본 프로토콜은 마우스에서 안정하고 재현가능한 탈수초화 모델을 생성하기 위해 입체택시 프레임을 통해 리소포스파티딜콜린의 두 점 주사를 기술한다.
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이 논문에서
요약
초록
수용체-매개 lysophospholipid 신호전달은 다양한 신경 질환, 특히 다발성 경화증 (MS)의 병태생리학에 기여한다. 리소포스파티딜콜린(LPC)은 염증과 관련된 내인성 리소포스포지질이며, 미엘린 지질에 대한 독성으로 빠른 손상을 유도하여 초점 탈수초화를 유도할 수 있다. 여기에서, 심각한 탈수초화를 직접적으로 야기하고 외과적 절차에 의해 마우스에서 실험적 탈수초화 손상을 신속하고 안정적으로 복제할 수 있는 입체 전술 이점 LPC 주사에 대한 상세한 프로토콜이 제시된다. 따라서, 이 모델은 탈수초화 질환, 특히 MS와 매우 관련이 있으며, 임상적으로 관련된 연구를 진행시키는 데 기여할 수 있다. 또한, LPC를 주입한 마우스의 코퍼스 캘로섬에서 탈수초화의 시간 과정을 묘사하기 위해 면역형광 및 룩솔 패스트 블루 염색 방법을 사용하였다. 또한, 행동 방법은 모델링 후 마우스의 인지 기능을 평가하기 위해 사용되었다. 전반적으로, 입체택시 프레임을 통한 리소포스파티딜콜린의 두 점 주사는 추가 연구를 위해 마우스에서 탈수초화 모델을 생성하는 안정하고 재현가능한 방법이다.
서론
수용체-매개 lysophospholipid 신호전달은 거의 모든 장기 시스템의 다양한 생리학적 과정을 수반한다1. 중추 신경계 (CNS)에서,이 신호 전달은 다발성 경화증 (MS)과 같은자가 면역 신경 질환의 병원성에 중요한 역할을합니다. 다발성 경화증은 병리학적 탈수초화 및 염증 반응을 특징으로 하는 만성 면역 매개 장애로, 신경학적 기능 장애 및 인지 장애를 일으킨다2,3. 초기 질병 동안 지속적인 재발 및 재발 후, 대부분의 환자는 결국 이차적 인 진행성 단계로 진행하여 뇌에 돌이킬 수없는 손상을 입히고 이로 인한 장애를 일으킬 수 있습니다4. 이차-진행성 과정의 병리학적 특징은 염증성 병변에 의한 탈수초성 플라크5라고 여겨진다. MS에 대한 기존의 치료법은 재발의 위험을 상당히 줄일 수 있습니다. 그러나, 진행성 MS6에 의해 야기된 장기간의 탈수초성 손상에 대한 효과적인 치료법은 여전히 없다. 따라서, 백질 변성에 초점을 맞춘 전임상 치료제를 연구하기 위해서는 안정하게 확립되고 쉽게 재현 가능한 모델이 요구된다....
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프로토콜
모든 동물 절차는 중국 Huazhong 과학 기술 대학 Tongji Medical College의 동물 관리위원회 연구소의 승인을 받았습니다. 성인 C57BL/6 수컷 및 암컷 마우스(야생형, WT; 20-25 g; 8-10주령)를 본 연구에 사용하였다. 마우스를 상업적 공급원으로부터 수득하였다( 물질의 표 참조). 마우스는 특정 병원체가 없는 (SPF) 동물 시설에 수용되었고, 물과 식량이 공급된 광고 리비툼을 가졌다. 22°C 온도 및 55%-60%의 상대 습도의 표준 조건에서 빛과 어둠 사이클의 교대로 12시간 주기로 유지하였다.
1. LPC 용액 준비
- LPC 분말 25mg( 물자표 참조)을 250μL의 클로로포름과 메탄올 혼합용액(1:1)에 녹여 10% LPC 용액을 만들고 이를 500μL 원심분리 튜브로 옮긴다.
참고 : LPC가 완전히 용해되지 않은 경우 원심 분리 튜브를 초음파 세척기에 넣고 40kHz의 초음파 처리수를 ~ 1 시간 동안 배치하여 균일 한 솔루션을 얻으십시오. - 용액을 3 μL/튜브로 나누고 -80°C에서 보관하십시오.
참고 : 솔루션은 ~ 2 년 동안 저장할 수 ....
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결과
LPC의 두 점 주입은 더 내구성있는 탈수초화를 가져 왔습니다.
