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방법 논문

3종류의 탯줄 중간엽 줄기세포의 분리와 배양

2.6K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/64065

⸱

2022년 8월 23일

 ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynecology, the Third Affiliated Hospital, Soochow University, 2Department of Obstetrics and Gynecology, Nanjing First Hospital, Nanjing Medical University, 3Center for Reproductive Medicine and Obstetrics and Gynecology, Nanjing Drum Tower Hospital, Nanjing University Medical School

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

본 프로토콜은 탯줄 동맥, 정맥 및 Wharton's jelly에서 중간엽 줄기 세포의 분리 및 배양을 설명합니다.

초록

탯줄 중간엽 줄기세포(UC-MSC)는 재생 의학을 위한 중요한 세포 공급원입니다. UC-MSC는 탯줄 와튼 젤리(Wharton's jelly)뿐만 아니라 탯줄 동맥 및 탯줄 정맥(僯都)에서도 분리할 수 있습니다. 이들은 제대동맥에서 얻은 혈관주위 줄기세포(UCA-PSC), 제대정맥에서 얻은 혈관주위 줄기세포(UCV-PSC), 와튼 젤리에서 얻은 중간엽 줄기세포(WJ-MSCs)로 알려져 있습니다. UCA-PSC 및 UCV-PSC는 MSC의 전구 세포인 혈관 주위 영역에서 유래한 주위 세포입니다. 세 가지 종류의 세포의 분리 및 배양은 줄기 세포 이식 및 복구를 연구하는 데 중요한 출처입니다. 본 프로토콜은 기계적 분리, 부착 배양 및 세포 크롤링 아웃을 통한 세포의 분리 및 배양에 중점을 둡니다. 이 기술을 통해 세 가지 유형의 줄기세포를 유도할 수 있습니다. 세포 표면 마커는 유세포 분석에 의해 검출되었습니다. 줄기세포는 지방형성(adipogenic), 골형성(osteogenic) 및 신경유사 분화(neuroal-like differentiation)에 의해 다계통 분화 가능성에 대해 검출되었으며, 이는 MSC의 표현형과 일치합니다. 이 실험적 프로토콜은 UC-MSC의 소스를 확장합니다. 또한 세포 분리 방법은 재생 의학 및 기타 응용 분야에 대한 추가 연구를 위한 기초를 제공합니다.

서론

인간 탯줄 중간엽 줄기세포(UC-MSC)는 비침습적 작동, 낮은 면역원성, 윤리적 논쟁의 부재로 인해 재생 의학에서 널리 사용되고 있다1. 많은 연구에서 Wharton's jelly(WJ)에서 분리된 UC-MSC는 벽에 부착되어 다중 분화를 거치고 중간엽 줄기세포(MSC)2의 마커를 발현할 수 있습니다. 그러나 거의 모든 MSC는 혈관주위영역 3에서 유래합니다. 혈관주위 세포(perivascular cell)의 하위 집합인 주피세포(pericyte)는 MSC의 전구 세포입니다4. 따라서 UC-MSC는 각각 UCA-PSC, UCV-PSC 및 WJ-MSC로 알려진 탯줄 WJ, 제대 동맥(UCA) 및 제대 정맥(UCV)에서 분리될 수 있습니다5. 이 방법은 세 가지 유형의 줄기 세포를 분리하고 배양하는 것을 목표로 했습니다. UCA-PSC, UCV-PSC 및 WJ-MSC의 격리 및 배양은 더 많은 MSC 소스를 제공하는 데 매우 중요합니다.

