마우스에서 리소포스파티딜콜린-유도된 초점 탈수초화 모델의 안정적으로 확립된 투포인트 주사

요약

본 프로토콜은 마우스에서 안정하고 재현가능한 탈수초화 모델을 생성하기 위해 입체택시 프레임을 통해 리소포스파티딜콜린의 두 점 주사를 기술한다.

초록

수용체-매개 lysophospholipid 신호전달은 다양한 신경 질환, 특히 다발성 경화증 (MS)의 병태생리학에 기여한다. 리소포스파티딜콜린(LPC)은 염증과 관련된 내인성 리소포스포지질이며, 미엘린 지질에 대한 독성으로 빠른 손상을 유도하여 초점 탈수초화를 유도할 수 있다. 여기에서, 심각한 탈수초화를 직접적으로 야기하고 외과적 절차에 의해 마우스에서 실험적 탈수초화 손상을 신속하고 안정적으로 복제할 수 있는 입체 전술 이점 LPC 주사에 대한 상세한 프로토콜이 제시된다. 따라서, 이 모델은 탈수초화 질환, 특히 MS와 매우 관련이 있으며, 임상적으로 관련된 연구를 진행시키는 데 기여할 수 있다. 또한, LPC를 주입한 마우스의 코퍼스 캘로섬에서 탈수초화의 시간 과정을 묘사하기 위해 면역형광 및 룩솔 패스트 블루 염색 방법을 사용하였다. 또한, 행동 방법은 모델링 후 마우스의 인지 기능을 평가하기 위해 사용되었다. 전반적으로, 입체택시 프레임을 통한 리소포스파티딜콜린의 두 점 주사는 추가 연구를 위해 마우스에서 탈수초화 모델을 생성하는 안정하고 재현가능한 방법이다.

서론

수용체-매개 lysophospholipid 신호전달은 거의 모든 장기 시스템의 다양한 생리학적 과정을 수반한다¹. 중추 신경계 (CNS)에서,이 신호 전달은 다발성 경화증 (MS)과 같은자가 면역 신경 질환의 병원성에 중요한 역할을합니다. 다발성 경화증은 병리학적 탈수초화 및 염증 반응을 특징으로 하는 만성 면역 매개 장애로, 신경학적 기능 장애 및 인지 장애를 일으킨다^2,3. 초기 질병 동안 지속적인 재발 및 재발 후, 대부분의 환자는 결국 이차적 인 진행성 단계로 진행하여 뇌에 돌이킬 수없는 손상을 입히고 이로 인한 장애를 일으킬 수 있습니다⁴. 이차-진행성 과정의 병리학적 특징은 염증성 병변에 의한 탈수초성 플라크⁵라고 여겨진다. MS에 대한 기존의 치료법은 재발의 위험을 상당히 줄일 수 있습니다. 그러나, 진행성 MS⁶에 의해 야기된 장기간의 탈수초성 손상에 대한 효과적인 치료법은 여전히 없다. 따라서, 백질 변성에 초점을 맞춘 전임상 치료제를 연구하기 위해서는 안정하게 확립되고 쉽게 재현 가능한 모델이 요구된다.

탈수초화와 수초화는 다발성 경화증 발병의 두 가지 주요 병리학 적 과정입니다. 탈수초화는 전염증성 표현형⁷을 가진 미세아교세포에 의해 유도되는 축삭돌기 주위의 미엘린 외피의 손실이며, 이는 신경 충동의 느린 전도를 유도하고 뉴런 및 신경 장애의 손실을 초래한다. Remyelination은 희소 돌기 세포에 의해 매개되는 내인성 복구 반응으로, 장애는 신경 퇴행 및인지 장애로 이어질 수 있습니다⁸. 염증 반응은 전체 과정에 결정적이며, 미엘린 손상과 복구의 정도에 모두 영향을 미칩니다.

