이 프로토콜은 Flt3L 발현 B16-F10 흑색종으로 세포 기반 종양 백신 접종을 사용하는 암 면역 요법 모델을 제시합니다. 이 프로토콜은 배양된 종양 세포의 준비, 종양 이식, 세포 조사, 종양 성장 측정, 종양내 면역 세포의 분리 및 유세포 분석을 포함한 절차를 보여줍니다.
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이 논문에서
요약
초록
Fms 유사 티로신 키나제 3 리간드 (Flt3L)는 수지상 세포 (DCs)의 생존 및 분화를 촉진하는 조혈 사이토 카인이다. 선천성 면역을 활성화하고 항 종양 반응을 향상시키기 위해 종양 백신에 사용되었습니다. 이 프로토콜은 종양 미세 환경 (TME)에서 면역 세포의 표현형 및 기능 분석과 함께 Flt3L 발현 B16-F10 흑색 종 세포로 구성된 세포 기반 종양 백신을 사용하는 치료 모델을 보여줍니다. 배양된 종양 세포 준비, 종양 이식, 세포 조사, 종양 크기 측정, 종양내 면역 세포 단리, 및 유세포분석을 위한 절차가 기재되어 있다. 이 프로토콜의 전반적인 목표는 전임상 고형 종양 면역 요법 모델과 종양 세포와 침윤 면역 세포 간의 관계를 연구하기위한 연구 플랫폼을 제공하는 것입니다. 여기에 기술된 면역요법 프로토콜은 흑색종의 암 치료 효과를 개선하기 위해 면역 체크포인트 차단 (항-CTLA-4, 항-PD-1, 항-PD-L1 항체) 또는 화학요법과 같은 다른 치료 양식과 조합될 수 있다.
서론
암 면역 요법은 독성이 적은 부작용과 더 지속적인 반응을 기반으로 유망한 치료 전략으로 인식되어 왔습니다. 종양 용해 바이러스 요법, 암 백신, 사이토 카인 요법, 단일 클론 항체, 입양 세포 전달 (CAR-T 세포 또는 CAR-NK) 및 면역 체크 포인트 차단1을 포함하는 여러 유형의 면역 요법이 개발되었습니다.
암 백신의 경우 전체 세포 기반 백신, 단백질 또는 펩타이드 백신, RNA 또는 DNA 백신과 같은 다양한 형태의 치료 백신이 있습니다. 백신 접종은 종양 특이 항원을 포함한 종양 항원을 처리하고 T 세포에 면역 원성 형태로 제시하는 항원 제시 세포 (APC)의 능력에 의존합니다. 수지상 세포(DC)는 가장 강력한 APC로 알려져 있으며 항종양 면역에 중요한 역할을 하는 것으로 믿어집니다 2,3. 이 세포는 종양 항원을 흡수하고 처리 한 다음 배수 림프절 (dLN)으로 이동하여 T 세포 수용체 (TCR) 및 공동 자극 분자의 결합을 통해 종양 특이 적 T 이펙터 (Teff) 세포를 프라이밍하고 활성화합니다. 그 결과 종양 특이적 세포독성 T 세포(CTL)의 분화 및 확장이 일어나 종양에....
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프로토콜
연구에 사용 된 모든 마우스는 온도와 습도가 제어 된 특정 병원체가없는 조건에서 La Jolla Institute for Immunology (LJI)의 동물 사육장에 보관 및 보관되었습니다. 동물 실험은 LJI 동물 관리 위원회에서 승인한 지침 및 프로토콜에 따라 8-14주령 암컷 C57BL/6 마우스로 수행되었습니다.
1. 이식용 배양된 종양세포의 제조
- 10% 열 불활성화 FBS, 2mM 글루타민, 1mM 나트륨 피루브산, 1mM MEM 비필수 아미노산 및 각각 100U/mL의 페니실린과 스트렙토마이신을 포함하는 Iscove의 변형된 Dulbecco's 배지(IMDM)에서 B16-F10 흑색종 세포를 배양합니다. 세포주를 5%CO2 하에 37°C에서 유지한다.
