Method Article

동적 인터페이스의 공초점 현미경 시각화를 위한 마이크로텐시오미터

DOI:

10.3791/64110

⸱

September 9th, 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemical Engineering and Materials Science, University of Minnesota, 2Department of Chemical Engineering, Carnegie Mellon University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 원고는 계면 형태를 시각화하면서 계면 장력과 표면 팽창 유변학을 동시에 측정하기 위해 마이크로 텐시오미터 / 공초점 현미경의 설계 및 작동을 설명합니다. 이것은 기술 및 생리학에서 중요한 인터페이스의 구조 - 속성 관계의 실시간 구축을 제공합니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

유체-유체 계면에 대한 표면-활성 분자의 흡착은 자연에서 유비쿼터스적이다. 이러한 계면을 특성화하려면 계면활성제 흡착률을 측정하고, 벌크 계면활성제 농도의 함수로서 평형 표면 장력을 평가하고, 평형 후 계면 영역의 변화에 따라 표면 장력이 어떻게 변하는지를 연관시켜야 합니다. 고속 공초점 현미경으로 형광 이미징을 사용하여 계면을 동시에 시각화하면 구조-기능 관계를 직접 평가할 수 있습니다. 모세관 압력 마이크로텐시오미터(CPM)에서, 반구형 기포가 1 mL 부피의 액체 저장소에서 모세관의 끝에 고정된다. 버블 인터페이스를 가로지르는 모세관 압력은 라플라스 방정식에 기초한 모델 기반 압력, 버블 곡률 또는 버블 영역 제어를 허용하는 상용 미세유체 유동 제어기를 통해 제어됩니다. Langmuir 물마루 및 펜던트 드롭과 같은 이전 기술과 비교하여 측정 및 제어 정밀도 및 응답 시간이 크게 향상되었습니다. 모세관 압력 변동을 밀리초 단위로 적용하고 제어할 수 있습니다. 버블 인터페이스의 동적 반응은 버블이 확장되고 수축함에 따라 두 번째 광학 렌즈를 통해 시각화됩니다. 버블 윤곽선은 원형 프로파일에 적합하여 버블 곡률 반경, R 및 결과를 무효화하는 원형으로부터의 편차를 결정합니다. 라플라스 방정식은 계면의 동적 표면 장력을 결정하는 데 사용됩니다. 평형 후, 컴퓨터 제어 마이크로 유체 펌프에 의해 작은 압력 진동을 부과하여 버블 반경 (0.001-100 사이클 / 분의 주파수)을 진동시켜 팽창 모듈러스를 결정할 수 있습니다 시스템의 전체 치수는 마이크로 텐시오미터가 고속 공초점 현미경의 렌즈 아래에 들어갈 정도로 충분히 작아서 형광 태그가 지정된 화학 종을 서브 미크론 측방향 분해능으로 정량적으로 추적 할 수 있습니다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

계면활성제 필름으로 덮인 공기-물 계면은 일상 생활에서 유비쿼터스입니다. 계면 활성제 - 물 주입은 고갈 된 들판에서 오일 회수를 향상시키는 데 사용되며 셰일 가스 및 오일의 유압 파쇄 용액으로 사용됩니다. 기액 거품 및 액체 - 액체 에멀젼은 윤활유 및 세정제로서 많은 산업 및 과학 공정에 공통적이며 식품에서 일반적입니다. 계면에서의 계면활성제 및 단백질은 포장, 저장 및 투여 동안 항체 입체 형태를 안정화 1,2,3,4,5, 눈에서의 눈물막 안정성 6,7,8, 및 폐 역학9,10,11,12,13,14, 15.

계면과 그 성질에 흡착하는 표면 활성제 또는 계면활성제에 대한 연구는 많은 다른 실험 기술로 오랜 역사를 가지고 있습니다 16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27 . 최근의 개발은 모세관 압력 마이크로 텐시오미터 (CPM)로, 다른 일반적인 방법 9,23,24,25보다 훨씬 적은 재료를 사용하면서 훨씬 작은 길이 스케일에서 고도로 곡선 된 인터페이스에서 계면 특성을 검사 할 수 있습니다. 공초점 형광 현미경 (CFM)은 CPM 22 또는 Langmuir 골짜기 20,26,27,28,29의 공기 - 물 계면에서 지질 및 단백질의 형태를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 여기서 CPM과 CFM은 형태학적 현상을 동적 및 평형 계면 특성에 연결하여 생물학적 및 기술적 인터페이스에 대한 구조-기능 관계를 개발하기 위해 결합되었다.