따라서, 지속성 염증성 탈수초화의 안정한 동물 모델은 MS에 대한 치료 전략의 추가 탐구에 의미가 있다. MS의 복잡성으로 인해, 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE), 독성-탈수초성 모델, 큐프리존(CPZ), 및 리소포스파티딜콜린(LPC)9을 포함하는 생체 내에서 탈수초성 병변을 모방하기 위한 다양한 유형의 동물 모델이 확립되었다⁹ . LPC는 염증과 관련된 내인성 lysophospholipid이며, 미엘린 지질에 대한 독성으로 빠른 손상을 유도하여 초점 탈수초화를 유발할 수 있습니다. 이전 보고서 및 연구^10,11에 기초하여^, 일부 수정과 함께 두 점 주입의 상세한 프로토콜이 제공된다. 일반적으로, 고전적인 원포인트 LPC 주사 모델은 주사 부위에서 국소 탈수초화만을 생성하며 종종 자발적 수초화^12,13을 동반한다. 그러나, 이점 주사 LPC 모델은 LPC가 마우스 코퍼스 캘로섬에서 탈수초화를 직접 유도할 수 있고 미엘린 재생이 거의 없는 더 내구성 있는 탈수초화를 야기할 수 있음을 입증할 수 있다.

프로토콜

모든 동물 절차는 중국 Huazhong 과학 기술 대학 Tongji Medical College의 동물 관리위원회 연구소의 승인을 받았습니다. 성인 C57BL/6 수컷 및 암컷 마우스(야생형, WT; 20-25 g; 8-10주령)를 본 연구에 사용하였다. 마우스를 상업적 공급원으로부터 수득하였다( 물질의 표 참조). 마우스는 특정 병원체가 없는 (SPF) 동물 시설에 수용되었고, 물과 식량이 공급된 광고 리비툼을 가졌다. 22°C 온도 및 55%-60%의 상대 습도의 표준 조건에서 빛과 어둠 사이클의 교대로 12시간 주기로 유지하였다.

1. LPC 용액 준비

1. LPC 분말 25mg( 물자표 참조)을 250μL의 클로로포름과 메탄올 혼합용액(1:1)에 녹여 10% LPC 용액을 만들고 이를 500μL 원심분리 튜브로 옮긴다.
   참고 : LPC가 완전히 용해되지 않은 경우 원심 분리 튜브를 초음파 세척기에 넣고 40kHz의 초음파 처리수를 ~ 1 시간 동안 배치하여 균일 한 솔루션을 얻으십시오.
2. 용액을 3 μL/튜브로 나누고 -80°C에서 보관하십시오.
   참고 : 솔루션은 ~ 2 년 동안 저장할 수 있습니다.
3. 수술 전에, 0.9% NaCl 용액 중 27 μL로 용액을 희석하고(단계 1.2.) 용액을 37°C의 항온 수조에 보관한다.
   참고 : 주사를 시작하기 직전에 용액을 준비하십시오.

2. 외과 적 준비

1. 32 G, 2 바늘을 사용하여 5 μL 주사기에 연결 한다(재료 표 참조). 마이크로리터 주사기가 막히지 않았는지 확인하십시오. 주사제의 제조를 위해 LPC 용액 5 μL를 인출한다.
2. 마우스를 약 0.3 L/min의 속도로 100% 산소와 혼합된 3% 이소플루란이 있는 이소플루란 기화기에 연결된 유도 챔버에서 마취시킨다.
3. 호흡이 원활하는 동안 발가락 꼬집음 반사의 부족으로 마취의 깊이를 확인하십시오.
4. 전기 면도기를 사용하여 마우스 머리를 귀 사이에 면도하십시오. 시술 중 각막 건조를 방지하기 위해 윤활 점안액을 바르십시오.
5. 그런 다음 마우스를 등쪽을 위로 향하게하여 입체 택시 프레임 ( 재료 표 참조)에 놓고 코 콘과 치아 클램프로 머리를 고정하십시오. 코를 통해 1.2 % -1.6 % 이소 플루란으로 마취를 유지하십시오.
   참고: 이소플루란 농도는 마우스의 호흡 상태에 따라 조절될 수 있다.

3. 수술 절차

참고 : 동물은 모든 절차 중에 가열 패드에 배치됩니다.

