IL-9 발현 T 및 ILC2 세포는 N. brasiliensis 감염 동안 유도되지만, 이들의 특성화는 낮은 빈도 및 차등 동역학으로 인해 감염된 장에서 크게 간과되었습니다. 이 프로토콜은 서로 다른 표적 기관에서 이러한 세포를 분리하고 서로 다른 감염 단계에서 유세포 분석을 통해 신원을 확인하는 방법을 설명합니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
방법 논문
Nippostrongylus brasiliensis 감염 모델에서 IL-9 생성 림프 세포 연구를 위한 전략
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
IL-9는 항 종양 면역, 알레르기 병리의 유도 및 기생충 감염에 대한 면역 반응을 포함한 다양한 과정과 관련된 다면발현 사이토 카인으로 기생충 퇴학에 중요한 역할을합니다. Nippostrongylus brasiliensis 감염의 쥐 모델에서 IL-9는 주로 폐, 소장 및 배액 림프절에서 발견되는 CD4+ T 림프구 및 선천성 림프 세포에 의해 생성됩니다. IL-9의 세포내 염색과 관련된 기술적 어려움과 감염 시 소장에서 조혈 세포를 분리하는 복잡성을 감안할 때, 이 모델의 다양한 림프 및 비림프 조직에서 IL-9의 발현을 분석하기 위한 포괄적이지만 간단한 프로토콜이 절실히 필요합니다. 여기에 설명된 프로토콜은 감염 전반에 걸쳐 종격동 및 장간막 림프절뿐만 아니라 N. brasiliensis가 표적으로 하는 주요 기관인 폐 및 소장에서 CD4+ T 세포와 선천성 림프 세포에 의해 생성되는 IL-9의 동역학을 설명합니다. 또한 관심 있는 세포 유형과 기관에 따라 감염에 필요한 유충의 수를 자세히 설명합니다. 이 프로토콜은 N. brasiliensis 감염 모델에서 관심 있는 특정 세포, 기관 및 질병 단계에 집중할 수 있는 기회를 제공함으로써 시간과 자원을 절약하기 위한 분석의 표준화를 지원하는 것을 목표로 합니다.
서론
십이지장충은 전 세계적으로 약 7억 명의 사람들을 감염시키는 장내 기생충으로, 주로 저개발국의 열대 지역에서 발생합니다. 인간에게 가장 흔한 십이지장충 기생충인 십이지장 충 및 Necator americanus에 의한 고강도 감염은 빈혈과 단백질 결핍을 유발하여 성장과 정신 발달을 지연시킬 수 있습니다1. N. americanus 와 설치류 기생충 Nippostrongylus brasiliensis 는 숙주에서 원형의 제2형 면역 반응을 유도하고 수명 주기에서 유사성을 공유합니다. 따라서 N. brasiliensis 에 의한 생쥐의 감염은 인간 십이지장충 감염에 가장 일반적으로 사용되는 모델입니다. 3 단계 (L3) N. brasiliensis 감염성 유충은 감염 후 처음 몇 시간 동안 피부에서 폐로 이동합니다. 일단 폐에 들어가면 L4가 되어 기관을 따라 이동하여 삼키고 위를 통과하여 장에 도달하여 4-5일 이내에 성인(L5)이 됩니다. 장에서 L5 벌레는 기생충 수명 주기2를 다시 시작하기 위해 대변으로 배설되는 알을 낳습니다.
N. brasiliens....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
여기에 설명 된 모든 동물 실험은 멕시코 국립 자치 대학교 세포 생리학 연구소의 내부 동물 취급위원회 (CICUAL)의 승인을 받았습니다.
참고: 전체 프로토콜의 순서도는 그림 1에 나와 있습니다.
1. 생쥐의 주거
- 8-10주령의 암컷 또는 수컷 생쥐를 12시간 명암 주기로 일정한 온도와 습도를 가진 동물 시설에 수용하고 물과 음식에 임의 로 접근할 수 있습니다.
참고: 이 프로토콜은 이전에 설명한 대로 C57BL/6 배경에서 IL-9 리포터 마우스 균주를 사용합니다4; 그러나, 다른 IL-9 리포터 균주(reporter strain 6,7,8)와 세포내 IL-9 염색(intracellular IL-9 staining)을 사용할 수 있으며, 다양한 결과가 나온다9.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
마우스에 200 L3 단계 N. brasiliensis 유충 또는 가짜 대조군을 위한 PBS를 피하 주사했습니다. 이 프로토콜에 사용된 유충의 수는 림프 조직과 폐의 세포를 검출하는 데 더 많은 양의 벌레가 사용된 이전 보고서와 달리 폐, 림프 조직 및 소장에서 생존 가능한 세포를 분리하기 위해 조정되었습니다. 폐, 종격동 림프절, 장간막 림프절 및 소장을 감염 후 0, 4, 7 및 10일에 채취하여 림프구 분리 및 IL-9 생산 집단의 특성화를 수행했습니다. 총 27마리의 마우스를 분석된 시점 당 9개의 대조군 및 4 내지 6개의 N. 브라질리엔시스-감염된 마우스를 포함하는 2개 이상의 독립적인 실험에 사용하였다. 가짜 감염 대조군은 기저 수를 얻기 위해 모든 실험에 포함되었습니다. 이 프로토콜을 사용하여 IL-9 생성 CD4+ T 세포(이 모델의 대부분 Th9 세포)를 정량화 및 추가 분석을 위해 폐, 장간막 및 종격동 림프절에서 분리할 수 있습니다........
