방법 논문

자손의 감수성과 회복력을 연구하기 위해 Poly(I:C)를 사용하여 임신 중기 모체 면역 활성화의 재현 가능한 모델 생성

DOI:

10.3791/64095

⸱

2022년 8월 17일

 , 
1Center for Neuroscience, UC Davis

이 논문에서

요약

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산모 감염은 신경 발달 장애의 위험 요소입니다. 모체 면역 활성화(MIA)의 마우스 모델은 감염이 뇌 발달 및 기능에 미치는 영향을 설명할 수 있습니다. 여기에서는 MIA에 노출된 안정적으로 회복력 있고 감수성이 있는 자손을 생산하기 위한 일반적인 지침과 절차가 제공됩니다.

초록

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임신 중 산모의 면역 활성화(MIA)는 자손의 신경 발달 및 신경 정신 장애의 위험 증가와 지속적으로 관련이 있습니다. MIA의 동물 모델은 인과관계를 테스트하고, 메커니즘을 조사하고, 이러한 장애에 대한 진단 및 치료법을 개발하는 데 사용됩니다. 이들의 광범위한 사용에도 불구하고, 많은 MIA 모델은 재현성의 결여로 고통받고 거의 모든 것이 이 위험 인자의 두 가지 중요한 측면을 무시한다: (i) 많은 자손이 MIA에 탄력적이고, (ii) 감수성 자손은 표현형의 뚜렷한 조합을 나타낼 수 있다. 재현성을 높이고 MIA에 대한 감수성과 탄력성을 모두 모델링하기 위해 임신 전 암컷 마우스의 기본 면역반응성(BIR)을 사용하여 MIA에 노출된 후 어떤 임신이 회복력 있는 자손 또는 정의된 행동 및 분자 이상을 가진 자손을 낳을지 예측합니다. 여기서, 임신 12.5일에 이중 가닥 RNA(dsRNA) 바이러스 모방 폴리(I:C)의 복강내(i.p.) 주사를 통해 MIA를 유도하는 상세한 방법이 제공됩니다. 이 방법은 댐에서 급성 염증 반응을 유도하여 인간 정신 및 신경 발달 장애(NDD)에서 유사하게 영향을 받는 영역에 매핑되는 마우스의 뇌 발달 교란을 유발합니다.

서론

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역학적 증거는 산모 감염을 정신분열증(SZ) 및 자폐 스펙트럼 장애(ASD)를 포함한 정신과 및 NDD의 위험 증가와 연관시킵니다1,2,3,4,5,6,7. MIA 마우스 모델은 이러한 장애의 병인에서 MIA의 인과관계와 기계론적 역할을 테스트하고 분자 바이오마커를 식별하고 진단 및 치료 도구를 모두 개발하기 위해 개발되었습니다 4,6. 이 모델의 유용성과 인기가 높아지고 있음에도 불구하고 현장 내에서 MIA 유도 프로토콜에는 상당한 변동성이 있어 연구 전반에 걸쳐 결과를 비교하고 결과를 복제하기가 어렵습니다 8,9. 또한, 이 모델의 대부분의 반복은 MIA의 두 가지 중요한....

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프로토콜

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모든 프로토콜은 University of California-Davis Institutional Animal Care and Use Committee(IACUC)의 승인 하에 수행됩니다.

1. 동물 준비

  1. 동물을 획득할 때 최대한의 재현성을 보장하기 위해 다음 매개변수를 일관되게 유지하십시오.
    1. 공급업체 및 공급업체 위치: 이전에 보고된 바와 같이, 야생형 C57BL/6J 마우스는 공급업체에 따라 동일한 용량의 폴리(I:C)에 대해 다른 반응을 보인다8. 일관된 응답을 보여주는 공급업체 및 마우스 변형을 선택합니다. 이 실험에서 Charles River에서 얻은 C57BL/6 마우스는 임신 중반 MIA에 노출된 후 행동의 일관된 변화를 보인 반면, Taconic에서 구입한 마우스는 Charles River 마우스에 비해 처리군에 따라 약간의 차이가 있어 더 큰 크기 반응을 보였다8.
    2. 균주: C57BL/6J 마우스가 가장 일반적으로 사용되지만, BTBR 마우스와 다른 균주는 임신 중기 MIA에 대해 차별적인 반응을 보인다9. 이러한 차등 반응....

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결과

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E12.5에서 30mg/kg의 폴리(I:C)에 노출된 모든 동물이 일관된 행동 이상을 가진 자손을 생산하는 것은 아닙니다 8,31. 30mg/kg과 40mg/kg의 폴리(I:C)는 모두 활동 수준 감소, 저체온 반응 및 체중 감소를 포함하여 댐에서 질병 행동을 안정적으로 생성하고 IL-6의 상당한 상승을 유발하지만, MIA에 노출된 새끼의 하위 집합만이 인간 정신과 및 NDD에서 관찰되는 것과 유사한 영역에서 행동 이상을 계속 발전시킬 것입니다(그림 3A-C)8 . 20mg/kg의 저용량의 폴리(I:C)도 질병 행동과 체중 감소를 유도하지만, 고용량과 달리 IL-6 반응이 식염수를 주입한 댐의 반응보다 훨씬 높음에도 불구하고 자손의 행동 이상을 유도할 만큼 충분히 높은 .......