CPM-CFM에 접근할 수 있는 계면 계면활성제 시스템에서 중요한 수많은 파라미터가 있다. CPM에서, 직경 30-200 μm의 기포가 유리 모세관 튜브의 팁에 고정된다. CPM의 이전 버전에서, 기포의 내부와 외부 사이의 모세관 압력 차이는 물 컬럼 및 진동 주사기 펌프 9,30을 통해 제어되었다; 여기에 설명 된 새 버전은 이들을 더 높은 정밀도의 컴퓨터 제어 마이크로 유체 펌프로 대체합니다. 표면 장력 (γ)은 펌프에 의해 설정된 계면을 가로 지르는 압력 강하, ΔP 및 기포의 곡률 반경, R의 광학 분석으로부터 라플라스 방정식 인 ΔP = 2γ / R을 통해 결정됩니다. 계면의 동적 표면 장력은 가용성 계면활성제를 함유하는 벌크 액체와 접촉하는 새로운 기포의 생성에 이어 10 ms 시간 분해능으로 결정될 수 있다. 계면활성제 흡착 역학은 확산도, 표면 커버리지, 벌크 농도와 평형 표면 장력 사이의 관계를 포함하는 계면활성제의 필수 특성을 결정하기 위해 고전적인 Ward-Tordai 방정식 10,31에 의해 설명될 수 있다. 일단 평형 표면 장력이 달성되면, 계면 영역은 진동화되어 팽창 탄성률을 측정하고, 표면 장력의 변화를 기록함으로써, 기포 표면적의 작은 변화에 의해 유도된, figure-introduction-1A32일 수 있다. 얽힌 중합체 또는 단백질과 같은 그들 자신의 내부 구조를 개발하는 보다 복잡한 계면의 경우, 표면 장력은, 보다 일반적인 표면 응력(4,33figure-introduction-2)으로 대체된다.

호흡 동안의 폐 안정성은 폐포 공기-액체 계면(9,10)에서 낮은 표면 장력 및 높은 팽창 모듈러스 둘 다를 유지하는 것에 직접적으로 연결될 수 있다. 모든 내부 폐 표면은 조직 수화를 유지하기 위해 상피 라이닝 유체의 연속적이고 미크론 두께의 필름으로 라이닝된다(34). 이 상피 라이닝 유체는 주로 염 및 다양한 다른 단백질, 효소, 당 및 폐 계면 활성제와 함께 물입니다. 임의의 곡선형 액체-증기 계면의 경우와 마찬가지로, 모세관 압력은 폐포(또는 버블)의 내부에서 더 높은 압력으로 유도된다. 그러나 표면 장력이 폐 내의 모든 곳에서 일정하다면 라플라스 방정식 인 ΔP = 2γ / R은 작은 폐포가 더 큰 폐포에 비해 더 높은 내부 압력을 가하여 더 작은 폐포의 가스 내용물이 더 크고 낮은 압력 폐포로 흐르게한다는 것을 보여줍니다. 이것은 "라플라스 불안정"9,35로 알려져 있습니다. 최종 결과는 가장 작은 폐포가 붕괴되어 액체로 채워지고 다시 팽창하여 폐의 일부가 붕괴되고 다른 부분이 과도하게 팽창하여 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS)의 전형적인 증상입니다. 그러나 제대로 기능하는 폐에서는 폐포 계면 영역의 공기 - 상피액 계면이 호흡 중에 팽창하고 수축함에 따라 표면 장력이 동적으로 변합니다. 만약, 또는 figure-introduction-3라플라스 압력이 반경이 감소함에 따라 감소하고 반경이 figure-introduction-4증가함에 따라 증가하여 라플라스 불안정성을 제거함으로써 폐(9)를 안정화시킨다. 따라서, 빈도, figure-introduction-5단층 형태학 및 조성, 및 폐포액 조성에 어떻게 의존하는지는 폐 안정성에 필수적일 수 있다. CPM-CFM은 또한 계면활성제 흡착(25), 단층형태학(22) 및 팽창 모듈러스(9)에 대한 계면 곡률의 효과에 대한 첫 번째 시연을 제공하였다. CPM 내의 저장소의 작은 부피(∼1 mL)는 액상의 신속한 도입, 제거 또는 교환을 허용하고, 고가의 단백질 또는 계면활성제(10)의 필요한 양을 최소화한다.