본 연구는 세포 접착력을 가지고 MSC의 마커를 발현하며 다방향 분화를 갖는 UCA-PSC, UCV-PSC 및 WJ-MSC의 분리, 배양 및 향후 적용에 대해 설명합니다. 분리된 줄기세포는 현미경으로 관찰하고 세포 배양, 세포 계대, 세포 동결 보존 및 세포 회수를 수행했습니다. 이 기술을 사용한 이유는 세포가 조직에서 기어 나왔기 때문입니다. 복잡하고 비용이 많이 드는 유세포 분석 또는 면역자기 비드 기술과 같은 이전 방법과 비교했을 때, 6 US-MSC는 부착 분리 및 세포 크롤링 방법으로 대량으로 분리할 수 있습니다. 이들은 이전 연구에서 사용되었다5. 이러한 세포가 MSC 마커를 발현하는지 여부를 검출하기 위해 유래된 줄기세포에 대해 유세포 분석을 수행했습니다. 줄기세포의 다방향 분화는 세 종류의 세포가 지방세포, 조골세포, 신경아세포로 분화할 수 있는 잠재력을 가지고 있는지 여부를 감지하기 위해 도입되었습니다. 탯줄에서 세 가지 유형의 줄기세포를 분리하고 배양하는 것은 임상적 사용에서 중요했으며 다양한 미래 응용 분야를 위한 연구자들에게 도움이 되었습니다.

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프로토콜

모든 실험 절차는 수저우대학교 제3부속병원의 임상연구윤리위원회(Clinical Research Ethics Committee)의 승인을 받았습니다. 피험자로부터 정보에 입각한 서면 동의를 얻었습니다. 만삭 질 분만 또는 제왕 절개를 한 개인은 탯줄을 얻기 위해 본 연구에 포함되었습니다. 탯줄은 성별 편견이 없는 건강한 신생아에게서 나옵니다. 신생아는 Apgar 점수가 8-10이었습니다. Apgar 점수는 출생 직후 신생아를 대상으로 하는 빠른 테스트입니다. 이 검사는 아기의 근육 긴장도, 심박수 및 기타 징후를 확인하여 추가 의료 또는 응급 치료가 필요한지 확인합니다7. 한편, 심장, 간, 신장 또는 기타 감염성 질환과 같은 주요 질환을 앓고 있는 환자는 본 연구에서 제외되었다.

1. 인간 탯줄의 채취

  1. 신생아의 탯줄을 인산염 완충 식염수(PBS)에 넣고 4°C에서 운반합니다.
    참고: 본 연구에서는 3명의 기증자로부터 3개의 탯줄을 사용했습니다.
  2. 제대혈은 멸균 상태에서 즉시 제거하고 탯줄 20cm의 혈관의 장축을 따라 자릅니다. 제대 동맥과 정맥을 적당량 20cm 분리하고 표면의 와튼 젤리를 조심스럽게 제거합니다.
    참고: 외식 배양액은 세 가지 유형의 줄기 세포 간의 교차 오염을 방지하기 위해 각 영역에서 얻어졌으며 작은 조각(1-2mm3)으로 다졌습니다.
  3. 탯줄동맥, 정맥, 와튼젤리를 1-2mm3 크기로 잘라 100mm 세포 배양 접시에 접종한다. 탯줄 동맥, 정맥 및 Wharton's jelly를 핀셋을 사용하여 이전에 발표된 보고서5에 따라 접종을 수행합니다. 100mm 배양 플레이트를 사전 코팅하지 마십시오.
    참고: 탯줄 동맥, 정맥 또는 와튼 젤리 사이의 간격은 약 1cm였습니다. 세포를 분리하기 전에 수집 시간이 너무 길면 세포 생존율과 양에 영향을 미칠 수 있습니다. 탯줄에서 동맥과 정맥을 즉시 분리하는 것이 좋습니다. 수거 시간은 최대 4 시간이었습니다.

