깨어 있는 생쥐의 소교세포 역학 및 신경 활동의 동시 이미징

신체의 내부 상태가 동물의 뇌 기능에 지속적으로 영향을 미친다는 증거가 늘어나고 있습니다 1,2,3,4,5. 따라서 뇌 기능에 대한 더 깊은 이해를 얻으려면 뇌의 신경교 세포가 말초의 생물학적 상태를 모니터링하고 정보를 뉴런에 전달하는 방법을 밝히는 것이 중요합니다.

뇌의 면역 세포인 미세아교세포는 시냅스 발달과 가소성에 관여하며, 이는 뇌의 신경 회로의 특성을 조각합니다 ^6,7,8,9. 예를 들어, Wake et al.의 선구적인 연구는 소교세포 과정이 마우스 신피질에서 뉴런 활동 의존적 방식으로 시냅스와 접촉하고 인공 허혈이 미세아교세포와 장기간 접촉한 후 시냅스 손실을 유발한다는 것을 입증했습니다¹⁰. Tremblay et al. 시각적 경험의 변화가 시냅스와의 소교 세포 상호 작용의 양식을 변화시킨다는 것을 발견했다. 일차 시각 피질(V1)의 수지상 척추 회전율이 양안 박탈에 의해 증가하는 중요한 기간 동안, 암흑 적응은 소교세포 과정의 운동성을 감소시키고 시냅스 틈새와의 접촉 빈도와 미세아교세포에 내포된 세포 개재물의 수를 모두 증가시킨다¹¹. 이러한 결과는 소교세포 과정이 신경 활동과 주변 환경을 감지하여 신경 회로를 리모델링한다는 것을 시사합니다. 또한, 최근 연구에 따르면 소교세포 감시는 깨어 있는 상태와 마취된 상태 간에 차이가 있으며, 이는 생리학적 조건에서 뉴런-미세아교세포 통신을 조사하기 위해 깨어 있는 마우스를 사용한 실험의 중요성을 시사한다¹².

생체 내 이광자 칼슘 이미징은 살아있는 동물^13,14,15에서 동시에 수백 개의 뉴런에서 진행 중인 뉴런 발화를 반영하는 칼슘 역학을 기록하는 강력한 도구입니다. 뉴런의 칼슘 이미징은 일반적으로 빠른 뉴런 반응을 추적하기 위해 수 Hz 이상의 시간 분해능을 필요로 한다^16,17. 대조적으로, 소교세포 역학을 추적하는 이전 연구에서는 0.1Hz 미만의 비교적 낮은 시간 분해능에서 소교세포 구조를 샘플링했습니다^18,19,20. 최근의 한 연구에서는 뉴런-미세아교세포 통신을 이해하기 위해 동시 이광자 이미징을 적용했습니다²¹. 그러나 동적 소교 세포가 깨어있는 마우스에서 수 Hz 이상의 시간적 해상도로 주변 신경 활동에 어떻게 반응하는지는 여전히 불분명합니다. 이 문제를 해결하기 위해 우리는 깨어 있는 마우스에서 1Hz 이상의 시간 해상도를 가진 신경 활동과 소교세포 역학의 동시 생체 내 이광자 이미징 방법을 설명합니다. 이 방법을 사용하면 더 높은 프레임 속도(픽셀 프레임 크기가 512 x 512픽셀인 최대 30Hz)로 깨어 있는 마우스에서 안정적인 이미징을 달성할 수 있으며 미세아교세포의 감시 행동 또는 깨어 있는 마우스의 신경 활동과의 상호 작용을 조사하는 데 더 유리한 방법을 제공합니다.

