이 프로토콜은 Flt3L 발현 B16-F10 흑색종으로 세포 기반 종양 백신 접종을 사용하는 암 면역 요법 모델을 제시합니다. 이 프로토콜은 배양된 종양 세포의 준비, 종양 이식, 세포 조사, 종양 성장 측정, 종양내 면역 세포의 분리 및 유세포 분석을 포함한 절차를 보여줍니다.
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이 논문에서
요약
초록
Fms 유사 티로신 키나제 3 리간드 (Flt3L)는 수지상 세포 (DCs)의 생존 및 분화를 촉진하는 조혈 사이토 카인이다. 선천성 면역을 활성화하고 항 종양 반응을 향상시키기 위해 종양 백신에 사용되었습니다. 이 프로토콜은 종양 미세 환경 (TME)에서 면역 세포의 표현형 및 기능 분석과 함께 Flt3L 발현 B16-F10 흑색 종 세포로 구성된 세포 기반 종양 백신을 사용하는 치료 모델을 보여줍니다. 배양된 종양 세포 준비, 종양 이식, 세포 조사, 종양 크기 측정, 종양내 면역 세포 단리, 및 유세포분석을 위한 절차가 기재되어 있다. 이 프로토콜의 전반적인 목표는 전임상 고형 종양 면역 요법 모델과 종양 세포와 침윤 면역 세포 간의 관계를 연구하기위한 연구 플랫폼을 제공하는 것입니다. 여기에 기술된 면역요법 프로토콜은 흑색종의 암 치료 효과를 개선하기 위해 면역 체크포인트 차단 (항-CTLA-4, 항-PD-1, 항-PD-L1 항체) 또는 화학요법과 같은 다른 치료 양식과 조합될 수 있다.
서론
암 면역 요법은 독성이 적은 부작용과 더 지속적인 반응을 기반으로 유망한 치료 전략으로 인식되어 왔습니다. 종양 용해 바이러스 요법, 암 백신, 사이토 카인 요법, 단일 클론 항체, 입양 세포 전달 (CAR-T 세포 또는 CAR-NK) 및 면역 체크 포인트 차단1을 포함하는 여러 유형의 면역 요법이 개발되었습니다.
암 백신의 경우 전체 세포 기반 백신, 단백질 또는 펩타이드 백신, RNA 또는 DNA 백신과 같은 다양한 형태의 치료 백신이 있습니다. 백신 접종은 종양 특이 항원을 포함한 종양 항원을 처리하고 T 세포에 면역 원성 형태로 제시하는 항원 제시 세포 (APC)의 능력에 의존합니다. 수지상 세포(DC)는 가장 강력한 APC로 알려져 있으며 항종양 면역에 중요한 역할을 하는 것으로 믿어집니다 2,3. 이 세포는 종양 항원을 흡수하고 처리 한 다음 배수 림프절 (dLN)으로 이동하여 T 세포 수용체 (TCR) 및 공동 자극 분자의 결합을 통해 종양 특이 적 T 이펙터 (Teff) 세포를 프라이밍하고 활성화합니다. 그 결과 종양 특이적 세포독성 T 세포(CTL)의 분화 및 확장이 일어나 종양에 침투하여종양 세포를 사멸시킵니다4. 결과적으로, DC의 활성화 및 성숙은 종양 항원에 대한 면역을 자극하는 매력적인 전략을 나타낸다.
Flt3L은 MHC 클래스 II, CD11c, DEC205 및 CD86 단백질5를 발현하는 기능적으로 성숙한 DC의 성숙 및 확장을 촉진하는 것으로 알려져 있다. Flt3L 유전자(Adv-Flt3L)를 포함하는 아데노바이러스 벡터의 정맥내 투여는 오르토픽 종양에 대한 면역 치료 활성을 촉진하는 것으로나타났습니다6. Flt3L은 또한 DC에 의한 종양 항원의 교차 제시를 향상시켜 항종양 반응을 증가시키는 방법으로 후방바이러스 형질도입된 Flt3L을 안정적으로 발현하는 방사선 조사된 B16-F10 세포로 구성된 종양 세포 기반 백신에 사용되었습니다. 여기에 설명된 B16-Flt3L 종양 백신 접종 프로토콜은 James Allison 박사의 그룹7에서 발표한 연구를 기반으로 합니다. 이 논문에서 그들은 CTLA-3 차단과 결합 된 B4-Flt4L 백신이 상승적으로 확립 된 흑색 종의 거부를 유도하여 생존율을 증가 시킨다고보고했습니다.