2. UCA-PSC, UCV-PSC 및 WJ-MSC의 격리 및 배양

  1. 배양 배지를 추가하기 전에 배꼽 동맥, 정맥 및 Wharton의 젤리 조직이 세포 배양 접시에 단단히 부착되도록 37°C의 5% CO2 인큐베이터에 세포 배양 접시를 3시간 동안 거꾸로 놓습니다.
    1. 3시간 후 세포 배양 접시를 원래 위치로 되돌립니다. 세포 배양 접시에 5mL의 세포 배양 배지(LG-DMEM, 10% FBS, 페니실린 100IU/mL 및 스트렙토마이신 100μg/mL, 재료 표 참조)를 추가합니다.
  2. 배양 배지 3 mL 및 2 mL를 각각 첫번째 주 3 일과 7 일에 세포 배양 접시에 첨가합니다. 탯줄 동맥, 정맥, 와튼 젤리의 조직 블록을 만지지 않도록 주의하십시오.
  3. 두 번째 주에 액체 매체의 절반을 두 번 변경하고 세 번째 주에 전체 액체 매체를 두 번 변경합니다.
  4. 배양 후 약 7일에 조직 블록에서 세포가 기어 나오는 것을 관찰한 다음 세포가 ~2주에 80% 융합되면 조직 블록을 폐기합니다.
    1. 세포가 100% 융합되면 실온에서 4분 동안 600 x g 에서 원심분리 후 0.05% 트립신 2mL와 1:3의 비율로 세포를 계대형성합니다.
      참고: 탯줄에서 분리된 일차 세포는 약 2 x 106 UCA-PSC, 1 x 106 UCV-PSC 및 2 x 106 WJ-MSC였습니다. 2 x 106 UCA-PSC, 1 x 106 UCV-PSC 및 2 x 106 WJ-MSC를 20cm의 탯줄에서 분리했습니다. 세포는 세 개의 탯줄 모두에서 기어 나왔는데, 이는 격리 사이의 결과가 반복 가능하다는 것을 나타냅니다.
    2. 배양 접시에서 5 x 105/100 cm2 의 농도를 유지하면서 세포를 파종합니다. 5 x 105 세포를 1mL의 동결 보존 용액(90% FBS, 10% DMSO)에 보존합니다. 본 연구에서는 3 내지 5 계대 세포가 사용되었습니다.

3. 유세포 분석에 의한 MSC 표면 마커 검출

  1. 3세대 세포를 0.05% 트립신으로 분해하여 단일 세포 현탁액을 얻습니다. 실온에서 600 x g 에서 4분 동안 세포를 원심분리하고 파스퇴르 피펫을 사용하여 세포 상등액을 버립니다. 그런 다음 1 x 105 세포를 100μL의 PBS(1% FBS)에 재현탁합니다. 이전에 발표된 보고서8에 따라 혈구계를 사용하여 세포를 계수하여 세포 수를 평가합니다.
  2. CD13 (FITC, 0.1 mg/mL), CD34 (FITC, 0.1 mg/mL), CD45 (FITC, 0.1 mg/mL), CD73 (FITC, 0.1 mg/mL) 및 HLA-DR (FITC, 0.1 mg/mL)에 대한 다양한 phycoerythrin 항체와 함께 1 x 105 세포를 30분 동안 어둠 속에서 배양합니다. 대조군의 경우, FITC-IgG(FITC Mouse Anti-Human IgG, 0.1 mg/mL)로 1 x 105 세포를 배양합니다( 재료 표 참조).
  3. 실온에서 600 x g 에서 4분 동안 세포를 원심분리한 다음 파스퇴르 피펫을 사용하여 세포 상층액을 폐기합니다. 500 μL의 PBS(1% FBS)에 1 x 105 세포를 재현탁하고, 유세포 분석으로 검출하고, FlowJo2 로 분석합니다( 재료 표 참조).