모든 실험은 도쿄대학 의학연구과 의학부의 동물윤리위원회와 유전자 재조합 실험 안전성 위원회의 승인을 받아 그 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 준비

1. 오토클레이브 또는 70% 에탄올을 사용하여 수술에 필요한 모든 기구와 기구를 소독합니다.
2. 유리 피펫 준비.
   1. 75μL 보정된 모세관을 마이크로피펫 풀러 홀더에 단단히 고정합니다. P(압력) = 500, HEAT = 680, PULL = 30, VEL = 60, TIME = 180과 같은 권장 매개변수를 사용하여 풀러를 프로그램으로 설정합니다.
   2. 프로그램을 마친 후 (보통 4.5-5 초), 모세관은 테이퍼 꼬리가있는 두 개의 유리 피펫으로 나뉩니다. 그런 다음 핀셋으로 꼬리의 말단 부분을 부수어 팁 직경을 30-50 μm 이내로 유지합니다. 이를 위해 경 사진 부분의 끝에서 1cm 떨어진 꼬리를 부러 뜨립니다.
3. 개두술의 경우 UV 광 경화 시약을 사용하여 직경 4mm, 두께 0.15mm ± 0.02mm의 더 큰 외부 유리 디스크를 직경 2mm, 두께 0.525mm ± 0.075mm의 더 작은 내부 유리 디스크에 접착하여 두개골 창을 준비합니다(그림 2A).

2. AAV 주입

1. 주사 장치의 제조
   1. 튜브를 통해 26G Hamilton 주사기에 연결된 유리 피펫을 정위 기구의 피펫 홀더에 놓은 다음 피펫 홀더를 세로축에서 앞쪽으로 60° 기울입니다(그림 1A, B).
   2. 유리 피펫, 주사기 및 연결 튜브에 액체 파라핀을 채웁니다. 주사기를 마이크로 인젝터에 놓습니다.
2. 수술
   참고: 다음 수술은 멸균된 부스에서 수행되었습니다. 필요한 경우 수술을 위해 실체 현미경을 사용했습니다.
   1. 7-8주령(체중 22-26g)의 수컷 CX3CR1-EGFP 마우스( 재료 표의 자세한 정보)를 기밀 챔버에서 3% 이소플루란으로 마취합니다. 3분 후 마우스가 호흡을 제외한 자발적인 움직임을 잃으면 챔버에서 꺼내고 2% 이소플루란이 함유된 비강관으로 연속 마취로 전환합니다.
      참고: 이소플루란은 미세아교세포를 활성화시키는 것으로 알려져 있습니다. 그러나 이미징은 수술 후 4주 후에 수행되기 때문에 이미징 동안 마우스에 대한 이소플루란의 영향은 없습니다. 이소플루란 마취는 이미징 전에 마우스를 정위 기구에 넣을 때 몇 분 동안 사용되지만(단계 4.2.1), 이 짧은 마취의 효과는 무시할 수 있는 것으로 나타났습니다.
   2. 수술 중 저체온증을 예방하기 위해 37°C의 가열 패드로 마우스를 따뜻하게 유지하십시오. 각막 건조를 예방하기 위해 양쪽 눈에 안연고를 바르고 멜록시캄 주사를 피하(5mg/kg)합니다. 마우스를 보조 이어 바에 부착 한 다음 마우스를 등쪽이 위로 향하게하여 정위 악기에 고정합니다.
   3. 호흡과 심박수를 모니터링하면서 수술 중 이소플루란 농도를 적절한 비율(1%-2%)로 조정합니다. 제모 크림을 사용하여 머리카락을 제거하고 요오드 기반 또는 클로르헥시딘 기반 스크럽과 알코올로 원을 그리며 머리를 여러 번 소독하십시오. 그런 다음 0.1mL의 1% 리도카인을 피하에 주사하고 멸균 드레이프를 적용하여 수술 부위를 고정합니다.
   4. 가위로 정중선을 따라 두피를 절개하고 약 2cm 길이의 절개를 만들어 오른쪽 일차 시각 피질 위의 두개골이 잘 노출되도록 합니다. 두피를 절개한 후 노출된 두개골과 뇌가 건조해지는 것을 방지하기 위해 전체 절차에 걸쳐 식염수로 머리를 관개합니다.
   5. 집게를 사용하여 노출 된 두개골의 골막을 제거하십시오. 정위 좌표에 두개골을 뚫습니다 : 정중선에서 측면으로 3mm, 람다 선에서 전방 0.5mm, 직경이 약 0.5mm 인 작은 구멍을 만듭니다. 필요한 경우 드릴 비트에서 혈액과 조직 파편을 헹굽니다.
   6. 다음 절차에 따라 8.3 x 10 12 벡터 게놈/mL²²의 역가에서 다음 절차를 사용하여 1μL의 rAAV2/1-hSyn-R-CaMP1.07로 유리 피펫을 채웁니다.
      1. 주사기를 전진시켜 유리 피펫에서 1μL의 액체 파라핀을 배출합니다. 마우스의 노출된 두개골에 약 2cm x 2cm의 투명 필름 조각을 놓고 피펫터를 사용하여 필름에 AAV 용액 1μL 방울을 배출합니다.
      2. 유리 피펫 팁을 필름의 AAV 용액 방울에 넣고 주사기를 부드럽게 당겨 AAV 용액을 흡인합니다. 배출 후 T자형 마개를 돌려 튜브와 유리 피펫 내부의 압력을 해제합니다.
   7. 2.2.5단계에서 만든 구멍을 통해 뇌 표면에서 500μm 깊이까지 유리 피펫을 삽입한 다음 마이크로 인젝터를 사용하여 AAV 용액 0.5μL를 주입합니다(그림 1C). 2.0 μL/h의 주입 부피 유량을 사용하십시오. 0.5 μL의 주입은 15 분이 걸리고 이후 5 분 동안 기다립니다.
   8. 주사 후 유리 피펫을 부드럽게 빼내고 식염수로 뇌 표면을 헹굽니다.

