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방법 논문

비강 Bleomycin 분무에 의해 유도된 폐 섬유증의 마우스 모델

4.6K 조회수

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DOI:

10.3791/64097

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2023년 1월 20일

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1Department of Pulmonary and Critical Care Medicine, Center of Respiratory Medicine, China-Japan Friendship Hospital, National Clinical Research Center for Respiratory Diseases, Institute of Respiratory Medicine, Chinese Academy of Medical Sciences, 2Graduate School of Peking Union Medical College, Chinese Academy of Medical Science and Peking Union Medical College, 3Capital Medical University, 4Beijing University of Chinese Medicine, 5Tianjin Chest Hospital, 6Institute of Clinical Medical Sciences, China-Japan Friendship Hospital, 7Beijing Key Laboratory for Immune-Mediated Inflammatory Diseases, Institute of Clinical Medical Sciences, China-Japan Friendship Hospital

이 논문에서

요약

폐섬유증의 발병기전을 규명하고 새로운 약물 표적을 찾기 위해 블레오마이신을 이용한 다양한 폐섬유증 동물모델을 확립하였습니다. 그러나 폐 조직을 표적으로 하는 대부분의 폐섬유증 모델은 약물 투여가 고르지 않습니다. 여기에서는 비강 표백균 분무에 의해 유도되는 균일한 폐섬유증 모델을 제안합니다.

초록

폐 섬유증은 다양한 원인으로 인해 발생하는 여러 인간 폐 질환의 특징입니다. 치료 옵션이 상당히 제한적이라는 점을 감안할 때 마우스 모델은 새로운 항섬유화 전략을 개발하기 위한 중요한 도구로 계속 사용되고 있습니다. 이 연구에서는 임상적 질병 특성을 밀접하게 모방한 폐섬유증의 마우스 모델을 만들기 위해 비강 분무에 의해 BLM(bleomycin)의 폐내 투여를 수행합니다. C57BL/6 마우스는 3일 연속 비강 분무로 BLM(7 U/mL, 30분/일)을 투여하고 9일, 16일 또는 23일에 희생하여 폐 조직의 염증 및 섬유화 변화를 관찰했습니다. 비강 에어로졸 BLM은 폐를 직접 표적으로 하여 광범위하고 균일한 폐 염증과 섬유화를 일으켰습니다. 따라서 우리는 전형적인 인간 폐 섬유증의 실험용 마우스 모델을 성공적으로 생성했습니다. 이 방법은 다양한 비강 에어로졸 투여가 폐 병태 생리학에 미치는 영향을 연구하고 새로운 항염증 및 항섬유화 치료를 검증하는 데 쉽게 사용할 수 있습니다.

서론

폐섬유증(pulmonary fibrosis)은 폐의 간질에 세포외 기질 성분(주로 I형 콜라겐)이 과도하게 침착되어 폐 기능이 손상되는 진행성 질환 과정이다1. 폐섬유증의 병태생리학은 복잡하며 현재 치료 옵션은 매우 제한적입니다. 마우스 모델은 질병의 출현과 진행에 기여하는 병원성 메커니즘과 약물 개발을 위한 새로운 전략을 연구하는 중요한 도구로 남아 있습니다.

폐섬유증의 다양한 동물모델은 BLM 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12의 기관내 점안에 의존합니다. 그러나 BLM이 폐에서 일으키는 섬유화 변화의 분포는 균일하지 않으며 동물은 점안 과정에서 질식의 위험이 있습니다. BLM의 복강내 주사는 폐에서 비교적 균일한 섬유화 변화를 유도하지만, 약물 표적화가 불충분하기 때문에 여러 번 투여해야 합니다. 후두경을 통한 기관 내 에어로졸 투여는 기관 절개술이나 천자가 필요하지 않으며 결과적으로 폐 내 약물 분포가 최적입니다. 그러나 에어로졸화된 입자는 크고(5-40μm) 폐 조직의 흉막하 영역에 도달할 수 없습니다.

이 연구에서 BLM의 폐 내 투여는 비강 분무에 의해 수행됩니다. 분무하는 동안 쥐는 자발적으로 숨을 쉬고 약물 입자를 흡입했습니다. 에어로졸화된 입자는 크기가 2.5-4μm로 폐 전체에 고르게 분포할 뿐만 아니라 흉막하 영역에도 도달할 수 있었습니다. 저배율에서 특발성 폐섬유증(IPF) 환자의 가장 중요한 폐 조직병리학적 특징은 병변의 다양한 중증도, 일관성 없는 분포, 다른 단계 병변의 교대 분포, 간질 염증, 섬유화 병변 및 정상 폐 조직과 번갈아 나타나는 벌집 모양의 폐 변화의 존재입니다. 이러한 병리학적 변화는 주로 기관지 주변의 말초 흉막하 실질 또는 소엽 중격을 침범합니다. 따라서 이 접근 방식을 통해 BLM 입자가 폐의 흉막하 영역에 도달할 수 있다는 점을 감안할 때 이 모델은 인간 질병의 임상적 특성을 면밀히 시뮬레이션합니다.