CPM-CFM 이미지에서의 콘트라스트는 계면(16,27)에서 형광 태깅된 지질 또는 단백질의 작은 분획의 분포에 기인한다. 2차원 계면활성제 단층은 종종 표면 장력 또는 표면 압력의 함수로서 측방향 상 분리를 나타내는데, 이는 깨끗한 유체-유체 계면의 표면 장력 차이이며, figure-introduction-6 π0 및 계면활성제-피복 계면의 γ γ는 순수한 유체 표면 장력을 낮추π는 작용을 하는 계면에서의 계면활성제 분자의 상호작용에 의해 야기되는 2차원 "압력"으로 생각될 수 있다. 낮은 표면 압력에서, 지질 단일층은 액체-유사 무질서한 상태에 있고; 이것은 액체 팽창 (LE) 상으로 알려져 있습니다. 표면 압력이 증가하고 지질 분자 당 면적이 감소함에 따라, 지질은 서로 배향하고 장거리 정렬된 액체 응축 (LC) 상 16,20,27로 1차 상 전이를 겪을 수 있다. LE 및 LC 상은 다양한 표면 압력에서 공존할 수 있고, 형광 태깅된 지질이 LC 상으로부터 배제되고 LE 상으로 분리됨에 따라 가시화될 수 있다. 따라서, LE 상은 밝고 LC 상은 CFM16으로 이미징될 때 어둡다.

이 원고의 목표는 결합 된 공초점 현미경 마이크로 텐시오미터를 만들고 작동하는 데 필요한 단계를 설명하는 것입니다. 이를 통해 독자는 흡착 연구를 수행하고, 표면 장력, 유변학 적 행동을 측정하고, 미크론 규모의 공기 / 물 또는 오일 / 물 계면 계면에서 동시에 계면 형태를 검사 할 수 있습니다. 여기에는 필요한 모세혈관을 당기고, 자르고, 소수화하는 방법, 압력, 곡률 및 표면적 제어 모드를 사용하기 위한 지침, 그리고 마이크로텐시오미터 곡선 계면으로의 불용성 계면활성제의 계면 전달에 대한 논의가 포함된다.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 모세관의 제조

  1. 모세관을 모세관 풀러에 넣고 원하는 당김 프로그램을 실행하여 팁에서 ~ 1 μm의 외경 (OD)을 가진 두 개의 테이퍼 모세 혈관을 만듭니다.
    참고: 당기기 전에 모세관의 OD는 마이크로텐시오미터 셀의 모세관 홀더에 맞도록 지정된 OD여야 합니다. 모세관의 내경(ID)은 다양할 수 있지만, 당김 후 모세관의 임계 반경에 영향을 미칠 것이다. 결과 테이퍼가 초기에 모세관 OD 및 ID를 신속하게 감소시킨 다음 원하는 모세관 OD 및 ID 근처의 반경에 도달한 다음 직경을 더 느리게 줄일 수 있도록 풀링 프로그램이 선택됩니다. 이것은 ID에서 30-100 μm의 사용 가능한 모세관을 산출하기 위해 스코어링될 수 있는 더 큰 모세관 길이를 생성할 것이다.
  2. 원하는 지점에서 모세관의 팁을 스코어링하여 30-100 μm의 ID를 얻고 팁을 떼어내십시오. 모세관은 이제 팁에서 원하는 반경의 OD 및 ID를 갖습니다 (그림 1A). 모세혈관은 2단계까지 저장할 수 있다.
    참고: 모세관의 절단면은 90° 깨끗한 파손이어야 합니다. 절단면의 결함은 모세관 및 불량한 표면 특성 측정에 대한 버블의 잘못된 고정으로 이어질 것입니다. 테이퍼 모세관 팁은 매우 섬세합니다. 그들은 해결책 이외의 것 (예 : 바이알 벽, 공기 노즐)과 접촉하면 파괴됩니다.