3. 두개골 창 이식

참고: 두개골 창 이식은 같은 날 AAV 주사 후에 이루어집니다.

1. 두개골에 직경 2.5mm의 원을 표시하고 람다에서 측면으로 3mm 중앙에 표시합니다. 드릴링하여 두개골의 표시를 따라 원형 홈을 만듭니다. 두개골의 시야에 악영향을 미칠 수 있으므로 파편을 청소하고 드릴링 과정에서 식염수를 도포하여 가열을 방지하십시오.
2. 원형 홈의 드릴링 깊이가 중앙 두개골 조각을 제거하기에 충분한지 확인하려면 집게로 중앙 두개골을 부드럽게 누릅니다. 저항이 거의 없이 수직으로 움직이면 드릴링 깊이가 충분합니다.
3. 홈이 충분한 깊이에 도달하면 집게의 끝을 중앙 두개골 조각의 바닥에 삽입하고 부드럽게 들어 올려 제거하여 뇌 표면을 노출시킵니다(그림 1D).
4. 27G 바늘을 사용하여 노출된 뇌 표면의 가장자리에 있는 경막을 찔러 찢습니다. 경막 가장자리에 생긴 구멍을 통해 집게의 끝을 삽입하십시오. 경막을 잡고 떼어내어 뇌 표면을 노출시킵니다.
   알림: 출혈이 발생하면 출혈이 멈출 때까지 식염수로 뇌 표면을 헹굽니다.
5. 집게를 사용하여 지혈 섬유를 3.5mm 접시에 식염수에 하나씩 분산시킨 다음 횡단 된 경막이있는 구멍의 가장자리를 따라 지혈 섬유를 놓습니다.
6. 노출된 뇌 표면에 1.3단계에서 준비한 두개골 창을 놓은 후 창이 두개골에 밀착되도록 창을 부드럽게 누르면서 순간 접착제로 두개골에 부착합니다.
7. 그런 다음 노출된 두개골 전체에 순간 접착제를 바른 다음 창이 헤드플레이트의 사각형 구멍 중앙에 위치하도록 헤드플레이트를 두개골에 조심스럽게 부착합니다(그림 2C). 헤드 플레이트의 표면이 유리창의 표면과 평행한지 확인하십시오.
8. 접착제가 충분히 굳은 후 노출된 두개골에 치과용 시멘트를 도포하여 헤드와 헤드 플레이트 사이의 부착을 강화합니다(그림 2).
   참고: 실험에 마우스에 시각적 자극을 제공하는 것이 포함된 경우 이미징 영역으로 미광을 피해야 합니다. 빛 반사를 줄이기 위해 활성탄과 혼합하여 시멘트를 검게 만드는 것이 좋습니다.
9. 시멘트가 충분히 경화 된 후 (약 20 분) 마취에서 마우스를 빼냅니다. 그런 다음 마우스를 새 케이지에 넣어 혼자 회복합니다.
10. 의식과 자발적인 움직임을 확인한 후 완전한 회복을 나타내는 마우스를 다시 홈 케이지에 넣습니다. 회복하는 동안 명백한 통증 표시 행동이 발생하면 필요한 경우 두 번째 또는 그 이상의 멜록시캄 용량(1-3일 동안 24시간마다 한 번)을 투여하십시오.