이 프로토콜의 목표는 흑색종에 대한 전임상 면역요법 모델을 제공하는 것입니다. 여기에서는 종양 백신을 제조하고 이식하는 방법과 고형 종양으로부터 종양 내 면역 세포의 구성과 기능을 분석하는 방법에 대한 자세한 절차를 설명합니다.
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프로토콜
연구에 사용 된 모든 마우스는 온도와 습도가 제어 된 특정 병원체가없는 조건에서 La Jolla Institute for Immunology (LJI)의 동물 사육장에 보관 및 보관되었습니다. 동물 실험은 LJI 동물 관리 위원회에서 승인한 지침 및 프로토콜에 따라 8-14주령 암컷 C57BL/6 마우스로 수행되었습니다.
1. 이식용 배양된 종양세포의 제조
- 10% 열 불활성화 FBS, 2mM 글루타민, 1mM 나트륨 피루브산, 1mM MEM 비필수 아미노산 및 각각 100U/mL의 페니실린과 스트렙토마이신을 포함하는 Iscove의 변형된 Dulbecco's 배지(IMDM)에서 B16-F10 흑색종 세포를 배양합니다. 세포주를 5%CO2 하에 37°C에서 유지한다.
- 175T 플라스크에 1.5-2 x 106 B16-F10 세포를 시드하고 2일 동안 배양하였다. 세포가 75%-80% 합류할 때 수확합니다.
- 배양액을 제거하고 플라스크를 PBS로 1회 세척한다. PBS를 흡입하고 0.25% 트립신-EDTA 5mL를 추가한 다음 배양 플라스크의 가장자리를 세게 두드립니다.
- 트립신-EDTA를 중화하기 위해 배양액 15mL를 추가하고 플라스크의 내용물을 50mL 원심분리 튜브에 붓습니다. 10mL의 PBS로 접시 표면을 씻고 동일한 50mL 튜브에 붓습니다.
- 세포를 200 x g에서 5분 동안 원심분리합니다. 상청액을 버리고 튜브 바닥을 손가락으로 두드려 세포 펠릿을 깨뜨립니다.
- 차가운 PBS 10mL를 넣고 세포 현탁액을 부드럽게 피펫합니다. 그런 다음 혈구계를 사용하여 수동으로 세포를 계산합니다. 주사하기 전에 세포를 얼음 위에 두십시오.
2. 종양 이식
- 가스는 흄 후드에서 분당 1.0L의 가스 유량으로 5% 이소플루란으로 마우스를 마취합니다. 유속을 마우스가 완전히 마취되면 2% 이소플루란의 유지 용량으로 변경합니다. 이 프로토콜의 경우 기관 동물 관리 및 사용 지침에 따라 수의사가 마취를 수행했습니다.
- 생쥐의 왼쪽 옆구리에있는 머리카락을 면도하고 알코올 물티슈를 사용하여 주사 부위를 소독하십시오. 30 G 바늘을 사용하여 왼쪽 옆구리에 5 μL의 차가운 PBS에 B16-F10 종양 세포를 5 x 105 세포에 피내(i.d.) 이식한다.
참고: 이식된 B16-F10 종양 세포의 용량은 성공적인 종양 발달을 위해 0.5-5 x 105 세포 범위에서 조정해야 할 수 있습니다. - 이식 후 전자 디지털 캘리퍼를 사용하여 일주일에 세 번 종양 길이와 너비를 측정합니다. 공식을 사용하여 종양 부피 (mm3)를 계산하십시오.
종양 부피 (mm3) = 폭2 × 길이 × 0.5
종양이 ≥2mm의 크기에 도달하면 종양 백신으로 마우스를 치료하십시오.
