필 블롯 기법: 다층 또는 농축된 생물학적 시료에서 단층을 분리하는 Cryo-EM 시료 전처리 방법

필 블롯 기술은 적층된 막 단백질의 2차원 결정을 단층으로 분리하여 Cryo-EM 2D 및 3D 데이터 수집에 적합한 얇은 샘플을 얻고^{이미지 처리를 용이}하게 하기 위해 개발되었습니다1. 이 프로토콜은 다른 유형의 다층 샘플뿐만 아니라 Z 단위의 두께를 늘리지 않고 그리드에서 두 샘플 유형의 높은 샘플 농도를 달성하는 데에도 적합합니다.

샘플 층을 하나의 층으로 감소시키는 것은 역주입 방법⁽²) 상에서 실질적으로 연장되고 변형되는 프로토콜에서 모세관 압력과 전단력의 조합을 적용함으로써 달성된다. 첫 번째 블로팅 단계는 백 주입 방법에서 20-25μm 여과지 기공 크기가 아닌 서브 마이크론에서 블로팅하는 동안 다층 샘플의 양쪽에 탄소 필름과 그리드 바를 단단히 샌드위치하고 부착시킵니다. 개별 층의 분리 또는 박리는 그리드가 트레할로스 드롭에 수직으로 눌려지면 샌드위치 된 층을 강제로 분리 할 때 발생하여 탄소 필름이 그리드 막대에서 멀어집니다 (그림 1). 그리드 바와의 원래 접촉점에서 멀리 떨어진 탄소 필름의 위치 변경은 그리드가 서브 마이크론 여과지에서 다시 한번 블롯 될 때 다음 단계에서 발생합니다. 이러한 단계의 반복 횟수는 특정 샘플에 대해 최적화할 수 있습니다. 또한 이 프로토콜을 사용하여 Z의 응집을 피하면서 샘플 농도를 높일 수 있습니다. 그리드 바 및 탄소 필름에 대한 부착과 강제 분리에 의존하기 때문에 이 접근법은 특정 섬세하거나 불안정한 단백질 및 단백질 복합체와 같은 매우 깨지기 쉬운 분자에는 적합하지 않을 수 있습니다.

필 블롯 기술은 특수 장비나 값비싼 소모품이 필요하지 않습니다. 그러나 특정 샘플에 대한 적용 가능성은 생물학적 매개 변수에 대한 신중한 고려가 필요합니다. 평탄도를 보장하기 위해 탄소 필름이 필요하기 때문에 2D 결정의 경우 결정이 더 쉽지만 필 블롯 기술을 통한 조작은 샘플의 생물학적 무결성 또는 결정 순서에 영향을 미칠 수 있습니다. 단일 입자에 대한 필 블롯 기술의 적합성은 탄소 필름이 필요하고 조작에 안정적인 것으로 제한되며 테스트 될 수 있습니다. 층 사이에 중요한 생물학적 상호 작용이있는 표본은 이러한 상호 작용의 중단으로 인해 필 블롯 기술의 도움으로 특성화에 적합하지 않을 수 있습니다.

필 블롯 기술("필 블롯")은 실온에서 TEM에 의한 음성 염색 또는 염색되지 않은 샘플로 테스트 및 스크리닝함으로써 가장 빠르게 최적화됩니다. 최적의 필 블롯 반복 횟수가 확인되면 유리화 전에 두께를 제어하는 시간을 결정할 수 있습니다.

1. 필 블롯 기술의 준비 단계

알림: 준비하려면 다음 항목을 서로 인접하게 배치해야 합니다.