4. 미세아교세포와 신경 칼슘 역학의 생체 내 이광자 이미징

1. 현미경 장치에 대한 마우스의 습관화
   1. 수술 3주 후, 3% 이소플루란으로 마우스에 마취를 유도하고, 맞춤형 정위 기구를 사용하여 이광자 현미경의 25x 대물렌즈 아래에 마우스를 놓았다(도 3C). 여기에서 설정을 위해 마우스는 러닝머신 상단에 설정되고 자유롭게 달릴 수 있습니다.
   2. 약 10분 후 현미경 단계에서 마우스를 꺼내 홈 케이지로 되돌립니다. 이광자 이미지 획득 전에 격일로 최소 3회 습관화를 반복합니다.
2. 이광자 이미지 획득
   참고: 소교세포 활성화가 점차 기저 수준으로 돌아오므로 수술 후 4주 이상 이미지 획득을 수행하는 것이 좋습니다.
   1. 단계 4.1에서와 같이, 마우스에 3% 이소플루란으로 마취를 유도하고, 맞춤형 정위 기구를 이용하여 이광자 현미경의 대물렌즈 아래에 마우스를 놓는다.
   2. 아래 설명된 대로 시각적 자극을 위해 맞춤형 음영 장치와 LCD 모니터를 설치합니다(그림 3D).
      1. 뇌 표면에 초점을 맞추도록 렌즈를 배치한 다음 이 렌즈 위치를 원래 Z 위치로 설정합니다. xy 좌표를 일정하게 유지하고 대물 렌즈를 높입니다. 대물 렌즈와 트레드밀에서 마우스와 정위 기구를 제거합니다.
      2. 숯가루와 섞어 검게 변한 실리콘을 사용하여 헤드플레이트 상단에 차광장치를 부착하고, 헤드플레이트와 차광장치 사이의 공간이 잘 밀폐되도록 한다.
      3. 음영 장치를 증류수로 채운 다음 마우스와 정위 프레임을 대물렌즈와 러닝머신 아래에 다시 고정합니다. 뇌 표면의 초점면을 조심스럽게 재설정하여 대물 렌즈의 깊이를 확인하십시오.
         알림: 대물 렌즈가 손상될 위험을 방지하려면 먼저 xyz 좌표를 설정한 다음 대물 렌즈의 음영 장치를 적용하십시오. 덮개를 먼저 설치 한 다음 좌표를 조정하는 것이 합리적이지만이 옵션의 경우 신중한 취급이 필요합니다.
      4. 대물 렌즈를 통한 시각적 자극에 사용되는 LCD 모니터의 빛 오염을 방지하기 위해 대물 렌즈를 검은색 알루미늄 호일로 덮습니다(그림 3D). 10인치 LCD 모니터를 마우스 눈 앞 12.5cm로 설정하여 시각적 자극을 표시합니다(그림 3D).
   3. 형광 방출 수집 필터를 EGFP 형광(525/50nm 방출 필터) 및 R-CaMP 형광(593/46nm 방출 필터)으로 구성하고 여기 파장을 1,000nm로 구성합니다. 25x 1.1 NA 대물렌즈와 GaAsP PMT를 사용하여 0.25μm/픽셀의 공간 분해능으로 이미지를 획득합니다.
   4. R-CaMP(+) 뉴런과 EGFP(+) 미세아교세포가 2/3층에서 동시에 이미징될 수 있는 이미징 영역을 찾습니다. 이 설정을 위해 그림 4 와 비디오 1 에서 얻은 데이터는 라이브 이미지 미리보기를 사용하여 pial 표면에서 100μm 깊이에 있었습니다. 여기 레이저의 출력을 가능한 한 낮게 유지하여 이미징 영역의 국소 온도 상승으로 인한 광 표백 및 손상을 방지하십시오.
   5. 30Hz의 프레임 속도로 이미지를 획득합니다. 이미지 획득과 동시에 100% 대비, 1.5Hz, 0°에서 150°까지 30° 단계로 6개 방향에서 12개 방향으로 0.04주기/도에서 드리프트 격자 시각적 자극을 마우스에 제공합니다(¹⁷).
   6. 이미지 획득 후 현미경 단계에서 마우스를 제거하고 마우스에서 음영 장치와 입체 도구를 분리한 다음 마우스를 홈 케이지로 되돌립니다.
3. 데이터 등록
   1. 획득한 이미지 데이터(이 경우 nd2 형식)를 Fiji 또는 현미경과 함께 제공된 소프트웨어를 사용하여 각 색상 채널에 대한 일련의 tiff 이미지 파일로 변환하고 저장합니다.
   2. 피지의 플러그인인 Turboreg를 적용하여 mode = translation으로 등록을 수행합니다. EGFP 채널의 tiff 이미지 파일과 함께 평균 이미지를 참조 이미지로 사용합니다.
   3. MATLAB을 사용하여 각 프레임에 대해 다음과 같은 처리를 수행합니다.
      참고: MATLAB은 다음 처리에 사용되지만, 여기서는 Python과 같은 다른 프로그래밍 소프트웨어에서 데이터를 분석할 수 있도록 각 단계의 의도에 주로 초점을 맞춥니다.
      1. imread 함수를 사용하여 동일한 프레임을 정합하기 전과 후에 각각 두 개의 EGFP tiff 영상을 읽어 들입니다. imread 함수를 사용하여 동일한 프레임의 R-CaMP tiff 영상을 읽어 들입니다.
      2. normcorr2 함수를 사용하여 4.3.3.1단계에서 읽은 두 GFP 영상의 벡터화된 변수 간의 상관 함수를 계산합니다.
      3. max 함수를 사용하여 상관 함수의 교차 상관이 가장 높은 선형 인덱스를 감지한 다음 ind2sub 함수를 사용하여 원본 이미지에서 등록된 이미지의 이동 위치를 계산합니다.
      4. imwarp 함수를 사용하여 R-CaMP 영상을 4.3.3.3단계에서 계산된 위치로 변환한 다음 imwrite 함수를 사용하여 R-CaMP의 등록된 영상을 저장합니다.
4. 칼슘 미량 생성
   1. MATLAB을 사용하여 다음 처리를 수행합니다. imread 함수를 사용하여 4.3.3.4단계에서 생성된 등록된 모든 R-CaMP tiff 영상을 읽어 들입니다. 등록된 이미지가 이미 작업 공간에 변수로 로드된 경우 이 단계를 생략합니다.
   2. mean 함수를 사용하여 시간 투영 영상을 생성합니다. imshow 함수를 사용하여 평균화된 영상을 Figure로 표시합니다. ROIPOLY 함수를 사용하여 대상 구조(이 데이터의 수지상 척추)의 이진 ROI 마스크를 생성합니다.
   3. 이진 마스크에 각 프레임의 이미지를 입력 변수로 곱하여 얻은 이미지와 함께 mean 함수를 사용하여 각 프레임에 대한 ROI 내의 평균 형광 강도를 계산합니다.
   4. 앞서^설명한 바와 같이, 4.4.3 단계에서 얻은 변수에 고주파 잡음을 절단하기 위해 컷오프 = 1.6초에서 버터 가치 주파수 필터를 적용한 다음, 저주파 잡음을 절단하기 위해 시간 창 = 200초에서 슬라이딩 중앙값 필터를 적용합니다.