2. 모세혈관의 소수배양

  1. 당겨진 유리 모세관, 산성 세척 용액, 플라스틱 핀셋, 탈 이온화 (DI) 물, 소수화 용액 (에탄올 중 2 % 실란), 진공 펌프 및 에탄올 용액을 수집하십시오. 자세한 내용은 자료표를 참조하십시오.
    주의: 산성 세척 용액은 절단 독성이 있고, 피부와 눈의 부식/자극을 일으키고, 산화되고 있습니다. 소수화 용액은 피부/눈/호흡기 자극제입니다. 눈 보호, 실험실 코트 및 장갑을 착용하고 흄 후드에서 솔루션으로 작업하십시오.
  2. 산성 - 모세 혈관을 청소
    참고: 모세관을 산 세척하면 모세관 내부의 유기 잔류물을 제거하고 모세관 소수성을 렌더링하는 실란화 반응을 위해 유리 표면을 준비합니다.
    1. 핀셋으로 넓은 끝 근처에 모세관을 단단히 잡으십시오.
    2. 테이퍼 팁을 산성 세척액에 담그고 진공 펌프에서 모세관의 넓은 끝으로 호스를 부착하십시오. 이것은 모세관으로 용액을 빨아 들일 것입니다.
      참고: 모세관 호스의 끝에 피펫 팁을 부착하여 모세관 끝단에 더 잘 맞을 수 있습니다.
    3. 산 세척 용액이 모세관의 약 절반을 채우면 멈추십시오.
      참고 : 산 세척 용액에서 모세관 팁을 제거한 후 모세관 외부의 용액은 종종 모세관 팁 근처에 비드를 형성합니다. 용액 바이알의 목에 모세관을 부드럽게 만져서 과도한 용액을 제거하십시오.
    4. 산 세척 용액이 모세 혈관에 적어도 30 분 동안 남아있게하여 액체의 플러그가 모세관의 테이퍼 끝에 남아 있도록하십시오.
    5. 핀셋으로 모세관을 단단히 잡고 진공 호스를 사용하여 모세관의 큰 끝에서 액체를 꺼내 모세관에서 산 세척 용액을 제거하십시오.
  3. 모세관을 헹구십시오.
    1. 모세관의 테이퍼 끝단을 DI 물에 담그고 산성 세정액에 잠겨 있던 외부를 덮을 수 있을 만큼 충분히 깊게 잠기도록 합니다. 팁이 잠기는 동안 진공 호스를 사용하여 모세관을 통해 DI 물을 당깁니다. 물에서 모세관을 제거하고 진공 호스로 나머지 물을 제거하십시오.
    2. 위의 단계를 최소 4x 반복하십시오.
  4. 에탄올을 DI 물로 대체하는 단계 2.3을 다시 수행하십시오.
  5. 에탄올이 모세관 내부에서 완전히 증발 할 때까지 지속적으로 흡입하십시오. 모세관은 에탄올이 증발하기 시작할 때 흐리고 시원해지지만 30 ~ 45 초 후에 깨끗해질 것입니다.
  6. 모세관을 소수화 용액으로 코팅하십시오.
    1. 모세관의 넓은 끝을 에탄올 용액에 ~2% 실란에 간단히 담그십시오. 모세관 작용은 코팅 용액이 모세관 내에서 상승하도록 할 것이다. ~ 1cm 크기의 플러그가 모세관 내에서 상승하면 용액에서 모세관을 제거하십시오.
    2. 테이퍼 팁이 아래쪽을 향하도록 모세관의 방향을 조정하여 코팅 용액이 가늘어진 팁 쪽으로 중력과 함께 떨어지도록 합니다.
    3. 코팅 용액이 적어도 3분 동안 모세관에 남아 있도록 허용한다.
      참고: 테이퍼 팁의 내부와 접촉하는 코팅 용액의 플러그에 기포가 없어야 합니다. 기포가 있는 경우, 모세관 내부는 단계 2.5에서 충분히 건조되지 않았을 가능성이 높다. 이 문제를 해결하려면 필요에 따라 2.4-2.6단계를 반복합니다.
  7. 모세혈관을 단계 2.3과 동일한 방법으로 에탄올 1x로 헹구었다.
  8. 모세관에 소수성 코팅을 설정하십시오.
    1. 깨끗하고 건조한 섬광 바이알을 120°C로 설정된 진공 오븐에 넣습니다. 코팅 된 모세 혈관을 바이알 (이상적으로는 바이알 당 하나의 모세관)에 넣고 넓은 끝이 바이알 바닥에 놓여 있습니다. 모세혈관이 모세혈관에 소수성 실란 층의 영구적인 결합을 달성하기 위해 적어도 6 h (하룻밤 선호) 동안 오븐에 남아있도록 허용한다. 모세혈관은 단계 4까지 저장될 수 있다.

3. 시료 준비 및 보관

  1. 오염을 피하기 위해 계면활성제와 형광단 용액을 깨끗한 산 세척 바이알에 혼합하고 보관하십시오.
    참고: 상업적으로 이용가능한 지질은 가장 높은 순도를 가져야 하며 -20°C에서 사용 사이에 저장되어야 한다. 오래되거나 오염 된 지질은 종종 결과를 재현하기 어렵게 만듭니다.

