혈관화된 복합 동종 이식을 위한 생체 내 관류 기반 생물반응기를 사용한 쥐 뒷다리의 조달 및 탈세포화

VCA는 복잡한 외과적 재건이 필요한 환자를 위한 새로운 옵션입니다. 외상성 부상이나 종양 절제술은 재건하기 어려울 수 있는 체적 조직 손실을 초래합니다. VCA는 피부, 뼈, 근육, 신경 및 혈관과 같은 여러 조직을 기증자^{로부터 수혜}자1에게 복합 이식편으로 이식하는 것을 제공합니다. 유망한 특성에도 불구하고 VCA는 장기간의 면역 억제 요법으로 인해 제한적입니다. 이러한 약물을 평생 사용하면 기회 감염, 악성 종양 및 말단 장기 독성의 위험이 증가합니다 ^1,2,3. 면역억제의 필요성을 감소 및/또는 제거하는 데 도움이 되도록 VCA에 대한 탈세포화 접근법을 사용하는 조직 공학 스캐폴드는 큰 가능성을 보여줍니다.

조직 탈세포화는 세포 및 핵 내용물을 제거하면서 세포외 기질 구조를 유지하는 것을 수반합니다. 이 탈세포화된 스캐폴드는 환자-특이^{적 세포4}로 재채워질 수 있다. 그러나 복합 조직의 ECM 네트워크를 보존하는 것은 추가적인 과제입니다. 이것은 스캐폴드 내에서 다양한 조직 밀도, 구조 및 해부학적 위치를 가진 여러 조직 유형이 존재하기 때문입니다. 본 프로토콜은 래트 뒷다리에 대한 수술 기술 및 탈세포화 방법을 제공한다. 이것은 이 조직 공학 기술을 복합 조직에 적용하기 위한 개념 증명 모델입니다. 이것은 또한 재세포화를 통해 복합 조직을 재생하려는 후속 노력을 촉발할 수 있습니다.

토론토 종합병원 연구소로부터 입수한 사체 수컷 루이스 래트(300-430 g)를 모든 실험에 사용하였다. 모든 수술 절차에서 무균 기술을 유지하기 위해 멸균 도구와 용품이 사용되었습니다( 재료 표 참조). 모든 절차는 토론토 종합 병원 연구소, 대학 건강 네트워크 (토론토, 온타리오, 캐나다)의 동물 관리위원회의 지침에 따라 수행되었습니다. 총 4 개의 뒷다리가 탈세포화되었습니다.

1. 수술 전 준비

1. 5 % 헤파린 화 식염수 50mL를 준비하십시오. 50mL 식염수 백에서 5mL 주사기를 사용하여 식염수 2.5mL를 꺼내 버립니다. 5mL 주사기를 사용하여 2.5mL의 헤파린을 식염수 백에 추가합니다. 식염수 백을 뒤집어 내용물을 혼합합니다.
2. 사체 쥐를 파란색 패드 아래에 앙와위 자세로 놓습니다. 전기 면도기를 사용하여 뒷다리와 사타구니 부위를 원주 방향으로 면도하고 머리카락을 제거하십시오.
3. 쥐를 수술실로 데려와 거즈를 사용하여 포비돈 요오드 스크럽 용액을 뒷다리와 사타구니 부위에 바르십시오. 그런 다음 70 % 이소 프로필 알코올을 바르고 거즈를 사용하여 스크럽 용액을 닦아냅니다.
4. 1.2단계의 파란색 패드를 버리고 새 멸균 장갑으로 교체하십시오.