우리는 이 프로토콜에 설명된 대로 8주령 CX3XR1-EGFP 형질전환 마우스의 V1에서 AAV 주사 및 두개골 창 이식을 수행했습니다. 수술 4주 후, 우리는 V1의 2/3층에서 R-CaMP 기반 신경 활동과 소교세포 역학에 대한 생체 내 이광자 이미징을 동시에 수행했습니다(그림 4 및 비디오 1). 이미징 동안, 마우스를 러닝 머신에 놓고 자유롭게 달릴 수 있도록했습니다. 이미지는 25x, 1.1NA 대물렌즈 및 GaAsP PMT를 사용하여 0.25μm/픽셀의 공간 해상도로 30Hz의 프레임 속도로 획득되었습니다. EGFP와 R-CaMP는 모두 1,000nm의 파장에서 여기되었고, EGFP 형광(525/50nm 방출 필터)과 R-CaMP 형광(593/46nm 방출 필터)이 동시에 수집되었습니다. 모션 아티팩트를 최소화하기 위해 수집된 데이터를 등록한 후 배경 노이즈를 줄이기 위해 4프레임마다 1프레임으로 평균화했습니다. 격자 시각적 자극을 마우스에 제시하고 뉴런과 개별 수지상 가시의 시각적 반응을 분석했습니다(그림 4D). 미세아교세포과정은 빠른 역동성을 보였고 10초 이내에 형태가 변했습니다(그림 4E 및 비디오 1). 논의 섹션에서 자세히 설명했듯이 AAV 주입이 실패했을 때 R-CaMP의 발현을 감지할 수 없었습니다. 수술이 성공적이지 않으면 EGFP와 R-CaMP의 신호를 관찰할 수 없었습니다.