4. 마이크로 텐시오미터 설정

  1. 도 2에 설명된 바와 같이 CPM 셀을 조립한다.
    1. 모세관의 큰 면을 CPM 셀의 위쪽에 놓고 세포의 아래쪽으로 밀어 넣을 때까지 놓습니다.
    2. PEEK 플러그를 부드럽게 조여 모세관을 고정한 다음 미세유체 펌프의 튜브를 모세관의 큰 쪽에 부착합니다. 테이퍼 모세관 팁에 닿지 않도록 주의하십시오.
  2. 필요한 경우 저장소 교환 및/또는 온도 제어 호스를 CPM 셀의 각 입구 및 출구에 연결합니다(그림 2). 그렇지 않으면 사용하지 않는 입구와 콘센트를 꽂습니다.
  3. CPM 셀을 공초점 현미경 단계에 부착하여 CFM 목표, CPM 카메라 및 CPM 광원과 대략적으로 정렬합니다(그림 3).
  4. 펌프의 권장 작동 압력(여기에 사용된 미세유체 펌프의 경우 150 mbar)에서 미세유체 펌프로의 가스 유동을 열고 모세관으로의 흐름이 개방되어 있는지 확인하십시오.
  5. 모세관 압력 진동 주파수 및 진폭이 0으로 설정된 상태에서 압력 제어 모드에서 CPM 가상 인터페이스(보충 코딩 파일 1: 마이크로텐쇼미터 가상 Interface.vi) 실행을 시작합니다(그림 4-7). 그림 4는 가상 인터페이스의 스크린샷을 보여 줍니다. DI 물과 ~35 μm의 모세관 반경의 경우, ~20 mbar의 압력은 모세관에 물이 들어가지 않도록 보장합니다.
  6. 피펫을 사용하여 CPM 셀을 물로 채웁니다.
  7. 마이크로 텐시오미터 카메라를 사용하여 모세관 팁에 초점을 맞춥니다.
  8. CFM으로 모세관 팁에 초점을 맞춥니다. 모세관을 찾는 데 어려움이 있는 경우 CPM 카메라를 사용하여 CFM 목표를 찾으십시오. 이렇게 하면 CFM 목표와 버블 사이의 거리를 근사화하여 올바른 작동 거리를 달성하는 데 도움이 됩니다.
  9. 환부(녹색 섹터 투영)가 거품에 중심을 둔 후 거품 가장자리를 명확하게 볼 수 있도록 수동으로 초점을 조정합니다(그림 4-3).
    참고: 환부의 위치, 시작 및 끝 각도, 환부의 내부 및 외부 반지름은 보기 창 아래의 메뉴를 통해 조정할 수 있습니다.
  10. 버블 재설정을 클릭하고 새 버블이 형성되었는지 확인하십시오 (이전 버블 팝을들을 수 있으며 제어판보기 창에서 새 버블을 관찰 할 수 있습니다). 그림 4-3). 거품이 터지지 않으면 재설정 압력을 높이거나 보기 창 아래의 버블 재설정 탭에서 재설정 지연 시간을 늘립니다. 표면 장력이 약 73mN/m(식염수 또는 물/기포의 경우)인지 확인합니다(그림 4-9).
  11. 직접 세포 주사기를 통해 물을 꺼내고(그림 3-13), 비운 다음 다시 부착합니다. 샘플을 로드하여 실험을 실행할 준비가 되었습니다.

5. 흡착 연구

  1. CPM 소프트웨어를 압력 제어 모드로 유지하는 오토클레이브 피펫을 사용하여 원하는 샘플로 셀을 채웁니다. 새 버블 인터페이스가 생성될 때 초기 표면 장력이 약 73mN/m인지 확인하십시오.
  2. 새로 형성된 버블의 반지름을 결정하고 해당 값을 중심선 영역 컨트롤에 입력하고(그림 4-7) 영역 제어 탭(그림 4-8)을 클릭하여 컨트롤 유형을 영역 컨트롤로 변경합니다.
    참고: 일정한 압력 제어도 사용할 수 있지만 이로 인해 인터페이스의 표면 장력이 변경됨에 따라 버블 반경이 지속적으로 변경됩니다. 이러한 변화 영역은 계면활성제 흡착률의 분석을 복잡하게 만들고 연구 중에 기포를 터뜨릴 수 있다.
  3. 공초점 비디오 녹화를 시작합니다.
  4. 버블 재설정(그림 4-5)을 클릭하고 즉시 데이터 수집(그림 4-6)을 클릭합니다. 버튼의 신호등이 녹색으로 바뀝니다.
  5. 도 4-6에 도시된 바를 슬라이딩하여 시료의 농도에 따라 데이터 기록 속도를 조절한다. 흡착률이 더 느리려면 더 느린 기록 속도를 사용합니다. 이는 초기에 더 높은 기록 속도가 필요한 경우 실행 중간에 조정할 수 있지만 파일 크기를 줄이기 위해 긴 연구에서는 느린 속도가 바람직합니다.
  6. 실험이 끝난 후(최종 표면 장력 고원에 도달한 경우) 올바른 파일 경로(그림 4-1)를 선택하고 저장 단추(그림 4-2)를 클릭하여 파일을 저장합니다.
  7. CFM에도 녹화를 중지하고 저장합니다.