1. 마우스를 양측 귀 막대가있는 입체 택시 장치에 고정시킵니다. 이어 바가 수평이고 머리가 수평이고 안정적인지 확인하십시오.
2. 요오도포어로 여러 번 닦은 다음 원형 운동으로 알코올을 닦아 머리의 피부를 소독하십시오. 그런 다음 메스를 사용하여 두피의 중간 선을 따라 약 1.5cm의 작은 절개를 잘라 두개골을 노출시킵니다.
3. 브레그마, 람다 및 후부 폰타넬이 노출 될 때까지 1 % 과산화수소에 담근 면봉으로 두개골을 닦으십시오. 주사기를 입체 택시 장치에 놓습니다.
   참고: 과산화수소를 조심스럽게 사용하고 주변 조직에 닿지 않도록 하십시오.
4. 동물의 머리 (앞면과 뒷면, 왼쪽 및 오른쪽 모두)의 수평 위치를 확인하십시오.
   1. 입체 택시 프레임의 Z 축 손잡이를 조정하여 바늘 팁과 두개골이 구부러지지 않고 만지도록 한 다음 Z 축 좌표를 측정하십시오. 브레그마와 후부 폰타넬의 Z 좌표를 확인하십시오.
   2. 브레그마와 후부 폰타넬의 Z 좌표 간의 차이가 0.02mm를 넘지 않도록 이어 바를 조정하십시오. 그런 다음 동일한 방법을 따라 미드 라인의 왼쪽 및 오른쪽에있는 해당 위치의 Z 좌표를 측정합니다. 이어 바를 조정하여 왼쪽과 오른쪽이 같은 레벨에 있도록 합니다.
5. 코퍼스 캘로섬을 찾습니다. XYZ 원점을 브레그마로 설정합니다.
   참고: 첫 번째 주입 부위는 브레그마에 측면 1.0mm, 깊이 2.4mm, 전방 1.1mm입니다. 두 번째 주사 부위는 브레그마에 대해 측면 1.0mm, 깊이 2.1mm, 전방 0.6mm이다. 예를 들어, 브레그마의 좌표는 (0,0,0)입니다. (-1, 1.1, X) 및 (-1, 0.6, Y)로 표시된 해당 위치의 Z 좌표를 측정합니다. 캘로섬의 제1 주사 부위 좌표는 (-1, 1.1, -[X + 2.4])이고, 제2 주사 부위는 (-1, 0.6, -[Y + 2.1])이다.
6. 주사 부위가 결정되면 두개골에 멸균 마커가있는 표시를하고 좌표를 기록하십시오.
7. 두개골 드릴로 표시된 부위를 부드럽게 천공 하십시오 (재료 표 참조). 출혈을 피하기 위해주의하십시오.
8. 바늘을 주어진 좌표로 천천히 움직이고 주사를 시작하십시오. 코퍼스 캘로섬 탈수초화를 유도하기 위해, LPC 용액 2 μL를 각 주사 부위(단계 3.5.)에 0.4 μL/분의 속도로 주입한다(단계 1.).
9. 주사 후, 추가 10 분 동안 각 부위에 바늘을 보관하십시오.
   참고 : 두 번의 주사 간격이 20 분을 넘지 않도록하십시오.
10. 4-0 봉합사로 피부를 봉합하고 동물이 10 분 이내에 깨어날 때까지 기다리십시오. 제도적 동물 관리 규정에 따라 수술 후 진통제를 투여하십시오.
    참고: 안락사에 권장되는 시간은 실험 목적에 따라 결정될 수 있습니다.

4. 초점 탈수초화를 위한 샘플 추출

참고: 이 단계에 대한 자세한 내용은 이전에 게시된 보고서¹⁴를 참조하십시오.

1. 중성 적색 염료( 표 표 참조)를 인산완충식염수(PBS)에 1% 용액에 용해시킨다.
2. 마우스를 희생시키기 몇 시간 전(자세한 내용은 이전 참조¹⁰ 참조), 각 마우스에 복강내 주사에 의해 PBS에 1% 중성 적색 염료 500 μL를 주입한다.
3. 4°C에서 예냉된 0.1% PBS 30 mL로 심장 관류¹² 를 수행한다.
4. 뇌 곰팡이가있는 뇌를 1mm로 슬라이스 하십시오 (재료 표 참조).
5. 현미경으로 중성 적색으로 염색 된 병변을 시각화하고 병변을 해리시킵니다.
   참고: 후속 분석의 정확도를 높이기 위해 가능한 한 많은 주변 정상 조직을 제거하십시오. 병변 조직은 RT-PCR, 전자 현미경 검사 및 웨스턴 블롯 분석으로 검사 할 수 있습니다.

5. 조직학적 염색 및 면역형광

1. 조직학적 염색 및 면역형광 12를 위해, 심장 관류 후(단계 4.3.), 뇌(¹⁰)를 제거하고, 하룻밤(4°C에서) 4% PFA에 고정하고,³⁰% 수크로스에서 완전히 탈수시켰다.
2. 항온(-20°C)에서 냉동 슬라이서(10)를 사용하여^20mm 관상 동맥 뇌 절편으로 절단한다.
3. 룩솔 패스트 블루(LFB) 염색, 면역형광 및 웨스턴 블롯¹⁰을 위해 슬라이스를 사용한다.