4. UCA-PSC, UCV-PSC 및 WJ-MSC를 지방세포로 분화

  1. 37°C의 5% CO2 인큐베이터에서 웰당 500μL의 세포 배지(LG-DMEM, 10% FBS, 100 IU/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신, 재료 표 참조)를 사용하여 3세대 세포를 6 x 104 cells/cm2의 밀도로 24-well plate에 접종합니다.
  2. 24시간 후에 세포 배지를 변경하고 대조군을 세포 배지(LG-DMEM, 10% FBS, 100 IU/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신)로 변경합니다. 세포가 24웰 플레이트에서 80% 융합된 후 실험을 수행합니다.
    참고: 지방형성을 유도한 그룹의 세포는 지방형성 유도 배지(지방형성 분화 키트, 재료 표 참조)로 변경되었습니다. 두 그룹의 세포의 배지는 3일마다 변경하였다.
  3. 지방형성 유도 그룹에서 유도 후 약 21일 후에 세포의 지질 방울을 관찰한 다음 지방생성 유도를 종료합니다.
    참고: 지방생성 배지는 지방생성 유도 2,5를 종결하기 위해 세포 배양 배지로 대체되었습니다. 또한 대조군의 세포는 유의미한 변화를 보이지 않았습니다.
  4. PBS로 5분 동안 세포를 세 번 세척한 다음 실온에서 15분 동안 4% 파라포름알데히드로 고정합니다. 그런 다음 PBS로 각각 5분 동안 세포를 세 번 세척합니다.
  5. PBS를 버리고 실온에서 약 20분 동안 셀을 건조시킵니다. 그런 다음 500μL의 오일 레드 O 용액(0.5%)( 재료 표 참조)을 웰에 10분 동안 추가합니다.
  6. 오일 레드 O 용액을 제거하고 PBS로 세포를 각각 5 분 동안 3 회 세척합니다. 현미경으로 세포를 관찰하십시오.

5. 줄기세포를 조골세포로 분화

  1. 24웰 배양 플레이트에 웰당 0.1% 젤라틴 500μL( 재료 표 참조)를 놓고 30분 후에 폐기합니다.
  2. 3세대 세포 6 x 104/cm2를 24웰 배양 플레이트에 접종하고, 37°C에서 5% CO2 인큐베이터의 각 웰에 500μL 세포 배양 배지 또는 골형성 유도 배지(골형성 분화 키트, 재료 표 참조)를 추가합니다. 대조군에서는 3일마다 세포 배양 배지를 교체하고, 골형성 분화 그룹의 골형성 유도 배지도 3일마다 교체합니다.
  3. 3-4주 후, 세포에 검은 칼슘이 침착되어 있는지 확인합니다. PBS로 우물을 각각 5분씩 세 번 씻습니다.
  4. 4% 파라포름알데히드로 실온에서 15분 동안 세포를 고정하고 PBS로 각각 5분 동안 3회 세척합니다. 알리자린 레드 염색 용액(1%)을 웰에 실온에서 20분 동안 첨가한 후 버립니다.
  5. 실온에서 30분 동안 건조시킨 후 현미경으로 세포를 관찰합니다.

6. 줄기세포를 뉴런으로 분화

  1. 6 x 104/cm2 3세대 세포를 24웰 배양 플레이트에 접종하고, 여기서 L-폴리리신으로 처리된 멸균 커버 슬라이드를 교체합니다. 세포 등반 시트(Cell climbing sheet)를 24웰 플레이트( Table of Materials)에 배치하여 세포를 뉴런으로 분화합니다. 세포 등반 시트에서 세포를 배양합니다.
  2. 그런 다음, 500μL의 세포 배양 배지를 웰에 첨가하고, 24시간 후에 세포 배양 배지를 500μL의 신경인성 유도 배지9 ( 재료 표 참조)로 교체합니다.
  3. 24시간 동안 유도한 후 10-7 mol/L의 ATRA와 10 ng/mL의 bFGF( 재료 표 참조)를 용액에 첨가하여 뉴런의 유도 분화를 유지합니다.
  4. 명백한 세포 시냅스가 형성될 때 유도를 종료합니다. 현미경 기술을 사용하여 명백한 세포 시냅스를 확인합니다( 재료 표 참조).
    참고: 면역형광 염색은 뉴런 특이적 에놀라아제(NSE, Table of Materials, 참조)의 뉴런 특이적 마커를 식별하는 데 사용되었으며, 이는 뉴런2의 마커입니다.
  5. 세포 climbing sheet에 대해 컨포칼 이미징을 수행합니다.