- 175T 플라스크에 1.5-2 x 106 B16-F10 세포를 시드하고 2일 동안 배양하였다. 세포가 75%-80% 합류할 때 수확합니다.
- 배양액을 제거하고 플라스크를 PBS로 1회 세척한다. PBS를 흡입하고 0.25% 트립신-EDTA 5mL를 추가한 다음 배양 플라스크의 가장자리를 세게 두드립니다.
- 트립신-EDTA를 중화하기 위해 배양액 1....
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결과
이식된 B16-F10 세포의 눈에 보이는 검은 점은 일반적으로 종양 이식 후 ~3일 후에 피부 표면에서 관찰됩니다. 마우스는 종양 결절이 ≥2 mm의 크기에 도달한 후 3, 6, 및 9일 후에 종양 백신으로 치료된다. 우리는 종양 이식 후 ~ 2 주 후에 백신 접종 된 마우스 그룹에서 종양 성장의 현저한 감소를 관찰했습니다 (그림 1). 실험이 끝나면 종양 내 면역 세포를 분리하고 상기와 같이 짧은 시험관 내 자극 후 사이토 카인 생산뿐만 아니라 그 수 및 세포 표면 마커 발현을 분석했습니다. 백혈구 층으로부터 수집된 세포는 여전히 많은 종양 세포를 함유하고, 림프구 집단을 용이하게 정의하는 것을 다소 어렵게 만든다. 따라서 유세포 분석 분석에서 종양 내 면역 세포 하위 세트의 적절한 게이팅을 위해 병렬 비장 세포에서 사용하는 것이 좋습니다 (그림 2A). 여기에서는 보상 매트릭스(표 1 및 .......
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토론
여기에 설명된 프로토콜은 Allison 그룹의 연구를 기반으로 합니다. 그들은 B16-Flt3L 백신과 CTLA-4 차단의 조합이 생존율과 종양 성장에 시너지 효과를 보인 반면, B16-Flt3L 백신 또는 항 CTLA-4 항체 단독 치료를받은 마우스에서는 종양 성장의 감소가 보이지 않았 음을 입증했다7. 최근 연구에 따르면 Treg11의 접촉 의존적 억제 활성을 조절하는 데 중요한 필수 역할을하는 새로운 Treg- 내인성 CTLA4-PKCη 신호 전달 경로가 밝혀졌습니다. B16-Flt3L 백신 단독 처리 또는 Treg 특이적 PKCη 결실이 있는 백신 조합 모두 Allison의 연구에서(1 x 104) 세포보다 더 많은 수(0.5-5 x 105)의 B16-F10 흑색종 세포를 이식했을 때 종양의 성장을 유의하게 감소시켰습니다. 흑색 종 세포 또는 생쥐의 출처의 미묘한 차이가이 차이를 설명 할 수 있습니.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
B16-Flt3L 세포를 제공한 Stephen Schoenberger 박사와 LJI 동물 및 유세포분석 시설의 직원들에게 탁월한 지원을 해주셔서 감사합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.25% 트립신-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 10% 열 비활성화 FBS | Omega Scientific | FB-02 | 로트# 209018 |
| 30G 바늘 | BD Biosciences | 305106 | |
| 96 웰 V-모양-바닥 플레이트 | SARSTEDT | 83.3926.500 | |
| B16 세포주 Fms-like 티로신 키나아제 3 리간드 (B16-Flt3L)를 발현하는 세포주 | Dr. Stephen Schoenberger, LJI | Flt3L cDNA는 참조 5, 보충 그림 1 | |
| B16-F10 세포주 | ATCC | CRL-6475 | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | ||
| Cytofix 고정 완충액 | BD Biosciences | BDB554655 | 세포 고정 완충액 (4.2% PFA) |
| Cytofix/Cytoperm 키트 | BD Biosciences | 554714 | 고정/투과화 솔루션 키트 |
| DNase I | Sigma | 11284932001 | |
| Dulbecco의 Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning | 10013CV | |
| 전자 디지털 캘리퍼 | Fisherbrand | 14-648-17 | |
| FlowJo 소프트웨어 | Tree Star | 유세포 분석기 데이터 분석 | |
| GolgiStop (단백질 수송 억제제) | BD Biosciences | 554724 | 1:1500 희석 |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| Ionomycin | Sigma | I0634 | |