6. 진동 / 이완 연구

  1. CPM 소프트웨어를 압력 제어 모드로 유지하는 오토클레이브 피펫을 사용하여 셀을 샘플로 채웁니다. 새로운 버블 인터페이스가 생성될 때 표면 장력이 약 73mN/m인지 확인하십시오.
  2. 샘플이 인터페이스에 완전히 흡착 될 때까지 기다리십시오. 이것은 새로운 버블 인터페이스로 다시 시작하는 대신 흡착 연구 직후에 수행 할 수 있습니다.
  3. 적절한 탭을 선택하고 원하는 기준선 값, 진동% 및 진동 주파수(그림 4-7)를 입력하여 진동이 압력 진동, 면적 진동 또는 곡률 진동인지 여부를 결정합니다.
    참고: 톱니, 정사각형 및 삼각형 파동 영역 진동은 기타 영역 진동 탭의 드롭다운 메뉴에서도 액세스할 수 있습니다.
  4. 공초점 비디오의 녹화를 시작하고 CPM 소프트웨어에서 데이터 수집(그림 4-6)을 클릭합니다.
  5. 진동을 시작합니다. 최상의 결과를 얻으려면 적어도 일곱 사이클을 기록해야 합니다. 데이터 수집 속도(그림 4-6)를 선택하여 각 발진 주기에 대해 적절한 수의 데이터 포인트를 제공합니다.
  6. 다른 진동 진폭 또는 주파수가 필요한 경우 실험 중에 값을 변경하십시오.
  7. 5.6단계와 5.7단계와 같이 결과를 저장합니다.

7. 용매 교환 연구

  1. CPM 소프트웨어를 압력 제어 모드로 유지하는 오토클레이브 피펫을 사용하여 셀을 샘플로 채웁니다. 새로운 버블 인터페이스가 생성될 때 표면 장력이 약 73mN/m인지 확인하십시오.
    참고: 흡착 및/또는 진동 연구는 용매 교환 연구 이전에 수행될 수 있다.
  2. 입구 튜브를 원하는 교환 용액 병(그림 3-11)과 연동 펌프(그림 3-10)에 연결합니다.
  3. 공초점 소프트웨어에서 비디오 녹화를 시작하고 CPM 소프트웨어에서 데이터 수집(그림 4-6)을 클릭합니다.
  4. 연동 펌프 속도를 설정합니다. 이것은 유체 교환 속도를 제어하며 실험에 대한 요구 사항, 즉 용매를 얼마나 빨리 교환해야하는지에 따라 선택되어야합니다.
  5. 여러 유체를 교환해야 하는 경우 연동 펌프를 중지하고 입구를 다른 교환 솔루션에 연결합니다.
  6. 교환이 완료된 후(~20분) 5.6단계와 5.7단계와 같이 결과를 저장합니다.

8. 불용성 계면활성제 흡착

참고: 흡착될 계면활성제가 저장고 액체에 용해되지 않는 경우, 이 방법은 단층을 세포의 공기/물 계면으로부터 기포 표면으로 전달하는 데 사용될 수 있다. 많은 이중층 형성 지질은 식염수 용액에 거의 불용성이며 저장고 용액에 현탁될 때 기포에 자발적으로 흡수되지 않는다.

  1. CPM 소프트웨어를 압력 제어 모드로 유지하는 오토클레이브 피펫을 사용하여 셀을 샘플로 채웁니다. 새로운 버블 인터페이스가 생성될 때 표면 장력이 약 73mN/m인지 확인하십시오.
  2. 불용성 계면활성제의 단일층을 휘발성 유기 용액 중의 용액으로부터 세포의 공기-물 계면 상에 증착한다. 주사기를 사용하여 계면에 작은 물방울을 증착하고 용매가 증발하여 지질을 박막으로 남겨 둡니다.
    주의: 클로로포름은 포스파티딜콜린 및 지방산과 같은 인지질의 용매로 사용됩니다. 확산 용액은 보통 용매의 mL 당 0.01-0.02 mg의 지질이다. 클로로포름은 독성이 강하고 피부와 눈에 자극을 줄 수 있으며 발암 성입니다. 적절한 눈 보호, 실험실 코트 및 장갑을 착용하고 흄 후드에 용액을 만드십시오.
  3. 거품이 거의 평평해질 때까지 기포의 중심선 압력 제어(그림 4-7)를 통해 표면적을 줄입니다. 이것은 계면활성제가 흡착된 후에 거품이 터지는 것을 방지한다.
  4. 공기/물 계면이 모세관의 끝을 지나 이동할 때까지 직접 세포 주사기를 통해 세포에서 저수지 액체를 제거합니다. 주사기 펌프를 사용할 수 있지만, 이 단계는 주사기를 수동으로 사용하여 달성될 수 있다.
  5. 저수지 액체 높이를 초기 수준으로 높입니다.
    참고: 팁이 다시 잠기면 현재 계면에 흡착된 계면활성제로 인해 거품이 더 커집니다. 단층은 이제 진동 또는 용매 교환 실험을 위해 준비될 것이다.

