볼 수 있도록 하십시오. 또한 심장 근육 세포가없는 영역에서 형광 배경을 기록하십시오. 시작하려면 2.12단계에서 설명한 대로 파일 > 새로 시작 > 선택합니다.
10. ROI를 선택하고 원시 분자에 대해 하나의 탭(또는 왼쪽의 추적 막대)을 설정하고 원시 분모에 대해 두 번째 탭을 각 탭의 상단 중앙에 정의합니다. 10-20 초 동안 배경을 기록하십시오. 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 하나의 트레이스 바 패널 위로 드래그하여 원시 신호 평균 분자 및 분모 값을 얻습니다. 연산 > 상수를 선택하여 이러한 값을 입력하고 원시 값을 입력합니다.
11. 쇼트닝 및 Ca²⁺ 과도 현상을 모두 수집하기 위해 새 화면 템플릿을 준비합니다. 근절 길이의 경우 탭 1 을 선택하고 2.13단계에서 설명한 것과 동일한 프로세스를 사용합니다. Ca²⁺ 이미징의 경우 탭 2 > 비율(탭 의 상단 중앙) > 추적 > 사용자 제한 편집을 선택하여 비율의 최소 및 최대 수준(일반적으로 1에서 5 사이로 설정됨)을 설정합니다. 동일한 프로세스를 사용하여 탭 3과 4(왼쪽)의 분자 및 분모 범위를 정의합니다.
12. 단계 2.14에 설명된 대로 근세포 이미지 위에 ROI 상자를 배치합니다. 파일 > 새 > 수집을 선택합니다. 이제 시작을 선택하여 단축 및 비율계량 Ca²⁺ 데이터를 수집합니다. 신호 평균 분석을 위해 셀당 ≥7 수축을 기록합니다.
13. 4.10단계에서 설명한 백그라운드 추적 기록을 반복합니다. 2-4 개의 근육 세포를 기록한 후. 일반적으로 배경 판독값에 상당한 변화가 있는 경우 4-5개의 근세포/CS 또는 더 적은 근세포를 기록합니다.

5. 분리된 근세포에서 Ca²⁺ 과도 현상의 데이터 분석.

1. 분석을 위해 원하는 파일을 열고 단축을 위한 템플릿 > 화면 템플릿 과 Ca²⁺ 과도 현상을 선택합니다. 그런 다음 탭 1과 2 (왼쪽)를 선택하여 각각 근절 길이와 Ca^{2 +} 비율을 표시합니다. 연산 > 상수를 선택하고 Ca²⁺ 백그라운드 추적에서 분자 및 분모 값을 입력합니다.
2. 단축과 Ca²⁺ 과도 데이터를 위한 분석 템플릿을 준비합니다. 탭 1(왼쪽)을 선택하고 3.2단계에서 설명한 것과 동일한 프로세스를 사용합니다. 을 클릭하여 근절 길이 분석 템플릿을 설정합니다.
3. 탭 2(왼쪽)를 선택하고 t0의 정의 상자에서 작업, 단조 과도 해석 옵션, TTL 이벤트 표시를 선택하고 메뉴에서 기준선(기초 비율), t0에 대한 출발 속도(dep v), 피크(피크 높이 및 %피크 높이/기준선 또는 bl%피크 h), tPeak에 대한 감쇠 속도(ret v), t0를 사용하면 피크까지 50%(TTP 50_%), tPeak를 사용하여 기준 50%(TTR_50%)까지 걸리는 시간입니다. 템플릿을 선택하여 이러한 분석 옵션을 저장하고 새 식별자 이름을 사용하여 분석 템플릿 저장을 선택합니다. 각 추적을 분석하기 전에 이 분석 템플릿을 로드합니다.
4. 3.3.-3.6단계에서 설명한 것과 동일한 프로세스를 사용합니다. 신호를 평균화 한 다음 근절 길이를 분석 한 다음 Ca²⁺ 과도 상태에 대해 동일한 단계를 수행합니다. 근절 길이와 Ca²⁺ 과도 비율 추적에 대해 별도의 표시를 설정합니다.

Results

수축 기능 연구는 격리 다음날(2일차)부터 격리 후 최대 4일까지 쥐 근세포에 대해 수행됩니다. 근육 세포는 분리 다음 날 (즉, 2 일째)에 기록 될 수 있지만, 수축 기능을 수정하기 위해 유전자 전달 또는 치료 후 더 긴 배양 시간이 종종 필요합니다⁸. 분리 후 18시간 이상 배양된 근세포의 경우, 섹션 1에 설명된 페이싱 프로토콜은 t-세뇨관과 일관된 단축 및 재연장 결과를 유지하는 데 도움이 됩니다.