결과

LPC의 두 점 주입은 더 내구성있는 탈수초화를 가져 왔습니다.
LPC는 주로 미엘린에 대한 독성과 축삭 완전성¹⁵의 절단으로 인한 급격한 손상을 초래한다. 주사 날은 0일째로 간주하였다. 마우스를 10-28일 동안 유지하였다(10 dpi 및 28 dpi). 룩솔 패스트 블루(LFB) 염색¹⁰을 사용하여 이들 시점에서 마우스에서 탈수초화 면적을 평가하였다. 두 점 주입 모델에서, 가짜 그룹에 비해 10dpi에서 상당한 탈수초화가 있었으며, LPC의 국소 주사가 코퍼스 캘로섬을 성공적으로 탈수초시킬 수 있음을 보여줍니다. 비교적 높은 수준의 탈수초화가 여전히 28dpi에서 존재하며, 이는 2점 LPC 주입으로 인한 지속적이고 안정적인 탈수초화를 나타낸다(그림 1D-E).

토론

MS, CNS의 만성 탈수초성 질환은 젊은 성인²⁰에서 신경 기능 장애의 가장 흔한 원인 중 하나입니다. 임상적으로, MS 환자의 약 60%-80%는 이차-진행성 MS^21,22를 개발하기 전에 재발 및 재발의 사이클을 경험하고^, 결국 시간 ²³에 따른 누적 운동 장애 및 인지 결핍을 초래한다. 현재, 어떠한 단일 실험 모델도 질환⁽²⁴)의 임상적, 병리학적, 또는 면역학적 특징의 전체 다양성을 포괄하지 않는다. 서로 다른 단계에서 MS의 병리학 적 과정과 병인을 시뮬레이션하기 위해 EAE 모델, 먹이 동물 CPZ 및 LPC 유도 탈수초화 모델을 포함하여 장점과 한계를 가진 세 가지 일반적인 탈수초성 동물 모델이 있습니다.

마우스에서, EAE는 미엘린...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
L-α - 달걀 노른자에서 Lysophosphatidylcholine	시그마 Aldrich	L4129-25MG
32 게이지 바늘	해밀턴	7762-05
10 μ l 주사기	해밀턴	80014
고속 두개골 드릴	강한, 한국	strong204
드릴	Hager & Meisinger, 독일	REF 500 104 001 001 005
Matrx Animal Aneathesia Ventilator	MIDMARK	VMR
휴대용 스테레오택시 기구 마우스	보상	68507
마이크로 주사기	보상	KDS LEGATO 130
Isoflurane	VETEASY
파라포름알데히드	Servicebio	G1101
인산염 완충액	BOSTER	PYG0021
LuxoL 고속 bLue	Servicebio	G1030-100ML
봉합사	FUSUNPHARMA	20152021225
뇌 곰팡이	보상	68707
전자 현미경 고정제	Servicebio	G1102-100ML
중성 적색 (C.I. 50040), 현미경 검사용 Certistain	Sigma-Aldrich	1.01376
항-미엘린 염기성 단백질 항체	Millipore	#AB5864
Anti-GST-P pAb	MBL	#311
Ki-67 단클론 항체 (SolA15)	Thermo Fisher  Scientific	14-5698-95
베타 액틴 단클론 항체	Proteintech	66009-1-Ig
Myelin 기본 단백질 다클론 항체	Proteintech	10458-1-AP
OLIG2 다클론 항체	Proteintech	13999-1-AP
Alexa Fluor 488  아피니퓨어  당나귀 안티 토끼  IgG (H+L)	YEASEN	34206ES60
Alexa Fluor 594 AffiniPure 당나귀 안티-랫 IgG (H+L)	YEASEN	34412ES60
알렉사 플루어 594  AffiniPure 당나귀 안티 토끼 IgG (H+L)	YEASEN	34212ES60
HRP 염소 안티-토끼 IgG (H+L)	abclonal	AS014
HRP 염소 안티-마우스 IgG (H+L)	abclonal	AS003
성인 C57BL / 6 남성 및 여성 마우스	후난 SJA 실험실 동물 유한 공사