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프로토콜

중국-일본 우호병원(중국 베이징)의 동물연구위원회는 이 연구의 일환으로 수행된 쥐와 관련된 모든 절차를 승인했습니다(NO.190108). 생쥐는 실온 20-25°C, 상대 습도 40%-70%, 동물의 빛 강도는 15-20LX, 빛과 어둠이 12시간/12시간 동안 번갈아 가며 작동하는 중국-일본 우호 임상 의학 연구소의 무균 동물실에서 사육되었습니다. 동물들은 음식과 물을 자유롭게 이용할 수 있었다.

1. 생쥐

  1. 모든 동물이 분무 전 7일 동안 주거 시설에 적응하도록 합니다.
  2. 분무를 위해 8-10주 된 수컷 C57BL/6 마우스를 사용하십시오.

2. 비강 표백균 분무

  1. 블레오마이신 제제
    주의: BLM은 화학 독극물로, 종양을 죽이지만 정상 세포와 정상 조직도 손상시킬 수 있습니다.
    1. 깨끗한 벤치에서 BLM 용액을 준비합니다.
      1. 작동 농도(7U/mL)를 얻으려면 2.14mL의 생리식염수에 15U의 BLM 염산염을 재현탁시킵니다. 재현탁된 BLM이 완전히 용해될 때까지 조심스럽게 혼합합니다.
    2. 작업 용액을 4 °C 또는 얼음에 보관하고 1 일 이내에 사용하십시오. 분무하기 전에 BLM 용액을 실온에 두십시오.
  2. 마취
    1. 펜토바르비탈 나트륨 0.1g을 생리식염수 10mL에 녹여 마취를 준비합니다. 작동 마취 용액을 4 °C의 어두운 곳에 보관하고 3일 이내에 사용하십시오.
    2. 26G 바늘이 있는 1mL 주사기를 사용하여 75mg/kg 체중의 최종 용량으로 펜토바르비탈 나트륨을 복부에 주입하여 마우스를 마취합니다.
      참고: 이 연구에서 생쥐는 최소 30분 동안 이 용량에 반응하지 않았습니다. 필요한 경우 쥐의 반응에 따라 수의사와 상의하여 복용량을 조정하십시오.
    3. 몇 분 후 마취된 쥐의 발가락을 검지와 엄지로 눌러 사지 후퇴 반사가 사라졌는지 확인합니다.
  3. 분무 시스템의 준비
    1. 기기를 보정한 후 부드러운 메쉬 커버(그림 1A)로 마취된 마우스를 고정하고, 작동하는 BLM 용액을 피펫(그림 1B)으로 노출탑의 상단 분무 헤드에 추가하고, 분무기를 30분 동안 작동하여 안정적인 분무를 달성합니다.
      참고: 워크플로는 그림 1C,D에 나와 있습니다. 소프트웨어의 자세한 작동 단계는 1-2.3.1.1단계를 설명하는 추가 그림 S2 및 추가 그림 S2.3.1.1.9를 참조하십시오.
      1. flexiWare 8 아이콘(보충 그림 S1A)을 두 번 클릭하고, 실험 세션(보충 그림 S1B)을 클릭하고, 새 연구 버튼(보충 그림 S1C)을 클릭합니다.
      2. 실험 이름(보충 그림 S1D)을 편집하고 제목과 소유자(보충 그림 S1E)를 편집합니다.
      3. IX-4DIO 템플릿(보충 그림 S1F)을 선택하고, 연산자(보충 그림 S1G)를 입력하고, 확인 버튼을 클릭합니다(보충 그림 S1H) | 다음 버튼(보충 그림 S1I).
      4. 펌프를 선택하고 다음을 클릭하십시오(보충 그림 S1J) | 다음 버튼(보충 그림 S2A) | 다음 버튼(보충 그림 S2B) | 마침 버튼(보충 그림 S2C).
      5. Continuous-1Lmin (점 3개, 보충 그림 S2D)에 대한 설정을 클릭합니다. DIO1에서 듀티 사이클(%)을 25%로 설정한 다음 확인을 클릭합니다(보충 그림 S2E).
      6. DIO2를 클릭하고 듀티 사이클(%)을 25%로 설정한 다음 확인을 클릭합니다(보충 그림 S2F).
      7. DIO3를 클릭하고 듀티 사이클(%)을 25%로 설정한 다음 확인을 클릭합니다(보충 그림 S2G).
      8. DIO4를 클릭하고 듀티 사이클(%)을 25%로 설정한 다음 확인을 클릭합니다(보충 그림 S2H).
      9. 상단 녹색 버튼(왼쪽)을 클릭하여 작동을 시작하고 빨간색 버튼(오른쪽)을 클릭하여 작업을 중지합니다. 오른쪽 상단 모서리에 있는 x를 클릭하여 종료합니다(보충 그림 S2I).
    2. BLM 그룹에서는 한 번에 12마리의 마우스를 총 4번, 총 48마리의 마우스까지 분무합니다. 정상 대조군에서 한 번에 6마리의 마우스를 생리식염수로 분무합니다.
  4. 동물 회수
    1. 분무기에서 30분 동안 치료한 후 마우스를 가열 패드가 있는 회수 케이지로 옮깁니다.
    2. 쥐가 완전히 의식을 가질 때까지 관찰하십시오.
    3. 마우스의 상태가 양호한 것으로 확인되면, 즉 자유롭게 움직일 수 있는 것으로 확인되면 원래 케이지로 되돌려 놓습니다. 완전히 회복될 때까지 다른 동물과 함께 두지 마십시오.
    4. BLM 치료 후 24시간 동안 호흡 속도, 생존 및 증상을 포함한 생리학적 지표를 두 번 확인하십시오.