참고: 종양은 일반적으로 5 x 105 종양 세포를 이식한 후 3일째에 측정할 수 있습니다. 더 빠른 B16-F10 종양 성장 속도는 수컷 C57BL/6, Rag1-/- 또는 Rag2-/-γc-/-마우스에서 관찰되었습니다. 유사한 관찰이 다른 연구8에서 설명되었다. 마우스의 성별을 일관되게 유지하는 것이 좋습니다. 그러나 NIH는 생물 의학 연구에서 중요한 생물학적 변수로성에 중점을 둡니다.
3. Flt3L 발현 B16-F10(B16-Flt3L) 세포의 백신 제조 및 주사
- B16-Flt3L 세포를 5%CO2 하에 37°C에서 8% 열 불활성화된 FBS, 2mM 글루타민, 및 각각 100U/mL의 페니실린 및 스트렙토마이신을 함유하는 DMEM 중에 유지한다.
- 1 x 106 B16-Flt3L 세포를 175T 플라스크에 시드하고 2일 동안 배양하였다. 1.3-1.6단계에 설명된 대로 75%-80% 합류할 때 세포를 수확하고 1mL의 차가운 PBS에 현탁합니다.
- 160kV 및 25mA 파라미터 설정의 X선 조사기를 사용하여 150Gy 용량의 감마선으로 세포를 조사합니다. 주사 전에 트리판 블루 염색에 의해 세포 생존율을 계수하고 확인하였다.
- 가스는 앞에서 설명한대로 마우스를 마취시키고 알코올 물티슈를 사용하여 주사 부위를 멸균합니다. 마우스에 1 x 10 6 조사된 B16-Flt3L 세포를 50μL의 차가운 PBS에 원래 종양 이식과 동일한 측면에 피내 주사하고, 초기 세포 이식 후 3,6 , 9일에 원발성 종양 부위에서 ~1cm 떨어져 있습니다.
- 원발성 종양과 구별하기 위해 백신 주사 부위를 컬러 펜으로 표시하십시오.
참고: 0.5 x 105 B16-F10 세포를 처음 이식하는 경우 8, 11, 14일에 백신 치료를 수행하는 것이 좋습니다.
4. 종양 내 면역 세포 분리
- 희생 마우스를CO2 를 사용하여 실험 종료시에 흄 후드에서 자궁 경부 탈구를 (종양 이식 후 15일째; 그림 1).
- 각 마우스에서 피부로 종양을 외과적으로 제거하고 1mL 10% FBS/RPMI-1640 배지가 있는 24웰 플레이트에 넣습니다. 무게를 측정하기 전에 종이 타월로 종양을 말리십시오.
- 종양을 작은 조각으로 자릅니다. 2mL의 분해 완충액(RPMI-1640 배지에서 100μg/mL TL 리베라제 및 200μg/mL DNase I)을 추가하고 37°C에서 25분 동안 배양합니다.
- 소화를 멈추기 위해 10% FBS/RPMI-1640 배지 10mL를 추가합니다. 25mL 혈청학적 피펫을 사용하여 세포를 옮기고 1mL 주사기의 플런저를 사용하여 40μm 세포 여과기의 조직을 분쇄합니다.
- 세포를 500 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 펠릿을 PBS 중 40% 밀도 구배 특이적 배지 5mL에 재현탁하고 1x 농도로 희석합니다.
- PBS를 함유하는 80% 농도 구배 특이적 배지 5mL 위에 세포 현탁액을 천천히 첨가한다. 실온(RT)에서 23분 동안 낮은 브레이크 설정으로 325 x g 에서 셀을 원심분리합니다.
- 원심분리 후, 40 %와 80 % 밀도 구배 특이 적 배지 사이의 계면에서 백혈구 층을 조심스럽게 수집하고 40 μm 세포 스트레이너를 통과시킵니다. 세포를 500 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다.
- 펠릿을 2mL의 적혈구(RBC) 용해 완충액에 RT에서 5분 동안 배양합니다. 배양 후 10% FBS/RPMI-1640 배지 10mL를 추가하여 RBC 용해 완충액을 퀀칭합니다.
