이 프로토콜은 가이드 RNA의 설계부터 녹아웃 클론의 세포 클로닝 및 특성화에 이르기까지 CRISPR/Cas9를 사용하여 녹아웃 근세포를 생성하는 방법을 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
클러스터형 조절 간격 짧은 고진구 반복(CRISPR)/Cas 9의 한 가지 중요한 적용은 특히 유전자 진단 중에 확인된 질병과 관련된 새로운 유전자/단백질의 기능을 연구하기 위한 녹아웃 세포주의 개발입니다. 이러한 세포주의 개발을 위해서는 두 가지 주요 쟁점이 얽혀 있어야합니다 : 선택된 세포에 고효율로 CRISPR 도구 (Cas9 및 가이드 RNA)를 삽입하고 선택한 유전자의 특정 결실에 대한 Cas9 활성의 제한. 여기에 기술된 프로토콜은 근육 세포와 같은 형질감염되기 어려운 세포에서 CRISPR 도구의 삽입에 전념한다. 이 프로토콜은 공개적으로 이용가능한 플라스미드로 생산된 렌티바이러스의 사용에 기초하며, 이를 위해 모든 클로닝 단계가 관심있는 유전자를 표적으로 하기 위해 기술된다. Cas9 활성의 조절은 KamiCas9라고 불리는 이전에 기술된 시스템의 적응을 사용하여 수행되었으며, 여기서 Cas9를 표적화하는 가이드 RNA를 코딩하는 렌티바이러스를 사용한 세포의 형질도입은 Cas9 발현의 점진적 폐지를 허용한다. 이 프로토콜은 RYR1-녹아웃 인간 근육 세포주의 개발에 적용되었으며, 이는 근육 세포 내 칼슘 방출 및 여기 수축 결합에 관여하는이 중요한 칼슘 채널의 녹아웃을 확인하기 위해 단백질 및 기능적 수준에서 더욱 특성화되었습니다. 여기에 설명 된 절차는 근육 세포 또는 다른 트랜스펙션하기 어려운 다른 유전자에 쉽게 적용될 수 있으며 인간 세포에서 이러한 유전자를 연구하는 데 유용한 도구를 생산할 수 있습니다.
서론
유전자 시퀀싱의 진행과 특정 조직에서 알려지지 않은 기능의 유전자에서 돌연변이의 확인과 함께, 새로운 표적 유전자의 기능을 이해하고 관련 병리 생리학 적 메커니즘에 대한 개입을 확인하는 관련 세포 모델의 개발은 필수적인 도구를 구성합니다. 또한, 이들 모델은 미래의 치료 개발1,2에 매우 중요하며, 실험에서 동물의 사용을 줄이기 위한 국제 권고와 직선으로 녹아웃 동물 모델의 개발에 대한 흥미로운 대안을 구성한다. CRISPR/Cas9를 사용한 유전자 편집은 현재 사용 가능한 가장 강력한 도구 중 하나로, 많은 녹아웃/녹인 모델을 개발할 수 있었으며, CRISPR/Cas9를 사용한 표적 유전자 검증은 CRISPR/Cas93의 가장 널리 사용되는 응용 프로그램 중 하나입니다. 유전자 편집의 성공은 표적 세포 모델에 CRISPR 도구 (가이드 RNAs 및 뉴클레아제 Cas9)를 도입하는 능력에 달려 있으며, 이는 근육 세포4와 같은 많은 형질감염이 어려운 세포에서 도전이 될 수 있습니다. 이 도전은 바이러스, 일반적으로 렌티 바이러스의 사용으로 극복 할 수 있으며, 이는 많은 세포 유형을 효율적으로 형질 도입....
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프로토콜
근육 생검은 유럽 권장 사항 및 프랑스 법률에 따라 연구 용 Tissues 은행 (Myobank, EU 네트워크 EuroBioBank, 파리, 프랑스의 파트너)으로부터 입수되었습니다. 서면 정보에 입각 한 동의는 모든 개인으로부터 얻어졌습니다. 불멸의 근모세포는 V. Mouly 박사 (프랑스 파리의 Myology Institute)에 의해 친절하게 생산되었으며, 프로토콜은 Myology Institute 윤리위원회 (MESRI, n AC-2019-3502)의 승인을 받았습니다.
1. 크리스퍼 가이드 디자인
- 결실될 유전자의 영역을 확인한다. ensembl.org 또는 genome.ucsc.edu 와 같은 게놈 브라우저 도구를 사용하여 게놈 서열을 검색하고 두 영역의 염색체 좌표를 결정하여 삭제할 영역의 양쪽에서 가이드 RNA (gRNA)를 찾습니다.
- 여기에 사용된 유전자의 경우, RYR1 유전자의 FASTA 서열과 엑손 101의 서열을 다음과 같이 구한다. 앙상블에서 인간 게놈의 최신 버전에서 RYR1 을 검색하고 첫 번째 항목을 선택한 다음 단백질 코딩 서열의 전사체를 클릭하십시오. 그런 다음 Exons를 클릭하여 유전....