9. 정리

  1. CFM을 끕니다.
  2. 압력 제어 모드로 변경합니다.
  3. 피펫을 사용하여 셀에서 샘플을 제거합니다. DI 물로 셀을 로드하고 ~ 50mbar까지 압력을 높여 거품이 모세관을 지속적으로 빠져나와 모세관 팁을 청소합니다. 이 과정을 2 배 반복하십시오.
  4. 안전 밸브를 닫고 왼쪽 상단 모서리에 있는 빨간색 버튼을 클릭하여 CPM을 끄고 표시등 및 파란색 압력 컨트롤 패널을 끄고 압력 소스를 닫습니다.
  5. 공초점 현미경 단계에서 세포를 제거하십시오. 에탄올과 DI 물로 세포를 헹구십시오. CPM 세포로부터 모세관 튜브를 제거한다.

10. 셀 청소

  1. 셀을 분해합니다. DI 물로 헹구는 동안 칫솔로 안쪽 벽을 닦으십시오. 부분을 에탄올에 담그고 ~ 30 분 동안 초음파 처리하십시오.
  2. DI 물로 모든 부분을 몇 번 헹구십시오. 질소 가스로 불거나 진공 오븐 안에서 건조시켜 부품을 건조시킵니다.

11. 진동 분석

  1. Dilatational_Rheology_Analysis.m 코드(보조 코딩 파일 2)를 실행하여 CPM 가상 인터페이스에서 저장할 원하는 파일을 선택합니다. 샘플 데이터는 보충 파일에 포함됩니다.
  2. 압력 대 시간 플롯은 보충 그림 1과 같이 표시됩니다. 진동이 시작되는 지점을 마우스 왼쪽 단추로 클릭하고 진동이 끝나는 지점을 다시 마우스 왼쪽 단추로 클릭합니다. 데이터에 여러 진동이 포함된 경우 모든 진동에 대해 이 프로세스를 반복합니다.
    1. 모든 시작점과 끝점을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하면 아무 곳에서나 마우스를 마우스 오른쪽 단추로 클릭합니다. 예를 들어, 보충 그림 1에 표시된 것처럼 1, 2, 3 및 4 지점을 마우스 왼쪽 단추로 클릭한 다음 마우스 오른쪽 단추를 클릭할 수 있습니다.
      참고: 코드는 확장 모듈러스와 위상각을 계산하고 결과는 원래 파일 위치의 새 .csv 파일에 기록됩니다. 샘플 데이터에 대한 결과는 보충 코딩 파일 2에 제공된 코드 결과에서 볼 수 있습니다. MATLAB은 또한 보충 그림 2와 같이 데이터의 여러 그래픽 표현을 생성합니다.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

측정 오류의 주요 원인은 절단 공정(그림 5A,B) 또는 코팅 공정(그림 5D)에서 결함이 있는 모세혈관에서 발생합니다. 두 가지 유형의 결함 모두 광학 이미지 분석 시스템에 의해 버블 모양과 크기를 결정하는 데 오류를 일으켜 부정확 한 표면 장력 값을 초래합니다. 모세관을 CPM에 삽입하기 전에 광학 현미경으로 당겨서 코팅 한 후에 각각의 새로운 모세관을 신중하게 검사하는 것이 중요합니다. 잘못 절단된 모세관은 폐기해야 하지만, 제대로 코팅되지 않은 모세관은 산-세척되고 재코팅되어 모세관의 끝에서 버블 핀닝을 개선할 수 있다(프로토콜의 2단계). 모세관은 엔드 컷이 모세관(그림 5C)과 모세관 끝에 직접 있는 버블 핀(그림 5E)에 완벽하게 수직인 경우에 가장 잘 작동합니다. 모세관의 ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

결합 된 CPM / CFM은 계면 역학, 평형 및 형태를 검사하기위한 강력한 도구입니다. 이 프로토콜은 CPM/CFM으로 데이터를 얻는 데 필요한 단계를 설명합니다.

도 2는 표시된 모세관, 용매 및 열 교환을 위한 채널을 갖는 셀 설계를 도시한다. 용매 교환을위한 입구는 세포의 하단에 있어야하며 출구는 상단에 있어야하므로 교환 중에 셀이 오버플로되지 않도록해야합니다. 실제로, 입구 및 출구 유량은 동일한 연동 펌프에 대해 약간 다를 수 있다. 이 셀 설계의 한 가지 일반적인 문제점은 셀에서 누출되는 것입니다. 이것은 셀과 연결 중 하나 사이의 연결 불량으로 인해 가장 자주 발생하지만 모든 연결이 건조하고 누출되지 않으면 셀을 둘러싼 볼트의 과도한 조임으로 인해 셀의 유리 슬라이드에 균열이 생길 수 있습니다.