- 세포를 500 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 세포를 0.5mL의 10% FBS/RPMI-1640 배지에 재현탁하고 추가 분석을 위해 사용하기 전에 총 세포 수를 계산합니다.
참고: 유세포분석 분석에 의한 면역 세포 하위세트의 게이팅 전략을 위한 대조군으로서 비장 또는 dLN을 수집한다. 위에서 설명한 대로 세포 분리 방법을 따르고 다음과 같이 변경합니다. 1mL 주사기의 플런저를 사용하여 70μm 메쉬 필터에서 조직을 분쇄합니다. 단일 세포 현탁액을 얻기 위해 10% FBS/RPMI-1640 배지로 조직을 세척합니다. 설명된 대로 RBC를 용해합니다.
5. 유세포 분석
참고: 백혈구 층에서 채취한 세포에는 면역 세포와 종양 세포가 포함되어 있습니다. 두 개의 독립적 인 염색 패널을 권장합니다.
- 표면 염색
- 세포를 96웰 V자형 바닥판으로 옮깁니다. 세포를 PBS로 세척하고 RT에서 15분 동안 세포 생존율 염료(50-100μL/웰)로 염색합니다.
- 세포를 500 x g에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 표면 마커를 FACS 완충액(PBS에서 1% FBS 및 0.05%NaN3 PBS)에서 혼합된 항체(재료 표에 제공됨)로 얼음(50-100μL/웰)에서 30분 동안 염색합니다.
- 세포를 500 x g 에서 5분 동안 원심분리하고 FACS 완충액으로 두 번 세척합니다.
- 세포를 세포 고정 완충액(50-100μL/웰)으로 얼음 위에서 35분 동안 고정합니다. 세포를 500 x g 에서 5분 동안 원심분리하고 FACS 완충액으로 두 번 세척합니다.
- 샘플을 4 ° C에서 FACS 버퍼 (150-200 μL / 튜브)에 보관하고 빛으로부터 보호하십시오. 유세포분석기에서 샘플을 수집합니다. DC 및 T 세포 집단의 경우 그림 2B 및 그림 3A에 제공된 게이팅 전략을 따릅니다.
참고: 골수성 DC의 염색을 위해, 표면 항체 배양(단계 5.1.2) 전에 얼음 위에서 15분 동안 FC-차단제(쥐 항-마우스 CD16/CD32)를 배양하는 것이 좋습니다.
- 생체 외 재자극 시 사이토카인 분석
- 세포를 완전 배지(10% FBS, 10mM hepes, pH 7.2-7.6, 0.1mM 비필수 아미노산, 1mM 나트륨 피루베이트, 각각 100U/mL 페니실린 및 스트렙토마이신, 50μM 2-메르캅토에탄올 및 2mM L-글루타민으로 보충된 RPMI-1640)에 플레이팅하고 5%CO2 하에 37°C에서 4시간 동안 단백질 수송 억제제가 있는 상태에서 50ng/mL의 PMA와 1μM 이오노마이신으로 자극합니다.
- 단계 5.1에서 위에서 설명한 대로 표면 마커에 대한 표면 염색을 수행합니다.
- 투과화 용액(50-100 μL/웰)을 추가하고 세포 내 염색을 위해 RT에서 5분 동안 배양합니다. 사이토카인 또는 핵 단백질에 특이적인 항체와 함께 세포를 투과화 용액(50-100μL/웰)에서 얼음 위에서 60분 동안 또는 4°C에서 밤새 배양합니다.
- 세포를 500 x g 에서 5분 동안 원심분리하고 FACS 완충액으로 두 번 세척합니다. 샘플을 4 ° C에 보관하고 빛으로부터 보호하십시오. 유세포분석기에서 샘플을 수집합니다.
참고: 항체 희석은 최적의 염색을 위해 필요에 따라 조정해야 할 수 있습니다.
