유전자 치료 애플리케이션을 위한 조혈 줄기 및 전구 세포의 CRISPR/Cas9 유전자 편집

Vigneshwaran Venkatesan; Abisha Crystal Christopher; Karthik V. Karuppusamy; Prathibha Babu; Manoj Kumar K. Alagiri; Saravanabhavan Thangavel

doi:10.3791/64064

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방법 논문

유전자 치료 애플리케이션을 위한 조혈 줄기 및 전구 세포의 CRISPR/Cas9 유전자 편집

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DOI:

10.3791/64064

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2022년 8월 9일

Vigneshwaran Venkatesan^*¹^,² , Abisha Crystal Christopher^*¹^,³ , Karthik V. Karuppusamy¹^,² , Prathibha Babu¹^,² , Manoj Kumar K. Alagiri¹^,² , Saravanabhavan Thangavel¹

¹Centre for Stem Cell Research (CSCR), A unit of InStem Bengaluru, Christian Medical College campus, ²Manipal Academy of Higher Education, ³Thiruvalluvar University

^* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

본 프로토콜은 생체 내에서 유전자 편집 세포의 강력한 생착을 위한 최적화된 조혈 줄기 및 전구 세포(HSPC) 배양 절차를 설명합니다.

초록

CRISPR/Cas9는 다양한 유전적 돌연변이를 교정하기 위해 널리 채택된 매우 다재다능하고 효율적인 유전자 편집 도구입니다. 시험관 내에서 조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPC)의 유전자 조작의 타당성은 HSPC를 유전자 치료를위한 이상적인 표적 세포로 만듭니다. 그러나 HSPC는 생체 외 배양에서 생착 및 다중 계통 재 집단 잠재력을 적당히 잃습니다. 본 연구에서, HSPC 생착을 개선하고 생체내에서 증가된 수의 유전자-변형 세포를 생성하는 이상적인 배양 조건이 기술된다. 현재 보고서는 배양 배지 유형, 고유한 저분자 칵테일 보충제, 사이토카인 농도, 세포 배양 플레이트 및 배양 밀도를 포함하여 최적화된 체외 배양 조건을 표시합니다. 그 외에도 유전자 편집 이벤트의 검증과 함께 최적화된 HSPC 유전자 편집 절차가 제공됩니다. 생체내 검증을 위해, 마우스 수용자에서의 유전자 편집된 HSPC 주입 및 생착 후 분석이 표시된다. 결과는 배양 시스템이 시험관 내에서 기능성 HSC의 빈도를 증가시켜 생체 내에서 유전자 편집 세포의 강력한 생착을 초래한다는 것을 입증했습니다.

서론

동종 이식 환경에서 인간 백혈구 항원(HLA)과 일치하는 기증자에 접근할 수 없고 매우 다재다능하고 안전한 유전 공학 도구의 급속한 개발로 인해 자가 조혈모세포 이식(HSCT)은 유전성^{혈액 질환에} 대한 치료 전략이 되었습니다^1,2. 자가 조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPC) 유전자 치료는 환자의 HSPC 수집, 유전자 조작, 질병 유발 돌연변이의 교정 및 유전자 교정 된 HSPC를 환자에게 이식하는 것을 포함합니다 ^3,4. 그러나 유전자 치료의 성공적인 결과는 이식 가능한 유전자 변형 이식편의 품질에 달려 있습니다. HSPC의 유전자 조작 단계 및 생체 외 배양은 장기 조혈 줄기 세포 (LT-HSC)의 빈도를 감소시켜 이식편의 품질에 영향을 미치므로 유전자 조작 HSPC ^2,5,6을 다량 주입해야합니다.

SR1 및 UM171을 포함한 여러 소분자가 현재 ....