표준화 된 쥐 관상 동맥 링 준비 및 용기 직경에 따른 동적 장력 변화의 실시간 기록

요약

본 프로토콜은 래트 관상동맥의 혈관 반응성을 측정하기 위한 와이어 근그래프 기술을 기술한다.

초록

심혈관 시스템 질환의 주요 사건으로 관상 동맥 질환 (CAD)은 전 세계 사람들의 생명과 건강을 심각하게 위협하는 죽상 동맥 경화증, 심근 경색 및 협심증의 주요 원인으로 널리 알려져 있습니다. 그러나 고립 된 혈관의 역동적 인 생체 역학적 특성을 기록하는 방법은 오랫동안 사람들을 당황하게했습니다. 한편, 관상동맥의 정확한 위치 결정 및 분리는 체외 동적 혈관 긴장 변화를 측정하기 위해 CAD 약물 개발의 추세가 되고 있다. 본 프로토콜은 래트 관상동맥의 거시적 동정 및 현미경적 분리를 기술한다. 혈관 직경을 따라 관상동맥 고리의 수축 및 팽창 기능을 확립된 다중 근전도 시스템을 사용하여 모니터링하였다. 샘플링에서 데이터 수집에 이르기까지 관상 동맥 고리 긴장 측정의 표준화되고 프로그래밍 된 프로토콜은 실험 데이터의 반복성을 크게 향상시켜 생리적, 병리학 적 및 약물 개입 후 혈관 긴장 기록의 신뢰성을 보장합니다.

서론

관상동맥 질환(CAD)은 전형적이고 대표적인 심혈관 질환으로 널리 인식되고 우려되고 있으며, 선진국과 개발도상국 모두에서 사망의 주요 원인이 되고 있다 ^1,2. 정상적인 심장 생리 기능을위한 혈액 및 산소 공급 경로로서, 순환 혈액은 심근 ^3,4의 표면에 두 가지 주요 관상 동맥과 혈액 혈관 네트워크를 통해 심장에 들어가고 영양을 공급합니다. 관상 동맥의 콜레스테롤과 지방 침착은 심장의 혈액 공급과 혈관 시스템의 폭력적인 염증 반응을 차단하여 죽상 동맥 경화증, 안정 협심증, 불안정 협심증, 심근 경색 또는 갑작스런 심장 사망을 유발합니다 ^5,6. 관상동맥의 병리학적 협착에 반응하여, 보상적 가속 생리적 심장 박동은 좌심실의 출력을 증가시킴으로써 심장 자체 또는 신체의 중요한 기관의 혈액 공급을 만족시킨다⁽⁷). 장기간의 관상 동맥 협착증이 제 시간에 완화되지 않으면 심장의 특정 영역에서 광범위한 새로운 혈관이 발생할 수 있습니다⁸. 현재, CAD의 임상 치료는 종종 약물 혈전 용해 또는 외과 적 기계적 혈전 용해 및 빈번한 약물 치료와 큰 외과 적 장애가있는 외인성 생체 공학 혈관 우회를 채택^{합니다 9}. 따라서, 관상동맥 생리활성의 기능적 조사는 심혈관 질환⁽¹⁰)에 대한 여전히 시급한 돌파구이다.

생체 내 관상 동맥 압력, 혈관 긴장, 혈중 산소 포화도 및 pH 값¹¹을 동적으로 기록 할 수있는 무선 원격 측정 시스템을 제외하고는 관상 동맥 생리 활성을 검출 할 수있는 기술적 수단이 없습니다. 따라서 관상 동맥의 텍스트 기밀성과 복잡성을 고려할 때 관상 동맥의 정확한 식별 및 분리는 의심 할 여지없이 시험관 내^CAD의 여러 메커니즘을 탐구하기위한 최선의 선택입니다.

시리즈 다중 근그래프 시스템, 특히 와이어 현미경 사진 미세혈관 장력 검출기 ( 재료 표 참조)는 고정밀 및 연속 동적 기록의 특성을 갖는 작은 혈관, 림프관 및 기관지 관의 시험관내 조직 장력 변화를 기록하기 위한 매우 성숙한 시장성 장치이다(¹²). 상기 시스템은 직경이 60 μm 내지 10 mm인 공동구조체의 시험관내 조직 장력 특성을 기록하기 위해 광범위하게 이용되었다. 와이어 현미경 사진의 플랫폼의 연속 가열 특징은 불리한 외부 환경의 자극을 크게 상쇄합니다. 한편, 가스 혼합물 및 pH 값의 일정한 입력은 유사한 생리학적 상태⁽¹³)에서 보다 정확한 혈관 긴장 데이터를 얻을 수 있게 한다. 그러나 쥐 관상 동맥의 해부학 적 국소화의 복잡성을 고려할 때 (그림 1), 그 분리는 다양한 심혈관 질환 및 약물 개발에 대한 메커니즘의 탐구를 혼란스럽게하고 제한하고 있습니다. 따라서, 본 프로토콜은 래트 관상동맥의 해부학적 위치 및 분리 과정을 상세히 소개하고, 이어서 와이어 현미경 사진(¹⁴)의 플랫폼 상에서 장력 측정을 한다.