| Iscove' s 수정된 Dulbecco' Thermo | Fisher | 12440053 | |
| LSR-II 사이토미터 | BD Biosciences | 플로우 사이토미터 | |
| MEM 비필수 아미노산 | Gibco | 11140-050 | |
| 페니실린 및 스트렙토마이신 | Gibco | 15140-122 | |
| Percoll | GE Healthcare Life Sciences | GE17-0891-02 | 밀도 구배 특정 매체 |
| PMA | Sigma P1585 | ||
| 적혈구 용해 완충액 Hybri-Max 액체 | Sigma | R7757-100ML | |
| RPMI 1640 매체 | Corning | 10-040-CV | |
| RS2000 X선 조사기 | Rad Source Technologies | ||
| 피루브산 | 나트륨Gibco | 11360-070 | |
| 멸균 셀 스트레이너 40 μ m | Fisherbrand | 22-363-547 | |
| 멸균 세포 여과기 70 μ m | Fisherbrand | 22-363-548 | |
| TL Liberase | Roche | 477530 | |
| Zombie Aqua fixable viability kit | BioLegend | 423101 | |
| 항체 | |||
| Anti-mCD45 | BioLegend | 103135 | 클론: 30-F11 형광단: BV570 희석: 1:200 |
| Anti-mCD3ε | BioLegend | 100327 | 클론: 145-2C11 형광단: PerCP-Cy5.5 희석: 1:200 |
| Anti-mCD8 | BioLegend | 100730 100724 | 클론: 53-6.7 형광단: Alexa Fluor 700, Alexa Fluor 647 희석: 1:200 |
| Anti-mCD4 | BioLegend | 100414 | 클론: GK1.5 형광단: APC-Cy7 희석: 1:200 |
| Anti-mFoxp3 | Thermo Fisher Scientific | 11577382 | 클론: FJK-16s 형광단: FITC 희석: 1:100 |
| Anti-m/hGzmB | BioLegend | 372208 | 클론: QA16A02 형광단: PE 희석: 1:100 |
| Anti-mIFNg | BioLegend | 505826 | 클론: XMG1.2 형광단: PE-Cy7 희석: 1:100 |
| Anti-mCD19 | BioLegend | 115543 | 클론: 6D5 형광단: BV785 희석: 1:100 |
| Anti-mGr1 | BioLegend | 108423 | 클론: RB6-8C5 형광단: APC/Cy7 희석: 1:200 |
| Anti-mCD11b | BioLegend | 101223 | 클론: M1/70 형광단: Pacific blue 희석: 1:100 |
| Anti-mF4/80 | BioLegend | 123114 | 클론: BM8 형광단: PECy7 희석: 1:100 |
| Anti-mCD11c | BioLegend | 117328 | 클론: N418 형광단: PerCP Cy5.5 희석: 1:100 |
| Anti-mMHCII | BioLegend | 107622 | 클론: M5/114.15.2 형광단: AF700 희석: 1:400 |
| Anti-mCD103 | BioLegend | 121410 | 클론: 2E7 형광단: Alexa Fluor 647 희석: 1:200 |
| Anti-mCD86 | BioLegend | 105007 | 클론: GL-1 형광단: PE 희석: 1:200 |
| FC 차단제(Rat 안티 마우스 CD16/CD32) | BD Biosciences | 553141 | 클론: 2.4G2 희석: 1:200 |
참고문헌
- Zhang, Y., Zhang, Z. The history and advances in cancer immunotherapy: understanding the characteristics of tumor-infiltrating immune cells and their therapeutic implications. Cell & Molecular Immunology. 17 (8), 807-821 (2020).
- Banchereau, J., Steinman, R. M.
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