1. 20-25 μm 기공 크기 여과지 두 장을 쌓습니다( 재료 표 참조).
2. ~8cm x 10cm 길이의 파라핀 필름을 여과지 옆에 놓고 용지가 위를 향하도록 합니다.
3. 두 개의 추가 #4 여과지 위에 서브미크론 여과지를 놓습니다(그림 1-1).
4. 구부러진 다리가 위를 향하고 곧은 다리가 아래를 향하도록 모세관 방지 집게를 놓습니다. 그런 다음 매끄럽고 반짝이는 면이 위로 오도록 600메쉬 그리드를 선택합니다. 깨끗한 그리드가 다른 품목과 접촉하지 않도록 집게를 페트리 접시 또는 기타 융기된 표면에 놓습니다.
5. 파라핀 필름에서 용지를 제거하고 측면(~5mm)을 당겨 작은 테두리를 만듭니다. 파라핀 필름의 한쪽 짧은 면과 파라핀 필름에서 ~1cm 떨어진 4% 트레할로스 용액 150μL 방울 2개를 피펫팅합니다.
6. 별도의 벤치 또는 바닥에 작은 폴리스티렌 폼 용기에 액체 질소를 붓습니다 ( 재료 표 참조).
   주의 : 동상 물림을 피하기 위해 장갑과 안면 보호대를 사용하여 올바른 취급에 대한 교육을 받으십시오.
7. 작은 Cryo-EM 그리드 용기를 액체 질소에 넣고 보풀이 없는 물티슈로 폴리스티렌 폼 용기를 덮습니다.

2. 그리드에 탄소 필름 배치

1. Dumont #5 집게( 재료 표 참조)를 사용하여 트레할로스 용액 방울 중 하나에서 운모의 한쪽을 아래쪽(~20°-40°)으로 약간 아래쪽으로 만져 운모에서 탄소 필름을 띄우고 운모를 아래쪽으로 이동하여 물의 장력이 탄소 필름에서 천천히 해제되도록 합니다. 탄소 필름이 물방울 표면에 떠 있으면 운모를 방출하십시오.
2. 균열 형태의 손상이있는 탄소를 사용하지 않도록 탄소 필름을 육안으로 검사하십시오.
3. 모세관 방지 집게가 고정한 그리드를 비스듬히 (~20°-30°) 인접한 위치의 트레할로스 방울에 삽입한 다음 탄소 필름 아래 중앙에 삽입합니다. 탄소 필름을 들어 올립니다(그림 1-2).
4. 그리드를 동일한 방향으로 유지하고 드롭의 표면 장력을 깨지 않고 트레할로스 두 번째 방울의 표면 위로 천천히 내려 그리드 테두리를 거친 쪽으로 감았을 수 있는 불필요한 탄소 필름을 제거합니다.

3. 다층 2D 결정을 단층으로 분리

1. 모세관 방지 집게(재료 표 참조)를 회전시키고 그리드의 탄소 면이 아래를 향하도록 페트리 접시에 놓습니다(그림 1-3).
2. 1.3 μL의 샘플을 그리드 상단의 약간의 트레할로스 메니스커스에 피펫팅한다. 용액을 ~8-10회 피펫팅하여 트레할로스와 샘플을 그리드의 양쪽에 혼합하고 분배합니다.
3. 용액을 1분 동안 인큐베이션하는 동안, 하나 이상의 트레할로스 용액 1.7 μL 방울을 파라핀 필름 상에 피펫팅한다.
4. 탄소 필름이 위를 향하도록 그리드를 원래 위치로 다시 돌립니다.
5. 모세관 방지 집게를 사용하여 그리드를 서브미크론 여과지에 누릅니다(그림 1-4). 용액이 여과지에 흡수되고 탄소 필름이 평평하게 놓이면 그리드를 들어 올리고 트레할로스 용액의 1.7μL 방울 위로 수직으로 이동하기 전에 3초 동안 기다립니다(그림 1-5).
   알림: 고도로 쌓인 샘플에 대해 이 단계를 여러 번 반복하거나 다음 단계에서 유리화를 위해 그리드가 준비됩니다.
6. 두 개의 여과지에 격자를 닦은 다음 여과지에서 격자를 들어 올립니다(그림 1-6). 습도 및 시료 버퍼에 따라 약 13초 후, 그리드를 작은 스티로폼 용기의 액체 질소에 넣고 그리드를 Cryo-EM 그리드 용기에 넣거나 Cryo-EM 스크리닝 또는 데이터 수집을 위해 직접 옮깁니다.
   참고: 프로토콜을 신속하게 최적화하려면 이 단계에서 박리 얼룩이 있는 그리드를 액체 질소에 넣지 말고 부정적으로 얼룩지게 합니다. 그리드에 1% 우라닐 아세테이트 3μL를 적용하여 샘플을 부정적으로 염색하고 그리드를 30초 동안 배양한 다음 20-25μm 공극 크기 여과지의 찢어진 조각으로 얼룩지게합니다. 트레할로스, 탄닌 또는 포도당으로 유리화된 2D 결정 그리드는 트레할로스, 탄닌 및 포도당이 수동 급락에 사용되는 속도로 결정질 얼음의 형성을 방지하기 때문에 유리화를 위해 일상적으로 손으로 떨어^진다2.