3. 폐 조직 가공

  1. BLM 투여 후 9일, 16일, 23일째 되는 날에 6마리의 마우스에게 펜토바르비탈 나트륨(최종 투여량 100mg/kg 체중)을 복부에 주입한다.
  2. 기관과 폐를 제거하고 즉시 차가운 인산염 완충 식염수로 헹굽니다.
  3. 파라핀을 삽입하기 전에 왼쪽 폐를 10% 중성 포르말린 완충액으로 24시간 동안 고정합니다.
  4. Hematoxylin-eosin 염색(H&E 염색)
    1. 탈수기에서 고정된 폐 조직을 탈수합니다.
    2. 탈수된 폐 조직 블록을 56°C의 왁스 용해 상자에 넣고 1시간 동안 넣습니다.
    3. 매립을 위해 녹인 파라핀을 몰드 박스에 붓고 파라핀이 함침된 조직 블록을 몰드 박스 바닥에 빠르게 놓고 냉각하고 응고시킵니다.
    4. 내장된 왁스 블록을 마이크로톰에 고정하고 슬라이싱 테이블을 상하로 적절한 위치로 조정하고 칼날을 누르고 스케일을 조정하고 4μm 두께의 슬라이스를 자릅니다. 핀셋을 사용하여 물을 채운 디스플레이 상자에 슬라이스를 넣고 말려 풉니다(앞면이 위로).
    5. 슬라이스를 패치하고 굽습니다. 왁스 슬라이스가 완전히 펴진 후 유리 슬라이드를 왁스 슬라이스에 135° 각도로 놓고 핀셋을 사용하여 왁스 슬라이스를 유리 슬라이드 위로 이동하고 유리 슬라이드를 들어 올린 다음 필요에 따라 왁스 슬라이스의 위치를 조정합니다. 왁스 조각이 장착된 슬라이드를 47°C의 일정한 온도 테이블에 1분 동안 놓고 조각이 다시 말리도록 합니다. 슬라이스가 완전히 평평해지면 슬라이드를 62°C 인큐베이터에 1시간 동안 넣습니다.
    6. 왁스를 제거하기 위해 구운 슬라이드를 크실렌에 20분 동안 두 번 넣습니다.
    7. 수분 보충을 위해 슬라이드를 등급이 매겨진 알코올 시리즈로 배치하여 폐 조직 절편을 재수화합니다: 100분 동안 1% 알코올, 95분 동안 1% 알코올, 1분 동안 90% 알코올, 1분 동안 85% 알코올, 1분 동안 75% 알코올, 3분 동안 증류수.
    8. 헤마톡실린의 절편을 5분 동안 염색합니다. 1 분 동안 두 번 세척 한 다음 0.5 % 염산 알코올 분화 용액에 5 초 동안 넣고 물로 1 분 동안 두 번 씻고 파란색 염색 용액에 8-10 초 동안 넣고 수돗물로 두 번 헹구고 30 초 동안 에오신으로 염색합니다.
    9. 탈수 및 탈색을 위해 염색된 부분을 75% 알코올에 1분, 85% 알코올을 1분, 90% 알코올을 1분, 95% 알코올을 1분, 100% 알코올을 1분 동안 넣은 다음 크실렌을 1분 동안 두 번 넣고 흡수지로 남아 있는 액체를 모두 제거합니다.
    10. 장착을 위해 슬라이스 중앙에 중성 껌 밀봉 용액 한 방울을 떨어뜨리고 커버슬립을 장착합니다.
  5. 마우스 폐 조직의 형태학적 등급 표준
    1. Ashcroft et al.이 설명한 방법을 사용하여 실험 그룹에 눈이 먼 조사관이 각 샘플에서 3개의 현미경 필드를 무작위로 선택하고 100배 배율에서 폐 섬유증 정도를 관찰하도록 합니다. 1등급, 약간 부풀어 오른 폐포, 국소적인 경미한 섬유증; 2등급, 섬유질 병소가 있는 표시된 섬유증(폐포벽의 두께가 정상의 3배 이상)이 있음; 3등급, 섬유증의 연속적인 영역(폐포벽의 두께가 정상보다 3배 더 큼); 4등급, 섬유화 병소의 융합, 섬유화 영역이 폐 조직의 10% 미만을 차지합니다. 5 등급, 섬유상 병소가 융합되고 섬유증 면적은 10%에서 50%이며 폐포 구조가 크게 손상됩니다. 6등급, 큰 연속 섬유상 병소(폐 조직의 50% 이상); 7 등급, 폐포 공간은 섬유 조직으로 채워져 있으며 폐포 수포가 존재합니다. 8등급, 완전 섬유증.
    2. 각 시야에 등급에 해당하는 점수를 할당하고(예: 등급 4는 4점과 같음) 6개의 샘플로 구성된 각 그룹에 개별적으로 점수를 매깁니다.