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결과
이식된 B16-F10 세포의 눈에 보이는 검은 점은 일반적으로 종양 이식 후 ~3일 후에 피부 표면에서 관찰됩니다. 마우스는 종양 결절이 ≥2 mm의 크기에 도달한 후 3, 6, 및 9일 후에 종양 백신으로 치료된다. 우리는 종양 이식 후 ~ 2 주 후에 백신 접종 된 마우스 그룹에서 종양 성장의 현저한 감소를 관찰했습니다 (그림 1). 실험이 끝나면 종양 내 면역 세포를 분리하고 상기와 같이 짧은 시험관 내 자극 후 사이토 카인 생산뿐만 아니라 그 수 및 세포 표면 마커 발현을 분석했습니다. 백혈구 층으로부터 수집된 세포는 여전히 많은 종양 세포를 함유하고, 림프구 집단을 용이하게 정의하는 것을 다소 어렵게 만든다. 따라서 유세포 분석 분석에서 종양 내 면역 세포 하위 세트의 적절한 게이팅을 위해 병렬 비장 세포에서 사용하는 것이 좋습니다 (그림 2A). 여기에서는 보상 매트릭스(표 1 및 ...
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토론
여기에 설명된 프로토콜은 Allison 그룹의 연구를 기반으로 합니다. 그들은 B16-Flt3L 백신과 CTLA-4 차단의 조합이 생존율과 종양 성장에 시너지 효과를 보인 반면, B16-Flt3L 백신 또는 항 CTLA-4 항체 단독 치료를받은 마우스에서는 종양 성장의 감소가 보이지 않았 음을 입증했다7. 최근 연구에 따르면 Treg11의 접촉 의존적 억제 활성을 조절하는 데 중요한 필수 역할을하는 새로운 Treg- 내인성 CTLA4-PKCη 신호 전달 경로가 밝혀졌습니다. B16-Flt3L 백신 단독 처리 또는 Treg 특이적 PKCη 결실이 있는 백신 조합 모두 Allison의 연구에서(1 x 104) 세포보다 더 많은 수(0.5-5 x 105)의 B16-F10 흑색종 세포를 이식했을 때 종양의 성장을 유의하게 감소시켰습니다. 흑색 종 세포 또는 생쥐의 출처의 미묘한 차이가이 차이를 설명 할 수 있습니...
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
B16-Flt3L 세포를 제공한 Stephen Schoenberger 박사와 LJI 동물 및 유세포분석 시설의 직원들에게 탁월한 지원을 해주셔서 감사합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.25% 트립신-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 10% 열 비활성화 FBS | Omega Scientific | FB-02 | 로트# 209018 |
| 30G 바늘 | BD Biosciences | 305106 | |
| 96 웰 V-모양-바닥 플레이트 | SARSTEDT | 83.3926.500 | |
| B16 세포주 Fms-like 티로신 키나아제 3 리간드 (B16-Flt3L)를 발현하는 세포주 | Dr. Stephen Schoenberger, LJI | Flt3L cDNA는 참조 5, 보충 그림 1 | |
| B16-F10 세포주 | ATCC | CRL-6475 | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | ||
| Cytofix 고정 완충액 | BD Biosciences | BDB554655 | 세포 고정 완충액 (4.2% PFA) |
| Cytofix/Cytoperm 키트 | BD Biosciences | 554714 | 고정/투과화 솔루션 키트 |
| DNase I | Sigma | 11284932001 | |
| Dulbecco의 Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning | 10013CV | |
| 전자 디지털 캘리퍼 | Fisherbrand | 14-648-17 | |
| FlowJo 소프트웨어 | Tree Star | 유세포 분석기 데이터 분석 | |
| GolgiStop (단백질 수송 억제제) | BD Biosciences | 554724 | 1:1500 희석 |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| Ionomycin | Sigma | I0634 | |
| Iscove' s 수정된 Dulbecco' Thermo | Fisher | 12440053 | |
| LSR-II 사이토미터 | BD Biosciences | 플로우 사이토미터 | |
| MEM 비필수 아미노산 | Gibco | 11140-050 | |
| 페니실린 및 스트렙토마이신 | Gibco | 15140-122 | |
| Percoll | GE Healthcare Life Sciences | GE17-0891-02 | 밀도 구배 특정 매체 |
| PMA | Sigma P1585 | ||
| 적혈구 용해 완충액 Hybri-Max 액체 | Sigma | R7757-100ML | |
| RPMI 1640 매체 | Corning | 10-040-CV | |
| RS2000 X선 조사기 | Rad Source Technologies | ||
| 피루브산 | 나트륨Gibco | 11360-070 | |
| 멸균 셀 스트레이너 40 μ m | Fisherbrand | 22-363-547 | |
| 멸균 세포 여과기 70 μ m | Fisherbrand | 22-363-548 | |
| TL Liberase | Roche | 477530 | |
