이 프로토콜은 카베올라 매개 세포 횡단 수송 과정에서 세포를 가로질러 양 고추냉이 과산화 효소를 운반하는 인간 망막 미세 혈관 내피 세포의 능력을 측정하여 내부 혈액 망막 장벽 투과성을 평가하는 모델로서 시험관 내 내피 세포 트랜스사이토시스 분석을 보여줍니다.
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방법 논문
내피 세포 트랜스사이토시스 분석법(Endothelial Cell Transcytosis assay)은 내부 혈액-망막 장벽 투과성을 평가하기 위한 시험관 내 모델로서 분석합니다.
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
혈액 망막 장벽 (BRB)의 기능 장애는 여러 혈관 안 질환의 병태 생리학에 기여하여 종종 망막 부종 및 후속 시력 상실을 초래합니다. 내부 혈액-망막 장벽(iBRB)은 주로 생리적 조건에서 투과성이 낮은 망막 혈관 내피로 구성됩니다. 낮은 투과성의이 특징은 인접한 망막 미세 혈관 내피 세포 사이의 낮은 세포 간 수송 속도뿐만 아니라이를 통한 세포 간 수송 (transcytosis)에 의해 엄격하게 조절되고 유지됩니다. 망막 세포 횡단 장벽 투과성의 평가는 건강 및 질병에서 iBRB 무결성에 대한 근본적인 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 이 연구에서는 인간 망막 미세 혈관 내피 세포 (HRMECs)를 사용하여 iBRB 투과성을 평가하기위한 시험관 내 모델로서 내피 세포 (EC) transcytosis 분석을 설명합니다. 이 분석은 수용체 및 카베올라 매개 세포 간 수송 과정에서 각각 트랜스페린 및 양 고추 냉이 퍼 옥시 다제 (HRP)를 수송하는 HRMEC의 능력을 평가합니다. 다공성 막에서 배양 된 완전히 합류 된 HRMEC를 형광 태그 트랜스페린 (클라 트린 의존성 트랜스 사이토 시스) 또는 HRP (카베 올라 매개 트랜스 사이토 시스)와 함께 배양하여 EC 단층 전체의 트랜스사이토 시스 수준을 나타내는 바닥 챔버로 전달 된 트랜스페린 또는 HRP의 수준을 측정했습니다. iBRB를 조절하는 알려진 경로인 Wnt 신호전달은 카베올라 매개 HRP 기반 트랜스사이토시스 분석 방법을 입증하기 위해 조절되었습니다. 여기에 설명된 EC 트랜스사이토시스 분석은 혈관 병리학에서 EC 투과성 및 iBRB 무결성의 분자 조절자를 조사하고 약물 전달 시스템을 스크리닝하는 데 유용한 도구를 제공할 수 있습니다.
서론
인간의 망막은 신체에서 가장 높은 에너지를 요구하는 조직 중 하나입니다. 신경 망막의 적절한 기능을 위해서는 망막 환경을 보호하기 위해 잠재적으로 유해한 다른 분자의 제한된 흐름과 함께 산소와 영양소의 효율적인 공급이 필요하며, 이는 망막 장벽(BRB)1을 통해 매개됩니다. 중추 신경계의 혈액-뇌 장벽(BBB)과 유사하게 BRB는 눈의 선택적 장벽 역할을 하여 망막 안팎으로 이온, 물, 아미노산 및 당의 이동을 조절합니다. BRB는 또한 면역 세포, 항체 및 유해한 병원체와 같은 순환 인자에 대한 노출을 방지함으로써 망막 항상성과 면역 특권을 유지합니다2. BRB 기능 장애는 당뇨병성 망막증, 연령 관련 황반변성(AMD), 미숙아 망막병증(ROP), 망막 정맥 폐색 및 포도막염과 같은 여러 혈관 안 질환의 병태생리학에 기여하여 혈관성 부종 및 후속 시력 상실을 초래합니다 3,4,5.
BRB는 각각 두 개의 별개의 안구 혈관 네트워크에 대한 두 개의 개별 장벽으로 구성됩니다 : 망막 혈관 구조와....
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프로토콜
모든 동물 실험은 광학 현미경 및 EM 이미지 생성을 위해 보스턴 아동 병원의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받았습니다(그림 3). 생체내 연구를 위한 프로토콜은 Wang et al.24로부터 얻을 수 있다. 인간 망막 미세 혈관 내피 세포 (HRMECs)와 관련된 모든 실험은 보스턴 아동 병원의 기관 생물 안전위원회 (IBC)의 승인을 받았습니다.
1. 시약의 제조
- 조직 배양 접시 코팅용 용액: 멸균 조직 배양 등급 1x PBS(pH = 7.4)의 500mL에 젤라틴 원액 1mL(40%-50%)를 용해시켜 0.1% 젤라틴 용액을 준비합니다. 0.22μm 필터를 통해 용액을 여과합니다. 0.1% 젤라틴 용액을 2-8°C에 보관하십시오. 상기 온도에서 멸균 상태에서 무기한 보관할 수 있습니다.
- 성장 배지: 제조업체의 지침(재료 표)에 따라 EGM 보충제를 내피 세포 성장 기저 배지(EBM)에 용해시켜 내피 세포 성장 완전 배지(EGM) 500mL를 준비합니다. 성장 배지를 50mL 튜브에 분취하고 튜브를 4°C에서....