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결과

폐 손상은 분무된 BLM에 의해 유발되었고, 대조 동물은 동일한 부피의 생리식염수로 분무되었습니다. 마우스는 7U/mL의 BLM 농도를 사용하여 3일 동안 하루에 한 번, 하루 30분 분무했습니다. 마우스는 H&E 염색을 위해 BLM 투여 후 9일, 16일, 23일에 희생되었습니다(그림 2B). BLM을 받은 마우스의 폐에서 BLM을 받은 마우스의 폐에서 정상 폐포 구조의 상실, 중격 두꺼워짐, 폐포 비대, 염증 세포의 간질 및 세기관지 주위 영역으로의 침투 증가를 동반한 미만성 폐렴 병변이 관찰되었습니다. 각 폐 조직 절편에서 섬유화 변화의 중증도는 관찰된 현미경 필드의 평균 중증도 점수(Ashcroft 점수)로 평가되었습니다. BLM-D9, BLM-D16 및 BLM-D23 마우스에 대한 Ashcroft 점수는 대조군의 마우스보다 높았습니다(그림 2C).

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토론

블레오마이신의 기관 내 주입은 양쪽 폐에서 급성 염증 및 섬유화 반응을 일으키며 인간 간질성 폐 질환의 실험적 마우스 모델을 확립하는 효과적인 접근법으로 간주될 수 있습니다. 기관내 투여는 가장 일반적으로 사용되는 투여 경로입니다 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12.

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공개 사항

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (No. 92068108)의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
  bleomycinBioway/Nippon Kayaku Co Ltd  DP721섬유증 모델 약물
주입 용 0.9 % 식염수Baxter Healthcare (Tianjin) Co., Ltd.블레오마이신 제제
1 mL 주사기BD300481동물 마취
10% 중성 포르말린 완충제TechaLab Biotech Company폐 조직 고정
15 mL 원심분리 튜브corning430790마취 준비
20 ° C 냉장고뉴 플라이 그룹BCD-213K저장 약물
4 ° C 냉장고신형 플라이 그룹BCD-213K스토어 약물
어도비 일러스트 레이터 cc2020어도비프로세스 이미지
블루 백 액체베이징 화학 작품조직 염색
클린 벤치쑤저우 Sujie 정화 장비 유한Bleomycin 준비
분화 유체Beijing Chemical Works조직 염색
전자 저울METTLER TOLEDOAA-160마취
에오신 염색Beijing Yili Fine Chemicals Co, Ltd.조직 염색
가열 패드HIDOM마우스 배양
헤마 톡 실린 염색Beijing Yili Fine Chemicals Co, Ltd.조직 염색
인산염 완충 식염수(PBS) 완충HycloneSH30256.01클린 폐 조직
포토샵 드로잉 소프트웨어Adobe프로세스 이미지
SCIREQ INEXPOSEEMKA Biotech Beijing Co., Ltd.분무 장치
직립 형광 현미경OlympusBX53슬라이스 관찰
공사 준비 액

참고문헌

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