프로토콜

동물 프로토콜은 청두 전통 중국 의학 대학 (기록 번호 2021-11)의 관리위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다. 수컷 Sprague Dawley (SD) 래트 (260-300 g, 8-10주령)를 본 연구에 사용하였다. 래트를 동물 챔버에 보관하고 실험 중에 자유롭게 마시고 먹을 수 있었다.

1. 용액 준비

1. 118 mM의 NaCl, 4.7 mM의 K⁺, 2.5 mM의 CaCl2, 1.2 mM의_KH2PO4,_1.2mM의 MgCl2∙_6H2O,₂₅mM의 NaHCO3, 11 mM의 D-글루코스, 및 5 mM의 HEPES를 용해시켜 생리적 염 용액 (PSS)을 제조하였다 (물질의 표 참조).
2. 58 mM의 NaCl, 60 mM의 K+, 2.5 mM의 CaCl2, 1.2 mM의 KH2PO4, 1.2 mM의MgCl2∙_6H2O,₂₅ mM의 NaHCO3, 11 mM의 D-글루코스, 및 5 mM의 HEPES를 용해시켜 하이 K⁺ 염 용액을 제조하였다.
3. 상기 두 용액을 포화시키고 기포를 95% O2 및 5%_CO2 의 혼합 가스로 포화_시킨다. 한편, 용액의 pH 값을 2 mM NaOH로 7.38과 7.42 사이에서 유지하십시오.
   참고: 솔루션 준비에 대한 자세한 내용은 참조^15를 참조하십시오.

2. 쥐 관상 동맥 해부

1. 2 % 이소플루란을 흡입하여 쥐를 마취하십시오. 발가락 꼬집음으로 깊은 마취를 확인하고 필요한 경우 추가 마취제를 투여하십시오. 그런 다음 즉시 흉강을 열어 이전에 발표된 보고서⁽¹²)에 이어 휴대용 수술대에 심장을 노출시킨다.
2. 심장을 해리시키고 제거한 후, 의료용 플라스틱 포셉으로 가볍게 짜서 모든 심장 챔버에서 잔류 혈액을 배출하십시오. 전처리된 심장을 4°C에서 95%_O2 + 5%_CO2 포화 PSS를 함유하는 페트리 디쉬에 신속하게 넣고, 7.40의 pH 값을 갖는다.
3. 관상동맥의 해부학적 위치를 정확하게 식별하려면 개략도에 따라 광현미경으로 격리된 심장의 자세를 조정하십시오(그림 2A).
   참고 : 정면보기에서 오른쪽 귀와 폐동맥은 각각 왼쪽 상단과 오른쪽 상단에 있습니다.
   1. 수술 가위와 핀셋으로 폐동맥의 뿌리에서 심실 중격을 따라 좌우 심실 충치를 자릅니다 (그림 2B).
4. 왼쪽 및 오른쪽 관상 동맥을 심근 조직에서 분리하려면 광학 해부학 현미경으로 우심실을 해부하여 오른쪽 관상 동맥 가지를 철저히 노출시킵니다. 그런 다음 심장 조직을 시계 방향으로 45° 회전시켜 좌측 관상동맥의 위치를 확인합니다(그림 2D).
5. 주변의 끈적 끈적한 심근 조직을 제거한 후, 맥박 왼쪽 (약 5mm) 및 오른쪽 (약 5mm) 관상 동맥을 명시 적으로 식별하십시오. 중간에 있는 관상동맥을 즉시 분리하고 4°C에서 PSS에 완전히 침지시킨다. 분리된 동맥을 해부학적 가위로 수직으로 절단하여 약 2mm의 동맥 고리를 획득하여 상이한 자극 하에서 혈관 장력을 기록한다(도 2E).

3. 동맥 고리의 정지 및 고정

참고: 이 단계에 대한 자세한 내용은 참조^14를 참조하십시오.

1. 2cm 스테인레스 스틸 와이어 2개( 재료 표 참조)를 준비하고 95%_O2 + 5%_CO2로 포화된 4°C PSS 용액에 미리 담그십시오. 두 와이어를 광학 해부학 현미경으로 혈관의 방향과 함께 동맥 링을 통해 평행하게 통과시키고 혈관 공동의 양쪽 끝에 노출 된 동일한 길이의 와이어를 사용하십시오.
2. 95%_O2 + 5%_CO2로 버블링 PSS로 채워진 와이어 현미경 사진의 욕조에서 강철 와이어 앞뒤의 강철 링을 고정시킨다. 수평 나사 손잡이를 적절한 앞뒤 간격으로 돌려 두 와이어가 수평이 되고 동맥 링이 자연스럽게 이완되도록 합니다.
3. 온도 조절 장치에 DMT 배쓰를 설치한 후 데이터 수집 소프트웨어( 자료 표 참조)를 열어 해당 경로 신호가 기록되었는지 확인합니다. 다음 매개변수를 설정합니다: 아이피스 보정(mm/div): 0.36; 목표 압력 (kPa): 13.3; IC1 / IC100 : 0.9; 온라인 평균 시간 : 2 초; 지연 시간: 60 초. 동맥 고리 고정의 단계는 도 3에 도시되어 있다.