2. 쥐 뒷다리 조달

1. 사타구니 인대 수준을 따라 #10 수술용 칼날과 #3 칼날 러너를 사용하여 측면 방향에서 내측 방향으로 이동하여 피부 절개를 합니다(그림 1A). Adson 겸자를 사용하여 주변 피부를 잡고 부드럽게 절개하십시오.
2. 밑에있는 지방이 노출되면 무딘 해부를 사용하여 지방을 조심스럽게 해부하십시오. 상부 상복부 혈관을 찾으십시오.
3. 미세 가위를 사용하여 근위를 해부하고 사타구니 인대 수준에서 기본 대퇴 신경, 동맥 및 정맥을 노출시킵니다.
4. 해부 현미경에서 대퇴 혈관을 식별하고 미세한 집게를 사용하여 동맥과 정맥을 근위로 해부하여 동맥 네트워크의 분기점에서 충분한 길이를 얻습니다(그림 1B).
5. 6-0 봉합사를 사용하여 대퇴 동맥과 정맥을 별도로 결찰하십시오.
6. 결찰 된 대퇴 혈관을 방해하지 않고 뒷다리의 나머지 부분을 원주 해부를 수행하십시오.
7. 뼈 절단기를 사용하여 대퇴골 중간 길이를 횡단합니다.
8. 뒷다리를 완전히 분리하려면 마이크로 가위를 사용하여 합자 아래의 결찰 된 대퇴 혈관을 횡단하십시오.
9. 해부 현미경으로 24G 혈관 카테터를 사용하여 대퇴 동맥을 캐뉼러합니다. 가는 집게를 사용하여 캐뉼러를 조심스럽게 삽입하십시오. 대퇴 정맥에서 명확한 유출이 관찰 될 때까지 헤파린 화 된 식염수로 씻어 내십시오.
10. 캐뉼러 용기 주위에 하나의 봉합사를 묶고 캐뉼라 자체 주위에 다른 봉합사를 원위부로 묶어 캐뉼러를 고정합니다. 분기점이 막히지 않도록 캐뉼러가 근위부에 배치되었는지 확인하십시오.
11. 조달 된 뒷다리를 탈세포화 될 때까지 인산염 완충 식염수 (PBS)에 담그십시오.

그림 1 : 쥐 뒷다리 조달. (A) 사타구니 인대 수준에서 외측으로 피부 절개 표시. (B) 사타구니 인대를 향해 근위로 해부된 대퇴 정맥과 대퇴 동맥의 모습, 점선으로 표시됨. 약어 : L = 측면; M = 내측; FV = 대퇴 정맥; FA = 대퇴 동맥. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

3. 용액 준비

1. 6L 유리 플라스크에서, 12.5 g의 SDS 분말을 5 L의 초순수 증류수에 용해시켜 0.25% 나트륨 도데실 설페이트(SDS)의 5 L 세제 저장소를 제조한다. 플라스크의 입구를 파라 필름으로 덮어 밀봉하십시오.
2. 1L 유리병에 1L의 초순수증류수에 SDS 2.5g을 녹여 0.25% SDS 용액 1L를 별도로 준비한다. 교반 막대를 추가하여 모든 SDS가 용해될 때까지 자기 교반기에서 용액을 혼합합니다.
3. 1% 항생제-항진균제(AA) 용액으로 1x PBS 세척액 1L를 준비합니다. 1L 플라스크에 990mL의 1x PBS 용액과 10mL의 AA를 추가합니다.
4. 별도로, 500mL 유리병에 1x PBS 용액 495mL와 AA 5mL를 사용하여 1x PBS + 1% AA 용액을 다시 준비합니다.
5. 200mL의 1% 과초산(PAA)/4% 에탄올(EtOH) 용액을 준비합니다. 흄 후드 아래에서이 용액을 준비하십시오.

4. 생물 반응기 및 관류 회로 구축

알림: 나열된 단계 전반에 걸쳐 생물 반응기 및 관류 회로의 구성에 대해서는 그림 2 를 참조하십시오.