성공적인 필 블롯 실험은 종종 고농도의 단일 샘플 층을 생성합니다. 대부분의 그리드 사각형의 일부 영역에는 여전히 여러 레이어가 포함될 것으로 예상되며, 특히 필 블롯 단계의 반복 횟수가 적습니다. 그러나 대부분의 그리드 사각형에는 인간 류코트리엔 C4 합성 효소 (그림 2) 및 리포좀 (3.2 단계, 그림 3에 추가됨)의 2D 결정에서 관찰 된 바와 같이 광범위한 단층 영역이 포함됩니다. 층에서 원하는 감소를 나타내지 않는 샘플에 대해 추가 필 블롯 단계를 테스트해야 할 수 있습니다.

성공적인 필 블롯 실험의 가장 중요한 지표는 고해상도 Cryo-EM 데이터 수집 및 이미지 처리 후 관찰된 데이터 품질과 생물학적 무결성입니다. 데이터 해석에는 레이어 간의 접촉 영역에 대한 잠재적 손상 또는 왜곡에 대한 신중한 고려가 포함되어야 합니다.

박리 블로팅이 발생한 EM 그리드의 영역은 일반적으로 발생하지 않은 영역보다 더 높은 농도의 샘플을 표시합니다. 이 겉보기 농축 효과는 다층 샘플이 탄소 필름과 그리드 바 표면 모두에 부착된 후 필 블롯 준비 중에 반복적으로 분리되고 약간 재배치되고 다시 접촉할 때 두 표면에 추가로 부착되기 때문에 발생합니다. 그 결과 원래의 다중 라멜라 샘플의 여러 층이 더 넓은 측면 영역에 걸쳐 분산됩니다(그림 3 및 그림 4). 이러한 영역에는 더 큰 2D 결정 또는 멤브레인이 포함될 수도 있습니다. 두 현상 모두 "필 영역"이 필 블롯 단계의 영향을 받지 않는 영역에 인접한 영역에서 쉽게 관찰되고 비교됩니다(그림 3). 그림 2-4의 이미지는 투과 전자 현미경으로 120kV의 가속 전압에서 저선량 조건에서 수집되었습니다(재료 표 참조).