단축 연구를 위한 근세포를 포함하는 CS의 대표적인 부분이 ROI를 설정하기 전에 적절하게 배치된 근세포와 함께 도 1A에 도시되어 있다(도 1B). ROI가 식별되면(그림 1C, 분홍색 상자), 근세포 아래에 표시된 알고리즘 정보도 기록 전에 근세포 위치를 최적화하는 데 도...

Discussion

1단계에 설명된 만성 페이싱 프로토콜은 분리된 근세포를 연구하고 더 긴 치료의 영향을 평가하는 데 유용한 시간을 연장합니다. 우리 실험실에서는 만성적으로 진행되는 근육 세포에서 근절 길이를 사용하여 수축 기능을 측정 할 때 격리 후 최대 4 일까지 일관된 결과를 얻었습니다. 그러나 근세포 수축 기능은 근세포의 속도를 조절하기 위해 1주일 이상 된 배지를 사용할 때 빠르게 악화됩니다.

수축 기능 연구를 위해, 데이터는 쥐의 체온에 가까운 37 ° C에서 수집됩니다. 근세포 생존력을 최적화하고 각 근세포에 대해 일관된 흔적을 얻기 위해 이러한 실험은 쥐의 생리적 심박수 ~5Hz보다 낮은 페이싱 주파수에서 수행됩니다. 이러한 설정은 일관된 수축 기능 데이터를 생성하지만, 단축 트레이스가 동일한 근세포 치료 그룹을 포함하는 여러 CS에서 일관되게 유지되는 경우 챔버 온도 및/또는 페이싱 빈도를 조정할 수 있습니다. 또한, 결점이없고, CS에 완전히 부착되고, 막대 모양의 세포의 양쪽 끝...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
MEDIA
소 혈청 알부민	Sigma (Roche)	3117057001	최종 농도 = 0.2% (w/v)
Glutathione	Sigma	G-6529	최종 농도 = 10 mM
HEPES	Sigma	H-7006	최종 농도 = 15 mM
M199	Sigma	M-2520	1 병은 1 L를 만듭니다. 7.45
NaHCO3	Sigma	S-8875	최종 농도 = 4 mM
페니실린/스트렙토마이신	Fisher	15140122	최종 농도 = 100 U/mL 페니실린, 100 μ g/mL 스트렙토마이신
<강한>Ca2+ 이미징
디메틸설폭시드 (DMSO)	약	D2650
Fura-2AM	Invitrogen (분자 프로브)	F1221	50 μ g/바이알;   DMSO에서 1 mM Fura-2AM + 0.5 M 프로프로브 니시드의 원액을 준비합니다.   미디어의 최종 Fura2-AM 농도는  5 &뮤; M
프로베니시드	인비트로겐(피셔)	P36400	1mM Fura-2AM 스톡에 7.2mg 프로베니시드(0.5M)를 추가합니다. 매체의 최종 농도는 2.5 mM
MATERIALS FOR RAT MYOCYTE PACING
#1 22  mm2 유리 커버슬립	Corning	2845-22
바나나 잭이 있는 3 x 36인치 케이블	Pomona Electronics	B-36-2	보충 그림 1, 패널 C
37oC 인큐베이터  95 % O2:5% CO2	Forma	3110	보충 그림 1, 패널 E.  다양한 모델이 적합합니다
Class II A/B3 Biosafety 캐비닛과 UV 램프	Forma	1286	여러 모델이 적합합니다
포셉스 - Dumont #5 5/45	Fine Science Tools	11251-35
핫 비드 살균기	Fine Science Tools	1800-45
저배율 반전 현미경	Leica	DM-IL	이 현미경을 인큐베이터 옆에 배치하여 페이싱 시작 시 및 배지 변경 후 페이싱된 근세포의 수축을 모니터링합니다.   4X 및 10X 대물렌즈 권장
페이싱 챔버	맞춤형		보충 그림 1, 패널 A. Ionoptix C-pace 시스템은 상업적으로 이용 가능한 대안이거나 22
Stimulator	Ionoptix	Myopacer	Supplemental Figure 1, panel D를 참조하십시오.
MATERIALS FOR CONTRACTILE FUNCTION 및/또는 Ca2+ IMAGING ANALYSIS			ID (보충 그림 2 & 대안/권장 옵션
추가 구성 요소: Ca2+ 이미징 분석	Ionoptix	필수 시스템 구성 요소: -- 광자 계수 시스템                      -->nbsp; 이중 여기 광원이 있는 크세논 전원 공급 장치                      -->nbsp; 형광 인터페이스	- 광자 계수 시스템에는 광전자 증배관(PMT) 튜브와 이색성 미러가 포함되어 있으며 CCD 카메라에 인접하여 설치됩니다. (패널 A # 4).                                                                                                                                          - 크세논 전구 광원의 전원 공급 장치(패널 A #5 및 패널 C, 왼쪽 참조)는 패널 A #6에 표시된 이중 여기 인터페이스(340/380nm  여기 및 510nm 방출)와 통합되어 있습니다.                                                                                                                                                                                                                                                               - 컴퓨터와   사이의 형광 인터페이스; 광원은 패널 B, #12에 표시되어 있습니다.
이미지 획득 기능이 있는 CCD 카메라  하드웨어 및 소프트웨어(240프레임/초)	Ionoptix	CCD 컨트롤러가 있는 Myocam	Myocam 및 CCD 컨트롤러는 각각 보충 그림 2, 패널 A #4  및   패널 A #5 및 패널 C #5(오른쪽)에 나와 있습니다. 컨트롤러는 PC 컴퓨터 시스템(패널 B #14)과 통합됩니다.
챔버 자극기	Ionoptix	Myopacer	패널 B, #13; 대안:  잔디 모델 S48
커버슬립 장착 관류 챔버	22 mm2 커버슬립용 맞춤형 챔버와 실리콘 어댑터와 2-4 필립스 팬헤드 #0 나사  (화살표, 패널 F)		패널 A #10 & 패널 F;     챔버 온도는 TH-10Km 프로브와 TC>2BIP 온도 컨트롤러(온도 컨트롤러 참조)를 사용하여 37C로 보정됩니다. 상업적 대안:  Ionoptix FHD 또는 C-stim cell  챔버; Cell MicroControls 배양 자극 시스템
기능 / Ca2 + 과도 현상의 데이터 수집 및 분석을위한 전용 컴퓨터 및 소프트웨어	Ionwizard PC 보드 및 소프트웨어	Ionoptix	; 수축 함수는 IonWizard 소프트웨어의 SarcLen(sarcomere length) 또는 SoftEdge(myocyte length) 수집 모듈을 사용하여 측정됩니다. Ionwizard 소프트웨어에는 비율계량용 PMT 수집 소프트웨어도 포함되어 있습니다. < Fura-2AM에서 로딩된 myoyctes.sup>2+ 이미징 - somputer와 cell stimulator를 수용하기 위해 4 포스트 전자 랙 마운트 캐비닛과 선반이 권장됩니다. Ca2+ 이미징을 위한 형광 인터페이스도 이 캐비닛에 포함되어 있습니다(아래 참조).
집게 - Dumont #5 TI	Fine Science Tools	11252-40	Panel F
미디어용 절연 튜브 홀더	맞춤형		패널 A #9; 이 홀더는 스티로폼을 사용하여 쉽게 조립할 수 있습니다. 매체를 따뜻하게 유지하기 위한 예열된 젤 팩
거꾸로 된 명시야 현미경	Nikon	TE-2000S	Ca2+ 이미징을 위한 에피 형광용 회전 포탑(패널 A #2)을 설치합니다.    또한 Ca2+ 이미징 중 형광 표백을 최소화하기 위해 짙은 적색(590nm) 콘덴서 필터를 사용하는 것이 좋습니다.
아이솔레이터 테이블	TMC 진동 제어	30 x 36인치	패널 A, #1; 바람직한:  높은 선반, 패러데이 차폐
현미경 접안경 및 대물	Nikon	10X CFI 접안렌즈 40X 물 CFI Plan Fluor 대물렌즈	패널 A #3; 40X 대물렌즈:  n.a. 0.08; w.d. 2mm.  Cell MicroControls HLS-1 대물렌즈 히터는 대물렌즈 주위에 장착됩니다(아래 온도 컨트롤러 참조).                  참고:  이제 수성 대물렌즈에도 Water Immersion Dispenser를 사용할 수 있습니다.
연동 펌프	Gilson	Minipuls 3	Panel A #8 및 Panel E
소형 중량 보트	Fisher	08-732-112
온도 컨트롤러	Cell MicroControls	TC2BIP	Panel A #7; 패널 D. 이 온도 컨트롤러는 커버슬립 챔버를 37oC.      이 플랫폼에는 예열기와 대물 히터가 권장됩니다.  A Cell MicroControls HPRE2 예열기와  HLS-1 대물 히터는 제어됩니다  연구를 위해 TC2BIP 온도 조절기를 사용합니다.
모션 센서가 있는 캐비닛 아래 LED 조명	Sylvania	#72423 LED 라이트	최소한의 방 조명에서 Ca2+ 일시적인 이미징 중 데이터 수집에 권장됩니다..   대안:  유연한 목이 있는 손전등/책 조명의 클립 - 여러 공급업체를 사용할 수 있습니다.
인라인 Ehrlenmeyer 플라스크 및 보호 필터	Fisher	Tygon 튜빙이 있는 진공 라인 - E363;   폴리 프로필렌 Ehrlenmeyer 플라스크 - 10-182-50B; 진공필터 - 09-703-90	Panel A #11