그림 3은 다양...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

모든 공초점 현미경 이미지는 니콘 A1RHD 멀티포톤 직립 공초점 현미경을 사용하여 수득하였다. 우리는 미네소타 대학의 대학 이미징 센터에서 지원 직원, 특히 기예르모 마르크스 (Guillermo Marques)의지도와 도움을 인정합니다. 이 작업은 NIH Grant HL51177에 의해 지원되었습니다. SI는 Ruth L. Kirschstein NRSA Institutional Research Training Grant F32 HL151128의 지원을 받았다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 O.D. Tygon 튜빙Fischer Scientific튜빙
A1RHD 다광자 정립 컨포칼 현미경Nikon컨포칼 현미경
산 세척 용액물로 50% 희석한 황산 및 알노크로믹스
알노크로녹Alconox2510희석 전에 맑아질 때까지 기다립니다.황산과 혼합하여 포장 지침과 희석하여 산성 세척 용액을 만듭니다
세라믹 유리 커터Sutter Instruments
클로로포름시그마-알드리치650471HPLC 플러스
CurosurfChiesi  폐 계면 활성제
Di Water18.5 M & Omega; - cm
에탄올어떤200 증거는 소수성에 사용되며, 변성 청소에 사용
Fiber-Lite 모델 190 광섬유 조명기Dolan-Jenner Industries Inc.281900100광원; 다른 광원들도 작동해야 합니다
플로우 EZ F69 mbar w/Link 모듈플루이젠LU-FEZ-0069미세유체 펌프
플루이젠트 SDK VIs플루이젠CPM 가상 인터페이스에 필요
플루오로엘라스토머 가스켓1mm 두께의 Viton 시트로 가공, 그림 3 참조
가스 필터NorgrenF07-100-A3TG미세유체 펌프와 압력 조절기 사이에 놓기
가스 조절기Norgren10R0400R가스 필터 범위 2-120psi에 연결된 펌프 범위로 압력을 낮추
CapilarySutter InstrumentsB150-86-10붕규산 유리 O.D. 1.5mm I.D. 0.86mm
유리 슬라이드75mmx 25mm
유리 주사기Hamilton8487825 &뮤; L 유리 주사기
소수성 제제Sigma-Aldrich6674201H, 1H, 2H, 2H-Perfluoro-octyltriethoxysilane 98 %, 기타 소수성 트리에 톡시 실란으로 대체 될 수
불용성 계면 활성제Avanti850355C-200mg16 : 0 DPPC
LabVIEW 소프트웨어National Instruments2017
Longpass FilterThorLabsFEL0650650nm 롱패스 필터, 파장은 여기를 제거해야 합니다. 레이저 주파수
Lyso-PCAvanti855675P16:0 Lyso PC 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine
Masterflex L/S 가변 속도 아날로그 콘솔 펌프 시스템 w/  Easy-Load II 펌프 헤드MasterflexHV-77916-20연동 펌프
MATLABMathworksR2019
마이크로피펫 풀러 P-1000셔터 기기모세관 풀러
미세 장력계 셀 및 홀더PEEK로 가공된 셀, 알루미늄으로 가공된 홀더, 그림 3 및 4
마이크로 장력계 대물Nikon참조Fluor 20x/0.50W DIC M/N2 &n2 ∞/0 WD 2.0 mm
NI Vision Development ModuleNational InstrumentsRequired for CPM virtual Interface
PEEK 핑거 타이트 피팅IDEXF-120x10-32 콘 포트
PEEK 플러그IDEXP-55110-31 콘 포트
피펫 팁Eppendorf22492225100 μ L - 1000 &뮤; L, 오토클레이브
플라스틱 겸자Thermo Scientific6320-0010
플라스틱 주사기Fischer Scientific14-955-45910mL
배관 부품Fischer Scientific3방향 밸브 및 기타 배관 부품으로 튜브를 연결합니다.
리서치 플러스 1채널 100 μ L– 1000 &뮤; LEppendorf3123000063Micro pipetter
Sulfuric Acid산성 세척 용액에 사용
T Plan SLWD 20x/0.30 OFN25 WD 30mmNikonConfocal Microscope Objective
Texas Red DHPE triethylammonim saltThermo Fischer Scientific1395MPFluorophore
Vaccum PumpGastDOA-P704-AA
, 스 . . 트 트 십시오. 유리 있습니다 클로로포름의, 렌즈

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