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결과
망막 혈관 내피의 EM 이미지는 생체 내 내피 세포에서 경세포 소포 수송 및 동굴 소포를 보여줍니다.
EC 트랜스사이토시스는 광학 현미경(그림 3A)에서 HRP 함유 혈관을 반사하는 짙은 갈색 침전물이 있는 망막 단면 내에서 생체 내에서 시각화할 수 있으며, 투과 전자 현미경(TEM)을 사용하여 HRP 함유 트랜스사이토시클(그림 3B,C)을 나타내는 전자 밀도 침전물로 시각화할 수 있으므로 iBRB에 걸친 EC 트랜스사이토시스를 입증합니다. 큰 소포는 잠재적으로 거대 피노 사이토 시스 (흰색 화살촉; 도 3B), 및 작은 소포는 카베올라 소포(흰색 화살촉; 그림 3C
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토론
BRB는 망막 건강과 질병에 필수적인 역할을 합니다. 혈관 투과성을 평가하는 시험관 내 기술은 장벽 (BRB / BBB) 발달 및 기능에 관한 연구에서 중요한 도구로 입증되었습니다. 여기에 설명 된 절차는 EC transcytosis의 기초가되는 분자 메커니즘을 연구하거나 BRB 투과성에 영향을 미치는 관련 분자 조절제를 평가하는 데 활용 될 수 있습니다. 시험관 내 EC 트랜스사이토시스 분석은 생체 내 분석 또는 혈관 투과성을 평가하는 데 사용되는 기술에 비해 여러 가지 장점이 있습니다. 높은 처리량으로 빠르게 수행할 수 있으며 유전적 및 약리학적 조절을 통해 다양한 변수 또는 특정 신호 경로의 분리된 분자의 효과를 분석하는 데 활용할 수 있습니다. 순수한 EC 배양 시스템은 생체내에서 종종 관찰되는 바와 같이 동물 변이를 없애고 또한 다른 세포 유형(32)에 의한 표적 분자의 가능한 변형 또는 엔도사이토시스의 효과를 제.......
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공개 사항
저자는 공개 할 이해 상충이나 재정적 이익이 없습니다.
감사의 글
이 작업은 JC에 대한 NIH 보조금(R01 EY028100, EY024963 및 EY031765)의 지원을 받았습니다. ZW는 Knights Templar Eye Foundation Career Starter Grant의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 생물 안전 캐비닛 | Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific | 1286 | |
| 세포 배양 petridish | Nest Biotechnology | 704001 | |
| 원심분리기 | Eppendorf | 5702 | |
| Centrifuge tubes (15 mL) | Corning Inc. | ||
| 352097 원심분리기 튜브(50mL) | Denville Scientific Inc. | C1062-P | |
| 시아닌 3-인간 트랜스페린 | Jackson ImmunoResearch | AB_2337082 | |
| 내피 세포 기저 매체-2 (EBM-2) | Lonza Bioscience | CC-3156 | |
| 내피 세포 성장 매체-2 (EGM-2) SingleQuots 보충제 | Lonza Bioscience | CC-4176 | |
| EVOM 밀리셀 전기 저항 시스템-2 (ERS-2) | Millipore | MERS00002 | |
| 태아 소 혈청 (FBS) | Lonza Bioscience | CC-4102B | |
| 젤라틴 | Sigma-Aldrich | G7765 | |
| 혈구계(2칩) | Bulldog Bio | DHC-N002 | |
| 양고추냉이 과산화효소(HRP) | Sigma-Aldrich | P8250 | |
| 인간 망막 미세혈관 내피 세포(HRMEC) | 세포 시스템 | ACBRI 181 | |
| 인큐베이터 | 열전자 Corporation, Thermo Fisher Scientific | 3110 | |
| L 셀(제어 조절 배지용) | ATCC | CRL-2648 | |
| L Wnt-3A 셀(Wnt3A 조절 배지용) | ATCC | CRL-2647 | |
| 광학 현미경 | Leica | DMi1 | |
| 멀티모드 플레이트 리더 | EnSight, PerkinElmer | ||
| 인산염 완충 식염수(PBS) buffer (1x) | GIBCO | 10010-023 | |
| QuantaBlu Fluorogenic Peroxidase Substrate kit | Thermo Fisher Scientific | 15169 | |
| 재조합 인간 Norrin (rhNorrin) | R& D Systems | 3014-NR | |
| 재조합 인간 혈관 내피 성장 인자(rhVEGF) | R& D Systems | 293-VE | |
| 주사기 필터(0.22 &마이크로; m) | Millipore | SLGP033RS | |
| Transwell 삽입 (6.5 mm transwell, 0.4 µ m pore polyester membrane insert)코 | 닝(주 | CLS3470-48EA | |
| 트립신-EDTA (0.25%) (1x) | GIBCO | 25-200-072 | |
| 수조 | 정밀, Thermo Fisher Scientific | 51221060 | |
| XAV939 (Wnt/β-catenin 억제제) | Selleckchem | S1180 |
참고문헌
- Diaz-Coranguez, M., Ramos, C., Antonetti, D. A. The inner blood-retinal barrier: Cellular basis and development. Vision Research. 139, 123-137 (2017).
- Campbell, M., Humphries, P. The blood-retina barrier: Tight junctions and barrier modulation. <....
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재인쇄 및 허가