7. 면역형광 염색

  1. 세포 배양 용액을 버린 후 500μL의 PBS로 세포를 각각 5분씩 3회 세척합니다.
  2. 그런 다음 웰에 500μL의 4% 파라포름알데히드를 첨가하고 셀을 실온에서 45분 동안 고정합니다.
  3. PBS로 세포를 각각 5분씩 3회 세척합니다.
  4. 100μL의 0.5% Triton-X로 실온에서 5분 동안 세포를 투과합니다.
  5. 500μL PBS와 1% BSA로 셀을 각각 5분씩 3회 세척합니다.
  6. 37°C에서 웰당 3% BSA 및 0.1% Triton X-100이 포함된 PBS 500μL로 세포를 45분 동안 배양하여 비특이적 결합 부위를 차단합니다.
  7. NSE에 대한 1차 항체(1:100, 재료 표 참조)를 1% BSA와 0.1% Triton X-100을 함유한 PBS(1:100)로 희석하고 4°C에서 하룻밤 동안 1차 항체가 있는 세포를 배양합니다.
  8. 1차 항체를 버린 후 1% BSA가 함유된 PBS 500μL로 세포를 5분씩 3회 세척합니다.
  9. 형광 2차 항체(goat Anti-Mouse IgG H&L, Alexa Fluor 488, Tabel of Materials 참조)를 1:200에 1% BSA와 0.1% Triton X-100을 함유한 PBS(1:200)로 희석하고, 2차 항체와 함께 37°C의 암흑 속에서 60분 동안 세포를 배양합니다.
  10. 웰당 500μL의 PBST(0.1% Tween-20을 함유한 PBS)로 셀을 각각 5분 동안 어둠 속에서 3회 세척합니다.
  11. 그런 다음 웰에 200μL의 DAPI 염색(PBST 희석, 0.1μg/mL)을 첨가하여 실온에서 5분 동안 빛이 없는 상태에서 핵을 염색합니다.
  12. 500μL의 PBST로 세포를 어두운 곳에서 각각 5분씩 3회 세척합니다.
  13. 슬라이드에 형광 담금질제를 첨가한 다음 커버 유리로 슬라이드를 부드럽게 덮습니다. 커버 유리 주위에 매니큐어 방울을 떨어뜨려 고정합니다.
  14. 레이저 컨포칼 현미경으로 유리를 관찰하십시오. 다음 현미경 설정을 사용하십시오: 488nm 레이저의 녹색 채널 및 405nm 레이저의 DAPI 채널.

8. 증식 분석

  1. 웰당 2 x 103 개의 세포를 96웰 플레이트에 시딩합니다. 각 웰에 100μL의 세포 배양 배지를 추가합니다.
  2. 각 웰에 10μL의 세포 계수 키트-8(CCK-8, 재료 표 참조)을 추가합니다.
  3. 배양 2일 후, 1-7일째에 마이크로플레이트 리더에서 450nm에서 OD 값을 측정합니다.
  4. 통계 소프트웨어( Table of Materials)를 사용하여 다양한 유형의 줄기 세포의 OD 값을 분석하고 이를 SD± 수단으로 제시합니다.일원 분산 분석(ANOVA)을 수행합니다. 0.05< P 값은 통계적으로 유의한 것으로 간주합니다.

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결과

탯줄에서 UCA-PSC, UCV-PSC 및 WJ-MSC의 분리 및 배양
탯줄동맥, 탯줄, 와튼젤리를 탯줄에서 기계적으로 분리하여 2-3cm3조각으로 자릅니다. 동맥, 정맥 또는 Wharton's jelly tissue blocks 사이의 거리는 약 1cm였으며 quincunx 모양으로 배열되었습니다(그림 1A-C). 3종의 줄기세포는 조직 부착 배양법5에 의해 분리되었다. 약 1주일간의 배양 후, 세포가 방사형으로 기어 나와 긴 방추체 모양과 빠른 증식을 보이는 것이 관찰되었습니다(그림 1D-F). 세포는 약 2주에 70%-80% 합류점에 도달했으며 통과 후 성장 속도가 가속화되었습니다. 세포는 균일한 방추...