| Zombie Aqua fixable viability kit | BioLegend | 423101 | |
| 항체 | |||
| Anti-mCD45 | BioLegend | 103135 | 클론: 30-F11 형광단: BV570 희석: 1:200 |
| Anti-mCD3ε | BioLegend | 100327 | 클론: 145-2C11 형광단: PerCP-Cy5.5 희석: 1:200 |
| Anti-mCD8 | BioLegend | 100730 100724 | 클론: 53-6.7 형광단: Alexa Fluor 700, Alexa Fluor 647 희석: 1:200 |
| Anti-mCD4 | BioLegend | 100414 | 클론: GK1.5 형광단: APC-Cy7 희석: 1:200 |
| Anti-mFoxp3 | Thermo Fisher Scientific | 11577382 | 클론: FJK-16s 형광단: FITC 희석: 1:100 |
| Anti-m/hGzmB | BioLegend | 372208 | 클론: QA16A02 형광단: PE 희석: 1:100 |
| Anti-mIFNg | BioLegend | 505826 | 클론: XMG1.2 형광단: PE-Cy7 희석: 1:100 |
| Anti-mCD19 | BioLegend | 115543 | 클론: 6D5 형광단: BV785 희석: 1:100 |
| Anti-mGr1 | BioLegend | 108423 | 클론: RB6-8C5 형광단: APC/Cy7 희석: 1:200 |
| Anti-mCD11b | BioLegend | 101223 | 클론: M1/70 형광단: Pacific blue 희석: 1:100 |
| Anti-mF4/80 | BioLegend | 123114 | 클론: BM8 형광단: PECy7 희석: 1:100 |
| Anti-mCD11c | BioLegend | 117328 | 클론: N418 형광단: PerCP Cy5.5 희석: 1:100 |
| Anti-mMHCII | BioLegend | 107622 | 클론: M5/114.15.2 형광단: AF700 희석: 1:400 |
| Anti-mCD103 | BioLegend | 121410 | 클론: 2E7 형광단: Alexa Fluor 647 희석: 1:200 |
| Anti-mCD86 | BioLegend | 105007 | 클론: GL-1 형광단: PE 희석: 1:200 |
| FC 차단제(Rat 안티 마우스 CD16/CD32) | BD Biosciences | 553141 | 클론: 2.4G2 희석: 1:200 |
참고문헌
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- Martinez-Lostao, L., Anel, A., Pardo, J. How do cytotoxic lymphocytes kill cancer cells. Clinical Cancer Research. 21 (22), 5047-5056 (2015).
- Maraskovsky, E., et al. Dramatic increase in the numbers of functionally mature dendritic cells in Flt3 ligand-treated mice: multiple dendritic cell subpopulations identified. Journal of Experimental Medicine. 184 (5), 1953-1962 (1996).
- Talmadge, J. E., et al. Intratumoral, injection of adenoviral Flt3 ligand has therapeutic activity in association with increased intratumoral levels of T cells but not dendritic cells. Blood. 104 (11), 5280(2004).
- Curran, M. A., Allison, J. P. Tumor vaccines expressing flt3 ligand synergize with ctla-4 blockade to reject preimplanted tumors. American Association for Cancer Research. 69 (19), 7747-7755 (2009).
- Simon, S. R., Ershler, W. B. Hormonal influences on growth of B16 murine melanoma. Journal of the National Cancer Institute. 74 (5), 1085-1088 (1985).
- Broz, M. L., et al. Dissecting the tumor myeloid compartment reveals rare activating antigen-presenting cells critical for T cell immunity. Cancer Cell. 26 (6), 938(2014).
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- Kong, K. F., et al. Protein kinase C-eta controls CTLA-4-mediated regulatory T cell function. Nature Immunology. 15 (5), 465-472 (2014).
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