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토론

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모체 감염은 인간과 설치류 및 비인간 영장류 모두에서 뇌 발달 과정을 변화시킨다 4,5,7. 여기에서는 poly(I:C)를 사용하여 임신 중반 시점에서 마우스에서 MIA를 유도하는 절차를 설명합니다. 이 방법은 임신 전 BIR 평가를 통합하여 재현성을 높이고 MIA에 대한 자손의 회복력과 감수성을 유발하는 메커니즘을 기계적으로 조사할 수 있는 기회를 제공합니다8. MIA 후, 중간 BIR 그룹(중간 50%의 IL-6 수준)의 댐은 반복적인 행동의 변화, 면역세포화학에 의해 결정된 신생아의 뉴런에 대한 MHCI 수준의 변화, 웨스턴 블롯8에 의해 결정된 신생아의 선조체 티로신 하이드록실라제, MEF2 및 STAT3 단백질의 상승된 수준으로 성인 자손을 안정적으로 생성합니다.

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공개 사항

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저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

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마우스 MIA 모델의 가변성을 지속적으로 해결해 주신 Myka Estes 박사와 여기에 설명된 방법 프로토콜의 개발로 이어진 작업에 대해 Estes et al.8 의 모든 기여자에게 감사드립니다. 여기에 보고된 연구는 NIMH 2P50 MH106438-06(일명) 및 NIMH T32MH112507(K.P.)에 의해 뒷받침되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.9% NaCl 생리학적 내독소 무료 식염수시그마-알드리치7647-14-5제어 및 차량용 폴리(I:C)
35mm 페트리 접시토마스 사이언티픽1219Z45꼬리 출혈 중 기름을 보전하는 데 사용
7.5% TGX 젤바이오 라드4561084옵션
Ancare NestletsFisher ScientificNC9365966옵션
안티-& 베타;-튜불린MilliporeMAB3408옵션
Bio-Plex Pro 마우스, 사이토카인 표준물, 그룹 IBio-rad171I50001
평판이 포함된 Bio-Plex Pro 시약 키트Bio-rad171304070M
, 소 혈청 알부민ThermoFisher23209
원심분리기Eppendorf5810R(옵션
)Covidien Monoject 1/2 mL 인슐린 주사기(28G x 1/2인치 포함) 바늘스펙트럼552-58457-083
DithiothreitolSigma-AldrichD9779-10G선택적
환경 농축Bio-servK3327 및 K3322선택 사항
EthovisionNoldusEthovision선택적
형광 태그 seondary ntibodiesLi-cor925-32213 및 925-68072선택
식품 등급 식용유(올리브, 카놀라 또는 포도씨 등)다양한 공급업체꼬리 출혈 중 꼬리를 윤활하는 데 사용
HBSSThermoFisher14060040 선택 사항
고분자량 폴리이노시티:폴리시티산Invivogen#tlrl-pic-5암컷의 BIR
Humane Mouse RestrainerAIMS1000꼬리 중 마우스를 억제하는 데 사용 블리즈
이미지 스튜디오 소프트웨어Licor5.2선택적
Laemmli 버퍼Bio-rad1610737EDU선택적
Luminex200ThermoFisher APX10031
Microvette CB300 300μ l 혈청 모세관Sarstedt16.440.100
혼합 분자량 폴리이노시티: 폴리시티산시그마-알드리치#P0913MIA
단클론 항-MEF2AAbCamab76063선택적
단클론 항-STAT3세포 신호12640S선택적
관찰자Noldus관찰자
Odyssey 차단 버퍼(TBS)Li-cor927-50003옵션
Odyssey CLx 이미징 시스템옵션), Li-cor9140
Omnipure PBSMillipore65054L옵션
, Pierce BCA 단백질 분석 키트ThermoFisher23227
다클론 anti_THPel-FreezP4101-150옵션
PVDF 멤브레인Bio-rad162-0177옵션
Qsonica Sonicator Q500Fisher Scientific15-338-282옵션
빠른 혈액 마개Petco17140
Seal-Rite 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브, 천연 비멸균USA Scientific1615-5500
납땜 스탠드AmazonB08Y12QC73꼬리 출혈 중 모세관 고정에 사용
해바라기씨Bio-servS5137-1번식 효율성을 높이는 데 사용
Bio-Plex Pro 마우스 IL-6 세트,Bio-rad171G5007M
Tris baseFisher ScientificBP152-1선택
Tween 20Bio-rad23209선택 사항
, (), , , , , , , (옵션), 을 설정하는 데 사용 의 임신 유도 옵션, , (, (옵션), , 옵션,

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Adams, W., Kendell, R. E., Hare, E. H., Munk-Jørgensen, P. Epidemiological evidence that maternal influenza contributes to the aetiology of schizophrenia. An analysis of Scottish, English, and Danish data. The British Journal of Psychiatry: The Journal of Mental Science. 163 (4), 522-534 (1993).
  2. Brown, A. S., et al.

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재인쇄 및 허가

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태그

Poly I C

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