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토론

이 연구는 탯줄 동맥, 정맥 및 와튼 젤리에서 세 가지 종류의 세포를 분리했습니다. 탯줄은 택배 폐기물이었고, 사용이 간편하고 안전하며 윤리적 논란이 없었다5. UC-MSC는 독창적이며 강력한 차별화 능력을 가지고 있습니다1. 이전 연구에서는 콜라겐 분해 효소, 트립신 및 히알루로니다아제 소화 방법에 의해 탯줄에서 분리된 UC-MSC의 양이 풍부하지 않음을 보여주었습니다. 줄기세포는 검체의 약 70%에서 여러 번 계대배양될 수 없어 임상적 필요를 충족시킬 수 없다10. 유세포 분석 또는 면역자기 비드 기술과 같은 UC-MSC의 다른 분리 방법은 복잡하고 비용이 많이 들었습니다11. 접착 분리 방법6은 UC-MSC를 빠르고 대규모로 분리할 수 있습니다. 이들의...

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공개 사항

저자는 공개할 내용이 없습니다.

감사의 글

저자는 보조금 번호 CJ20200110(YJY)에 따른 창저우 과학기술국 기초 연구 프로젝트, 중국 국립 자연 과학 재단(82001629, XQS), 장쑤성 자연과학재단 청소년 프로그램(BK20200116, XQS) 및 장쑤성 박사후 연구 기금(2021K277B, XQS)의 지원에 감사를 표합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
지방생성 분화 키트GibcoA1007001Multidirectional differentiation
Alizarin red staining solutionSigmaA5533Multidirectional differentiation
Antibody against CD13Thermo Fisher ScientificMA1-12034flow analysis
CD34BD Biosciences560942flow analysis
CD45BD Biosciences561865흐름 분석
대한 항체 CD73BD Biosciences940294흐름 분석
대한 항체 HLA-DRBD Biosciences555560흐름 분석
AbcamAB103748Immunofluorescence
Anti-Mouse IgG H& L (Alexa Fluor 488)abcamab150113다방향 분화
ATRASTEMCELL Technologies302-79-4세포 배양
bFGFGibco13256029다방향 분화
BSASigmaV900933면역형광
세포 배양Thermo Fisher ScientificHERAcell 240i세포 배양
세포 계수 키트-8DojindoCK04세포 증식
원심분리기Thermo Fisher ScientificSorvall™ MTX-150세포 배양
DAPI시그마10236276001면역형광
DMSO시그마D1435세포 배양
FBSGibco10099141세포 배양
FITC 마우스 Anti-Human IgGBD Biosciences560952흐름 분석
유세포 분석기Thermo Fisher ScientificA24864흐름 분석
형광 현미경Thermo Fisher ScientificIM-5유동 분석
젤라틴시그마48722다방향 분화
Leica 현미경LeicaDM500다방향 분화
LG-DMEM 매체Gibco11-885-084세포 배양
마이크로플레이트 리더Thermo Fisher ScientificA51119500C증식
신경인성 유도Gibco A1647801다방향 분화
오일 레드 O 용액시그마O1516다방향 분화
골형성 유도CyagenHUXXC-90021다방향 분화
파라포름알데히드Sangon Biotech30525-89-4면역형광
파스퇴르 피펫BiosharpBS-XG-03L세포 배양
PBS (인산염 완충 식염수)HycloneSH30256.LS세포 배양
페니실린 스트렙토마이신HycloneSV30010배양
NSE에 대한 기본 항체Santa Cruz Biotechnologysc-292097다방향 분화
SPSS 22.0IBMSPSS 22.0통계 분석
세포 등반 시트CITOTEST Scientific80346-0910다방향 분화
TritonX-100Sangon Biotech9002-93-1면역형광
트립신Gibco25300120세포 배양
에 대한 항체에에에 대한 항체세포 세포

참고문헌

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