1. 500mL 챔버(플라스틱 용기)에서 그림 1의 라벨이 부착된 위치에 3개의 구멍(4/2인치)을 뚫습니다: 포트 A는 입구 라인, 포트 B는 보충 라인, 포트 C는 출구 라인입니다. 여분의 플라스틱을 제거하고 폐기하십시오. 70 % 에탄올로 챔버를 분무하고 닦으십시오.
2. 5cm 길이의 실리콘 튜브 3개를 자르고 챔버의 각 포트에 중간에 하나씩 삽입합니다. 챔버 내부를 향한 포트 A의 개구부에 수 Luer 커넥터를 연결하고 챔버 외부 튜브의 다른 쪽 끝에 암 Luer 커넥터를 연결합니다.
3. 챔버 외부를 향한 튜브 끝에 있는 포트 B와 포트 C에 암 Luer 커넥터를 연결합니다.
4. 플라스틱 용기의 밀폐 된 뚜껑에서 뚜껑 표면에 구멍 하나를 뚫습니다.
5. 3cm 실리콘 튜브를 자르고 뚜껑의 구멍에 삽입하십시오. 그림 2와 같이 튜브의 약 2cm가 뚜껑 바깥쪽에 있는지 확인합니다.
6. 튜브로 챔버와 뚜껑을 모두 소독하십시오.
7. 가위를 사용하여 두 개의 30cm 실리콘 튜브를 자릅니다. 각 튜브의 한쪽 끝에 있는 1/16인치를 1/8인치 커넥터에 연결합니다.
8. 별도로 가위를 사용하여 두 개의 12cm 실리콘 튜브를 자릅니다. 두 튜브의 한쪽 끝에 있는 1/16인치를 1/8인치 커넥터에 연결합니다. 한 튜브의 다른 쪽 끝에 있는 수 Luer 커넥터와 다른 튜브에 있는 암 Luer 커넥터를 연결합니다.
9. 4.7 단계와 4.8 단계의 모든 튜브 재료를 소독하십시오. 멸균에 2개의 3-스톱 펌프 튜브(1.85mm)를 포함합니다.
10. 탈세포화 설정을 위해 3방향 스톱콕 3개, 주사기 필터 1개, 1mL 혈청학적 피펫 2개, 10mL 주사기 1개를 준비합니다. 1mL 혈청학적 피펫에서 필터를 제거합니다.

그림 2: 바이오리액터 준비 및 관류 회로 구성. (A) 연동 펌프 및 (B) 입구 및 출구 라인 모두에 대한 해당 카세트를 포함하는 관류 회로의 도시된 장치. (다, 디) 12cm 및 30cm의 실리콘 튜브도 각 커넥터와 함께 표시됩니다. (E) 연동 펌프용 튜브(1.85mm). (F) 유입, (G) 보충 포트 및 (H) 유출을 위한 표지된 포트가 있는 생물반응기 챔버. (I) 환기구가 있는 생물반응기 뚜껑. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

5. 쥐 뒷다리의 탈세포화

1. 멸균 된 챔버를 놓고 입구, 출구 및 보충 라인에있는 3 개의 일회용 3 방향 스톱 콕에 나사를 고정합니다. 누출을 방지하기 위해 보충 포트의 스톱콕이 나머지 두 포트에 고정되어 있는지 확인하십시오.
2. 4.8단계에서 만든 튜브를 입구 및 출구 라인의 스톱콕에 부착합니다.
3. 위 단계에서 연동 튜브를 튜브에 연결합니다. 카세트를 연동 튜브에 고정하고 연동 펌프에 놓습니다. 아직 튜브가 제자리에 있는 카세트를 고정하지 마십시오.
4. 4.7단계의 튜브 하나를 위 단계의 출구 라인의 연동 튜브 끝에 연결합니다. 다른 쪽 끝에 1mL 혈청학적 피펫을 연결합니다. 폐기물 저장소 플라스크에 혈청 학적 피펫으로 부착 된 끝을 매달아 놓습니다.
5. 입구 라인에 대해 4.7단계를 반복합니다. 혈청 피펫에 부착 된 튜브의 끝을 세제 저장소에 매달아 놓습니다. 세제 저장소 플라스크의 개구부를 즉시 파라 필름으로 밀봉하십시오. 탈세포화 회로에 대한 개요는 그림 3A, B 를 참조하십시오.
6. 1 L 유리 용기 (단계 3.2)로부터의 0.25 % SDS를 중간 수준의 바이오 리액터 챔버에 첨가한다.
7. Adson 겸자를 사용하여 조달 된 뒷다리를 가져 와서 생물 반응기 챔버에 조심스럽게 매달아 놓습니다.
8. 두 쌍의 Adson 겸자를 사용하여 뒷다리의 캐뉼러 부분을 입구 라인으로 안내합니다. 한 쌍의 집게로 캐뉼러를 잡고 다른 한 쌍의 집게를 사용하여 입구 라인을 캐뉼라에 비틀고 고정합니다. 캐뉼러가 당겨지거나 꼬이지 않도록 하여 탈환을 방지하십시오.
9. 고정되면 필요에 따라 1L 유리병에서 0.25% SDS를 더 추가하여 팔다리를 완전히 잠깁니다. 일관된 유출이 유지되도록 출구 포트도 생물반응기 저장소에 잠겨 있는지 확인합니다(그림 3C).
10. 일회용 주사기 필터를 생물 반응기 챔버의 뚜껑에있는 환기구에 부착합니다 (단계 4.4 및 단계 4.5를 참조).
11. 바이오리액터의 뚜껑을 고정하고 챔버가 모든 면에서 밀봉되었는지 확인합니다(그림 3B).
12. 튜브에서 공기를 제거하고 관류 회로를 프라이밍하려면 새로운 일회용 10mL 주사기를 사용하여 입구 라인의 3방향 스톱콕을 사용하여 세제 저장소에서 세제를 꺼냅니다.
13. 일단 당겨지면 동일한 유체를 사용하여 출구 라인의 3방향 스톱콕에 삽입합니다. 입구 및 출구 라인 모두에서 튜브 전체에 세제가 있는지 확인하십시오.
14. 튜브가 있는 카세트를 아래로 눌러 연동 펌프에 고정합니다. 전원 버튼을 사용하여 연동 펌프를 켭니다.
    1. 연동 펌프 화면에서 화살표 키를 사용하여 두 번째 탭으로 이동하여 첫 번째 채널의 관류 속도를 설정합니다. 전달 모드로 유속을 입력하고 관류 속도를 1mL/분으로 설정합니다. 장치 설정에 따라 흐름 방향이 올바른지 확인하십시오. 두 번째 채널에 대해 반복합니다.
    2. 입구 라인을 통해 전달되거나 출구 라인에서 가져온 유체의 양이 둘 사이에 일정한 속도로 흐르도록 연동 펌프를 보정합니다. 튜브 ID 가 1.85mm로 설정되어 있는지 확인하십시오.
15. 키패드의 전원 버튼을 눌러 입구 및 출구 라인 모두에 대해 1mL/min의 기계 관류를 통해 탈세포화를 시작합니다. 흐름이 입구 및 출구 라인 모두에서 일관되고 지속되는지 모니터링하고 확인합니다.
16. 탈세포화를 계속하고 매일 모니터링하십시오. 필요에 따라 보충 포트를 통해 1 L의 0.25% SDS(단계 3.2)를 사용하여 바이오리액터 저장소를 보충한다. 5 일째에 나타날 조직의 흰색의 반투명 모양을 찾아 쥐 뒷다리의 탈 세포화를 나타냅니다.