그림 1: AAV 주입 . (A) 실리콘 튜브를 사용하여 유리 피펫을 26G Hamilton 주사기에 연결했습니다. (B) AAV 주입을 위한 설정. (C) AAV 용액은 수직 축에서 전방으로 60° 기울어진 유리 피펫을 통해 주입되었습니다. (D) 열린 두개골 절차의 개략도(3.3단계에서 설명됨). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 두개골 창 및 헤드 플레이트. (A) 두개골 창 이식의 개략도. (B) 맞춤형 헤드 플레이트가 사용되었습니다. 오른쪽 반구에서 촬영하려면 오른쪽에 짧은 팔을 사용해야 합니다. (C) 두개골 창과 이식된 머리 판이 있는 마우스의 등쪽 모습. (D) 그림 2C에 표시된 두개골 창의 고배율도. (E) 맞춤형 정위 기구로 고정된 마우스의 등쪽 모습. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 생체 내 이광자 이미징을 위한 설정. (A) 차광 장치의 등쪽 모습. (B) 차광 장치의 측면도. (C) 대물 렌즈 아래 헤드 플레이트에 음영 장치가 있는 마우스의 모습. 마우스는 러닝 머신에 놓입니다. (D) 이광자 여기 현미경으로 봅니다. 시각적 자극을 나타내는 모니터가 그림의 오른쪽에 배치됩니다. 대물 렌즈는 모니터에서 대물 렌즈로 빛을 피하기 위해 음영 장치와 검은색 알루미늄 호일로 덮여 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 수지상 척추의 소교세포 역학 및 시각적 반응. (A-C) 12주 된 CX3XR1-EGFP 형질전환 마우스에서 V1의 레이어 2/3에 있는 EGFP(+) 미세아교세포 및 R-CaMP(+) 뉴런의 시간 평균 이미지. 각 채널에서의 신호 강도는 독립적으로 정규화되었다. (D) 수지상 척추의 시각적 반응. 검은색 화살표가 있는 줄무늬 다이어그램은 회색 열로 표시된 타이밍에 표시된 격자 자극의 방향을 나타냅니다. 칼슘 미량에서 회색 선은 개별 반응을 나타내고 검은 색 선은 평균을 나타냅니다. 오른쪽 삽입물에서 노란색 화살촉은 칼슘 미량을 획득하기 위해 관심 영역(ROI)이 생성된 수지상 척추를 나타냅니다. (E) 소교세포과정(청록색 화살촉)은 10초 만에 빠른 후퇴를 보였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

비디오 1: 신경 활동 및 소교세포 역학의 이광자 이미징. 12주 된 CX3XR1-EGFP 형질전환 마우스에서 V1의 레이어 2/3에 있는 EGFP(+) 미세아교세포 및 R-CaMP(+) 뉴런의 이미징 데이터. 영화의 왼쪽에서 자홍색은 뉴런의 R-CaMP를 나타내고 녹색은 미세아교세포의 EGFP를 나타냅니다. 동영상의 중앙은 EGFP 신호에 해당하고 오른쪽은 R-CaMP 신호에 해당합니다. 각 채널에서의 신호 강도는 독립적으로 정규화되었다. 동영상의 프레임 속도는 실제 속도보다 40배 빠릅니다. 스케일 바 = 10 μm 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

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