그림 1: 필 블롯 기법의 개략적 표현. 필-블롯 기술의 처음 두 단계(1-2 및 1-3)와 마지막 단계(1-6)는 백주입 방법(2)을 기반으로 하고 중간 단계는 필-블롯 프로토콜(Johnson et al.1에서 수정됨)을 따릅니다. 1단계에서 (A) 20-25μm 기공 크기의 여과지 두 장을 쌓고, (B) 트레할로스 용액 두 방울이 있는 파라핀 필름 조각에 인접하고, (C) 두 개의 추가 여과지에 서브미크론 여과지 한 장을 쌓습니다. 단계 2에서, (A) 탄소 필름은 제 1 트레할로스 액적 상에 부유되고, (B) 모세관 방지 겸자로 집어 올려지고, 그 후 표면 장력을 깨지 않고 제 2 액적 (미도시)의 표면에 접촉되어 주변으로부터 과잉의 탄소 막을 제거한다. 3단계에서 (A) 그리드를 고정하는 포셉이 180° 회전하고(그리드의 탄소 필름 쪽이 이제 아래를 향함) (B) 샘플을 트레할로스의 메니스커스에 피펫팅합니다. 4단계에서 그리드는 탄소 필름이 위를 향하도록 원래 방향으로 다시 회전하고 샘플은 서브미크론 여과지 위로 천천히 내려갑니다. 그리드를 들어 올리고 5단계에서 트레할로스 용액 1.7μL 방울 위로 수직으로 내립니다. 4단계와 5단계를 "필 블로팅"이라고 하며 스태킹의 양에 따라 3회 이상 반복할 수 있습니다. 반복 횟수는 다른 샘플에 대해 최적화해야 할 수 있습니다. 단계 6에서, (A) 샘플을 20-25 μm 공극 크기의 여과지의 두 층에 블롯팅하고, (B) 액체 질소에 손으로 담그기 전에. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 필 블롯 방법을 거친 2D 결정 샘플. 화살표의 왼쪽 영역은 탄소 필름과 그리드 막대 사이의 접촉 영역에서 단층 2D 결정으로 크게 축소되어 박리 블롯 된 다음 이동되었으며, 화살표의 오른쪽 영역은 필 블롯의 영향을받는 영역에 없었습니다. 박리 블롯 영역은 쉽게 선택할 수 있으며 대부분의 그리드에서 관찰됩니다. 도시된 2D 결정은 인간 류코트리엔C4 합성효소의 적층 및 단층 2D 결정입니다. 스케일 바는 10 μm에 해당합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 필 블롯을 거친 리포좀. 필 블롯은 붕괴 된 리포솜과 소포의 가장자리를 차단하여 이미지의 아래쪽 절반에서 관찰되는 것처럼 크고 대부분 단층 인지질 이중층이있는 영역을 생성하는 데 성공적으로 적용될 수 있습니다. 상반부는 그리드 바(grid bar)와 탄소 필름 사이의 접촉 영역에 있지 않았고, 따라서 두 개의 인지질 이중층을 갖는 완전한 리포좀을 함유한다. 스케일 바는 1μm에 해당합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 필 블롯 풋프린트. 400 메쉬 그리드의 그리드 사각형은 그리드 막대의 풋프린트("B"로 레이블이 지정됨)와 결과 필 블롯 영역뿐만 아니라 그리드 막대와 접촉하지 않았거나 더 적은 필 블롯 반복을 거친 영역("C"로 레이블이 지정됨)을 보여줍니다. 스케일 바는 10 μm에 해당합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: 너무 얇은 탄소 필름을 사용하여 서브미크론 여과지에 역주입하여 준비한 EM 그리드를 블로팅합니다. 이미지는 (A) 멤브레인과의 초기 접촉, (B) 접촉 후 1000ms 및 (C) 접촉 후 2000ms에서 촬영된 비디오(비디오 1 참조)의 단일 프레임입니다. 화살표는 모세관 압력이 탄소 필름을 파열시킨 격자 사각형을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

비디오 1: 그리드는 필 블롯 단계를 위해 서브미크론 여과지에 놓입니다. 탄소 필름은 왼쪽 하단에서 오른쪽 상단 방향으로 그리드에 천천히 단단히 흡입되어 그리드 바와 탄소 필름 사이에 샘플을 단단히 끼 웁니다. 탄소 필름과 개별 샘플 층은 각각의 후속 필 블롯 단계에서 변위되어 더 높은 계층화 된 샘플에 대한 추가 반복으로 최적화를 허용합니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

저자는 경쟁하는 재정적 이해 관계나 기타 이해 상충이 없습니다.