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결과
이 프로토콜은 건강한 피험자15 (소위 HM 세포, 인간 근모세포의 경우)로부터의 불멸화 근모세포에 적용되었으며, 여기서 RyR1은 RyR1 단백질을 코딩하는 RYR1 유전자를 녹아웃시키기 위해 이전에 특성화16이었다. 가이드 RNA의 설계는 유전자의 엑손 101 및 인트론 101의 일부를 포괄하는 서열을 삭제하도록 만들어졌다. 엑손 101의 일부의 결실은 판독 프레임의 중단을 초래할 것으로 예상된다. 또한, 엑손(101)은 단백질의 기공을 인코딩하고, 따라서 기능성 칼슘 채널을 생성하는데 요구된다. 심각한 RyR1 관련 근병증으로 영향을 받는 많은 환자들은 유전자7의 이 영역에 돌연변이를 갖는다. Crispor 소프트웨어로 예측된 최상의 가이드는 최상의 효율성을 유지하면서 가능한 한 적은 오프 타겟을 확보하기 위해 선택되었습니다. 우리는 동일한 바이러스 벡터에서 동시에 두 개의 가이드.......
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토론
병리학에 관여하는 알려지지 않은 기능의 유전자를 특성화하는 길의 주요 단계는 이러한 유전자의 기능을 연구하기위한 관련 세포 모델의 개발입니다. CRISPR / Cas9를 사용한 유전자 편집의 사용은 기하 급수적으로 성장하는 연구 분야이며, 여기에 제시된 녹아웃 모델의 개발은 가장 널리 사용되는 응용 분야 중 하나입니다. 이러한 맥락에서, 우리는 여기서 관심있는 임의의 유전자에서 인간 세포주 녹아웃을 개발하기 위한 다목적 프로토콜을 제안하여, 관련 인간 세포 모델에서 이 유전자의 특성화를 허용한다. 여기에 제시된 프로토콜은 iPSC뿐만 아니라 불멸화 된 근모세포에서도 사용될 수 있으며, 따라서 관심있는 유전자에서 임의의 인간 세포 모델 KO의 생산을 사실상 초래할 수 있습니다.
한계는 이 프로토콜이 불멸화된 세포에 적용되어야 한다는 것인데, 이는 수많은 연속적인 증폭과 함께 세포 클로닝뿐만 아니라 배양의 많은 주간이 요구되기 때문이다. 대안적으로 몇 주 또는 몇 달 동안 증폭 및 .......
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공개 사항
저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
이 작품은 협회 Française contre les myopathies (AFM-Téléthon)와 Auvergne-Rhône Alpes Région (AURA)의 보조금으로 지원되었습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 항CACNA1S 항체 | Sigma-Aldrich | HPA048892 | Primary 항체 |
| Blp I | NE BioLabs | R0585S | 제한 효소 |
| CalPhos 포유류 트랜스펙션 키트 | Takara | 631312 | 트랜스펙션(Transfection) 키트 |
| 이지 블롯 안티 마우스 IgG | GeneTex | GTX221667-01 | HRP 보조 항체 |
| 이지 블롯 안티 Rabbit IgG | GeneTex | GTX221666 | HRP 보조 항체 |
| Fluo-4 직접 | 분자 프로브 | F10472 | 칼슘 이미징 |
| GAPDH(14C10) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | #2118 | Primary antibody |
| HindIII | Fermentas | ER0501 | Restriction enzyme |
| InFusion HD Precision Plus | Takara | 638920 | Ligation kit |
| MasterMix Phusion High Fidelity with GC | ThermoFisher Scientific | F532L | Mix for PCR reaction with High fidelity Taq polymerase and dNTP |
| Myosin Heavy Chain antibody | DHSB | MF20 | 기본 항체 |
| NucleoBond Xtra Maxi EF | Macherey-Nagel | REF | 740424 플라스미드 정제를 위한 Maxipreparation 키트 |
| NucleoSpin Gel 및 PCR Clean-up | Macherey-Nagel | 740609 DNA 정제 | |
| 에서 DNA 추출을 위한 | NucleoSpin Tissue | Macherey-Nagel | 740952 |
| One Shot Stbl3 Chemically Competent E. coli | ThermoFisher Scientific | C737303 | Chemically competent cells |
| Plasmid #87904 | Addgene | 87904 | SpCas9 인코딩 렌티바이러스 플라스미드 (LV-Cas9용) |
| 플라스미드 #87919 | Addgene | 87919 | 가이드가 있는 카세트 삽입용 렌티바이러스 백본(LV-가이드 타겟용) |
| 플라스미드 #12260 | Addgene | 12260 | 렌티바이러스 플라스미드 인코딩 GAG POL |
| 플라스미드 #8454 | Addgene | 8454 | 렌티바이러스 및 MuLV 레트로바이러스 입자를 생성하기 위한 렌티바이러스 플라스미드 인코딩 봉투 단백질 |
| V5 태그 단클론 항체 | Invitrogene | R96025 | 1차 항체 |
| XL10-Gold 초역량 세포 | 애질런 | 200317 | 화학적 역량 세포 |
| Xma I | NE BioLabs | R0180S | 제한 효소 |
참고문헌
- Claussnitzer, M., Susztak, K. Gaining insight into metabolic diseases from human genetic discoveries. Trends in Genetics. 37 (12), 1081-1094 (2021).
- Fuster-García, C., García-Bohórquez, B., Rodríguez-Muñoz, A., Millán, J. M., García-García, G.
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재인쇄 및 허가