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
장내 기생충-숙주 상호 작용 및 기생충 감염에 대한 면역 반응에 대한 완전한 이해는 조직 리모델링 및 벌레 퇴학 유도에 핵심적인 다양한 세포 집단 및 이펙터 분자의 식별 및 분석이 필요합니다. 토양 매개 기생충 감염은 전 세계 개발 도상국에서 큰 문제입니다. 그러나 최근까지 이 감염의 영향을 받는 주요 기관인 소장에 존재하는 희귀 세포 집단을 분석할 수 있는 프로토콜은 사용할 수 없었습니다5. 이 프로토콜은 N. brasiliensis 감염 동안 폐, 종격동 및 장간막 림프절에서 IL-9 발현 림프 세포의 유세포 분석을 허용하는 이전에 설명한 방법을 다루며, 소장에서 처음으로 이 집단을 식별하는 추가 이점이 있습니다.
이 프로토콜의 성공 여부는 조직 처리 시간에 크게 좌우됩니다. 한 사람당 최대 6 개의 소장 샘플을 한 번에 처리하는 것이 필수적입니다. 다른 장기를 처리해야 하는 경우 다른 사람이 병행하여 처리하는 것이 .......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
저자는 José Luis Ramos-Balderas의 기술 지원에 감사드립니다. 이 작업은 CONACYT(FORDECYT-PRONACE-303027)에서 PLL에 대한 다음 보조금으로 지원되었습니다. OM-P와 EO-M은 CONACYT(각각 736162 및 481437)로부터 펠로우십을 받았습니다. MCM-M은 CONACYT(Estancias Posdoctorales por México 2022(3))로부터 펠로우십을 받았습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| ACK 버퍼 | 홈메이드 | ||
| Attune Nxt 사이토미터 | Thermofisher | ||
| B220 | Biolegend | 103204 | |
| CD11b | Biolegend | 101204 | |
| CD11c | 바이오레전 | 드 117304 | |
| CD19 | 바이오레전 | 115504 | |
| CD4 | 바이오레전 | 드 100404 | |
| CD4 (BV421) | 바이오레전 | 드 100443 | |
| CD45.2 | 바이오레전 | 드 109846 | |
| CD8 | Biolegend | 100703 | |
| CD90.2 | Biolegend | 105314 | |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| DNAse I | Invitrogen | 18068015 | 특정 활성도: ≥ 10 000 단위/mg |
| Facs ARIA II 분류기 | BD Biosciences | ||
| FACS Melody 세포 분류기 | BD Biosciences | ||
| Fc-Block | Biolegend | 101320 | |
| Fc & epsilon; RI | eBioscience | 13589885 | |
| 태아 소 세럼 | Gibco | 26140079 | |
| FlowJo | FlowJo | 유세포 분석 데이터 소프트웨어 | |
| Gr-1 | Tonbo | 305931 | |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Homemade | ||
| IL-9 | biolegend | 514103 | |
| NK1.1& 주의; | Biolegend | 108704 | |
| 나일론 메쉬 | lba | B07HYHHX5V | |
| OptiPrep 밀도 그라디언트 중간 | 시그마 | D1556 | |
| 인산염 완충 식염수 | 집에서 만든 | ||
| RPMI | Gibco | 11875093 | |
| Siglec F | Biolegend | 155512 | |
| Streptavidin | Biolegend | 405206 | |
| TCR-β | Biolegend | 109203 | |
| TCR-&베타; (체육/싸이7) | Biolegend | 109222 | |
| TCR-&감마; &델타; | Biolegend | 118103 | |
| Ter119 | Biolegend | 116204 | |
| Tricine buffer | |||
| 좀비 아쿠아 고정식 생존 가능성 염료 | Biolegend | 423101 |
참고문헌
- Centers for Disease Control and Prevention. Parasites - Hookworm. , (2022).
- Camberis, M., Le Gros, G., Urban, J. Animal model of Nippostrongylus brasiliensis and Heligmosomoides polygyrus. Current Protocols in Immunology. , Chapter 19 (Unit 19.12) (2003).
- Mearns, H., et al.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