LPC는 주로 미엘린에 대한 독성과 축삭 완전성15의 절단으로 인한 급격한 손상을 초래한다. 주사 날은 0일째로 간주하였다. 마우스를 10-28일 동안 유지하였다(10 dpi 및 28 dpi). 룩솔 패스트 블루(LFB) 염색10을 사용하여 이들 시점에서 마우스에서 탈수초화 면적을 평가하였다. 두 점 주입 모델에서, 가짜 그룹에 비해 10dpi에서 상당한 탈수초화가 있었으며, LPC의 국소 주사가 코퍼스 캘로섬을 성공적으로 탈수초시킬 수 있음을 보여줍니다. 비교적 높은 수준의 탈수초화가 여전히 28dpi에서 존재하며, 이는 2점 LPC 주입으로 인한 지속적이고 안정적인 탈수초화를 나타낸다(그림 1D-E).
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토론
MS, CNS의 만성 탈수초성 질환은 젊은 성인20에서 신경 기능 장애의 가장 흔한 원인 중 하나입니다. 임상적으로, MS 환자의 약 60%-80%는 이차-진행성 MS21,22를 개발하기 전에 재발 및 재발의 사이클을 경험하고, 결국 시간 23에 따른 누적 운동 장애 및 인지 결핍을 초래한다. 현재, 어떠한 단일 실험 모델도 질환(24)의 임상적, 병리학적, 또는 면역학적 특징의 전체 다양성을 포괄하지 않는다. 서로 다른 단계에서 MS의 병리학 적 과정과 병인을 시뮬레이션하기 위해 EAE 모델, 먹이 동물 CPZ 및 LPC 유도 탈수초화 모델을 포함하여 장점과 한계를 가진 세 가지 일반적인 탈수초성 동물 모델이 있습니다.
마우스에서, EAE는 미엘린.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (Grants : 82071380, 81873743)의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| L-α - 달걀 노른자에서 Lysophosphatidylcholine | 시그마 Aldrich | L4129-25MG | |
| 32 게이지 바늘 | 해밀턴 | 7762-05 | |
| 10 μ l 주사기 | 해밀턴 | 80014 | |
| 고속 두개골 드릴 | 강한, 한국 | strong204 | |
| 드릴 | Hager & Meisinger, 독일 | REF 500 104 001 001 005 | |
| Matrx Animal Aneathesia Ventilator | MIDMARK | VMR | |
| 휴대용 스테레오택시 기구 마우스 | 보상 | 68507 | |
| 마이크로 주사기 | 보상 | KDS LEGATO 130 | |
| Isoflurane | VETEASY | ||
| 파라포름알데히드 | Servicebio | G1101 | |
| 인산염 완충액 | BOSTER | PYG0021 | |
| LuxoL 고속 bLue | Servicebio | G1030-100ML | |
| 봉합사 | FUSUNPHARMA | 20152021225 | |
| 뇌 곰팡이 | 보상 | 68707 | |
| 전자 현미경 고정제 | Servicebio | G1102-100ML | |
| 중성 적색 (C.I. 50040), 현미경 검사용 Certistain | Sigma-Aldrich | 1.01376 | |
| 항-미엘린 염기성 단백질 항체 | Millipore | #AB5864 | |
| Anti-GST-P pAb | MBL | #311 | |
| Ki-67 단클론 항체 (SolA15) | Thermo Fisher Scientific | 14-5698-95 | |
| 베타 액틴 단클론 항체 | Proteintech | 66009-1-Ig | |
| Myelin 기본 단백질 다클론 항체 | Proteintech | 10458-1-AP | |
| OLIG2 다클론 항체 | Proteintech | 13999-1-AP | |
| Alexa Fluor 488 아피니퓨어 당나귀 안티 토끼 IgG (H+L) | YEASEN | 34206ES60 | |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure 당나귀 안티-랫 IgG (H+L) | YEASEN | 34412ES60 | |
| 알렉사 플루어 594 AffiniPure 당나귀 안티 토끼 IgG (H+L) | YEASEN | 34212ES60 | |
| HRP 염소 안티-토끼 IgG (H+L) | abclonal | AS014 | |
| HRP 염소 안티-마우스 IgG (H+L) | abclonal | AS003 | |
| 성인 C57BL / 6 남성 및 여성 마우스 | 후난 SJA 실험실 동물 유한 공사 |
참고문헌
- Gaire, B. P., Choi, J. W. Critical roles of lysophospholipid receptors in activation of neuroglia and their neuroinflammatory responses. International Journal of Molecular Sciences. 22 (15), 7864(2021).
- Compston, A., Coles, A. Multiple sclerosis. Lancet
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