4. 쥐 동맥 고리에 있는 혈관 긴장의 표준화

참고: 상이한 캐비티 샘플의 경우, 혈관이 시험관 내에서 탁월한 활동을 유지하기 위해 최적의 초기 장력이 필요했습니다. 자세한 내용은¹⁵ 참조.

1. 혈관의 직경을 따라 합리적인 장력을 가함으로써 동맥 고리의 최적의 초기 장력을 달성하십시오.
   참고: 이전 연구 16에 기초하여, 최대 작용제-유도된 장력은 1.16 내지 0.04 mN/mm의 초기 스트레치 장력으로 0.90의 인자 k 값±에서 달성되었다(상이한 용기 샘플에 대한 기준값: k 값, 0.90-0.95; 초기 장력, 1.16-1.52 mN/mm).
2. 이 시점에서 표시된 혈관 긴장 값을 0으로 설정합니다. 그 후, 욕조의 나선형 축을 회전시켜 동맥 링에 3mN 당김 자극을 적용하십시오.
3. 37°C, pH 7.40에서 산소 포화 PSS 완충액에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 와이어 현미경 사진의 장력 제어 패널 상에서 다시 장력 값을 0 mN으로 설정하였다. 동맥 고리의 초기 장력의 설정 과정은 도 4에 도시되어 있다.

5. 관상동맥 고리의 반응성 검출

1. 와이어 근그래프 기술(14)로 관상동맥 고리의 수축 활성을 수행하고, 각각¹⁰분 동안 60 mM의 K⁺ 용액으로 자극함으로써 세 개의 별개의 조작으로 검증한다.
2. 각 자극 후, 혈관 톤이 초기 상태로 돌아올 때까지 산소로 포화 된 PSS로 욕조를 씻어 내십시오.
   참고: 세 개의 병렬 측정치의 장력 변동이 10% 미만이고 각 수축의 진폭이 1mN/mm보다 큰 경우에만 자격을 갖춘 고활성 동맥 링을 추가 실험에 사용할 수 있습니다. 래트 관상동맥 고리의 활성 검증을 도 5에 나타내었다.

6. 수술 후 치료

1. 수술 후 제도적으로 승인 된 프로토콜에 따라 동물을 안락사시킵니다.
   주: 본 연구를 위해, 동물을 과량의 이소플루란을 흡입하여 안락사시켰다.

결과

해부학적으로 위치된, 심근 조직 깊숙이 분포하고 숨겨져 있는 쥐 관상동맥은 쉽게 인식되지 않았다. 인간(도 1A)과 래트(도 1B)의 관상동맥을 비교함으로써, 도 2의 샘플링 과정에 따라 래트 관상동맥의 신속하고 정확한 분리가 진행되었다. 광학 현미경으로 전방에서 우측 귀, 폐동맥 및 정점을 정밀하게 위치시킨 후, 도 2A에 도시된 흑색 선을 따라 심근을 해부하였다. 관상 동맥의 심실 간 지점의 약 5mm가 우리의 견해에 명확하게 노출되었습니다. 심실 중격 동맥을 둘러싸고 있는 끈적끈적한 심근을 미세하게 분리한 후, 혈관 정렬 방향으로 관상동맥의 2mm 루프를 횡단하기 위해 2 cm 와이어를 사용하였다. 즉시, 분리된 2mm 관상동맥 링을 도 3에 도시된 바와 같이...

토론

CAD를 앓고있는 광범위한 환자를 포함하는 관상 동맥 미세 순환의 교란은 점차적으로 인식되어 적절한 심근 관류의 기초를 염려하고 있습니다. 갑작스런 관상 동맥 심장 질환 및 심혈관 질환의 심각한 합병증을 고려할 때시기 적절한 약물 예방 및 치료는 CAD¹⁷을 가진 임상 개인에게 매우 중요합니다. 필연적으로, 관상 동맥 해부학의 비밀과 생리 구조의 복잡성은 CAD ^{18,19,20,21,22,23,24,25}에 대한 약물 및 치료의 효과에 대한 합리적이고 과학적인 평가를 심각하게 제한했습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Apigenin	Sangon Biotech Co., Ltd., 상하이, 중국	150731
CaCl2	Sangon Biotech Co., Ltd., 상하이, 중국	A501330
D-glucose	Sangon Biotech Co., Ltd., 상하이, 중국	A610219
HEPES	Xiya Reagent Co., Ltd., 산동, 중국	S3872
KCl	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A100395
KH2PO4	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A100781
LabChart Professional version 8.3	ADInstruments, 호주	—
MgCl2· 6H2O	Sangon Biotech Co., Ltd., 상하이, 중국	A100288
다중 근경 시스템	Danish Myo Technology, Aarhus, Denmark	620M
NaCl	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A100241
NaHCO3	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A100865
강선	Danish Myo Technology, Aarhus, Denmark	400447
U46619	Sigma, USA	D8174