그림 3: 쥐 뒷다리의 관류 탈세포화 생물반응기 회로의 개요. (A) 생물반응기 관류 회로의 개략적 표현. 파란색 화살표는 세제 및 폐기물 흐름의 방향을 나타냅니다. (B) 쥐 뒷다리를 포함하는 생물 반응기를 이용한 탈세포화 회로의 개요. SDS 저장소(왼쪽 플라스크)는 연동 펌프와 바이오리액터의 입구 튜브로 연결됩니다. 유출은 연동 펌프를 통해 폐기물 저장소 (오른쪽 플라스크)에 연결됩니다. (C) (I) 캐뉼러 된 대퇴 동맥에 연결된 입구 튜브가있는 쥐 뒷다리를 포함하는 생물 반응기. (II) 세제 관류 용 모서리에 위치한 보충 포트. (III) 서스펜션 저장소에 부유 된 유출 튜브. 약어 : SDS = 나트륨 도데 실 설페이트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

6. 탈세포화 후 세척 및 살균

1. 탈세포화가 확인되면 세제 저장소를 1x PBS + 1% AA 저장소로 교체합니다. 플라스크의 개구부를 파라 필름으로 밀봉하십시오. 1mL/분에서 1x PBS + 1% AA 관류를 시작하고 2일 동안 계속합니다.
2. 1x PBS + 1% AA 저장소를 200mL의 0.1% PAA/4% EtOH 저장소로 교체하고 1mL/분에서 2시간 동안 관류를 시작합니다.
3. 두 쌍의 멸균 Adson 집게를 사용하여 입구 라인에서 뒷다리를 분리하고 한 쌍의 집게를 사용하여 입구 라인을 비틀고 다른 쌍은 캐뉼러를 잡습니다. 탈환을 방지하기 위해 캐뉼러가 당겨지지 않았는지 확인하십시오.
4. 추가 사용이 될 때까지 4°C에서 1x PBS + 1% AA가 포함된 500mL 유리 병에 사지를 보관하십시오.

조달 프로토콜은 후속 관류 단계를 위해 대퇴 동맥을 분리하고 캐뉼러하는 데 성공했습니다. 그림 1A, B 의 대표적인 해부 이미지는 분기점에서 충분한 거리를 둔 대퇴 혈관의 절개 위치와 노출을 보여줍니다. 도 2 는 바이오리액터 및 관류 회로를 제조하는데 필요한 장치를 나타낸다. 탈세포화의 종점은 조직의 흰색, 반투명과 같은 외관을 관찰함으로써 결정되었습니다. 생체외 기계 관류 시스템은 쥐 뒷다리의 관류 탈세포화에 성공적이었다. 단일 패스 폐쇄 시스템 회로가 유지되었습니다(그림 3). 토착 뒷다리의 총 형태는 0.25% SDS 관류 5일 후 흰색의 창백한 모양으로 변했습니다(그림 4).

세포 내용물의 제거는 핵이 발견되지 않은 대퇴 혈관, 피부, 신경, 뼈 및 근육에서 헤마톡실린 및 에오신 (H & E)으로 염색되었을 때 관찰되었습니다. 각 조직 구조의 구조는 천연 조직에 대해 상대적으로 분석되었습니다. 탈세포화된 대퇴 동맥과 정맥 모두 천연 혈관에 존재하는 청색 염색 핵이 없기 때문에 모든 층과 주변 결합 조직에서 핵 함량의 손실을 보였습니다(그림 5A,B 및 그림 5D,E). 대퇴 정맥과 동맥의 내막, 매질 및 외막은 탈세포화된 혈관에서 유지되었습니다(그림 5D, E). 대퇴 신경은 내신경을 포함하는 조직 구조의 보존을 보였다(도 5C 및 도 5F). 뼈는 탈세포화 후 전체 조직 구조를 유지했으며, 뼈와 주변 내막 및 골막 층에서 염색된 골세포 핵의 손실이 관찰 가능한 것으로 나타났습니다(그림 5G 및 그림 5J). 피부는 표피와 진피에서 세포의 손실을 보였다. 진피는 천연 피부 조직과 유사한 콜라겐 섬유가 유지되는 것으로 나타났습니다 (그림 5H 및 그림 5K). 마지막으로, 골격근의 횡단면도는 endomysium의 주변에 위치한 핵의 손실을 보여주었습니다. 근섬유 함량은 탈세포화 후 각각의 근막 내에서 유지된 상태로 유지되었습니다(그림 5I 및 그림 5L). Picogreen을 사용한 DNA 정량화도 수행되었으며, 여기서 대퇴 혈관, 신경, 피부, 근육 및 뼈에서 DNA 함량이 크게 감소했습니다 (그림 6).

그림 4: 토착 및 탈세포화된 쥐 뒷다리의 총 형태. (A) 조달 후 24G 혈관 카테터로 캐뉼레이션 된 천연 뒷다리의 대퇴 동맥. (B) 0.25 % SDS로 5 일 동안 탈세포 화 한 후 뒷다리의 흰색, 반투명 외관. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: 헤마톡실린과 에오신을 사용한 쥐 뒷다리 조직의 조직학적 염색. H & E 염색 된 천연 (상단 패널) 및 탈 세포 화 (하단 패널) (A, D) 대퇴 정맥 및 (B, E) 동맥, (C, F) 신경, (G, J) 뼈, (H, K) 피부 및 (I, L) 근육. 모든 탈세포화된 샘플에서 볼 수 있는 핵 및 세포 함량의 손실. 스케일 바 = 200μm(혈관, 신경, 뼈) 및 300μm(피부, 근육). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6: 네이티브 및 탈세포화된 쥐 뒷다리 조직의 DNA 정량화. DNA 함량은 ng/mg 건조 중량으로 표시되는 기본 및 탈세포화된 혈관, 신경, 근육, 피부 및 뼈에서 감소합니다. 조직을 건조시키고 65°C에서 밤새 파파인에서 소화시켰다. DNA는 PicoGreen을 사용하여 형광 검출하였다. 여러 개의 쌍을 이루지 않은 t-검정이 수행되었습니다. 데이터는 평균± SD. **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001로 제시되었습니다. 약어 : N = 네이티브; D = 탈세포화. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

저자는 선언 할 이해 상충이 없습니다.