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Summary

본 프로토콜은 래트 관상동맥의 혈관 반응성을 측정하기 위한 와이어 근그래프 기술을 기술한다.

Abstract

심혈관 시스템 질환의 주요 사건으로 관상 동맥 질환 (CAD)은 전 세계 사람들의 생명과 건강을 심각하게 위협하는 죽상 동맥 경화증, 심근 경색 및 협심증의 주요 원인으로 널리 알려져 있습니다. 그러나 고립 된 혈관의 역동적 인 생체 역학적 특성을 기록하는 방법은 오랫동안 사람들을 당황하게했습니다. 한편, 관상동맥의 정확한 위치 결정 및 분리는 체외 동적 혈관 긴장 변화를 측정하기 위해 CAD 약물 개발의 추세가 되고 있다. 본 프로토콜은 래트 관상동맥의 거시적 동정 및 현미경적 분리를 기술한다. 혈관 직경을 따라 관상동맥 고리의 수축 및 팽창 기능을 확립된 다중 근전도 시스템을 사용하여 모니터링하였다. 샘플링에서 데이터 수집에 이르기까지 관상 동맥 고리 긴장 측정의 표준화되고 프로그래밍 된 프로토콜은 실험 데이터의 반복성을 크게 향상시켜 생리적, 병리학 적 및 약물 개입 후 혈관 긴장 기록의 신뢰성을 보장합니다.

Introduction

관상동맥 질환(CAD)은 전형적이고 대표적인 심혈관 질환으로 널리 인식되고 우려되고 있으며, 선진국과 개발도상국 모두에서 사망의 주요 원인이 되고 있다 ^1,2. 정상적인 심장 생리 기능을위한 혈액 및 산소 공급 경로로서, 순환 혈액은 심근 ^3,4의 표면에 두 가지 주요 관상 동맥과 혈액 혈관 네트워크를 통해 심장에 들어가고 영양을 공급합니다. 관상 동맥의 콜레스테롤과 지방 침착은 심장의 혈액 공급과 혈관 시스템의 폭력적인 염증 반응을 차단하여 죽상 동맥 경화증, 안정 협심증, 불안정 협심증, 심근 경색 또는 갑작스런 심장 사망을 유발합니다 ^5,6. 관상동맥의 병리학적 협착에 반응하여, 보상적 가속 생리적 심장 박동은 좌심실의 출력을 증가시킴으로써 심장 자체 또는 신체의 중요한 기관의 혈액 공급을 만족시킨다⁽⁷). 장기간의 관상 동맥 협착증이 제 시간에 완화되지 않으면 심장의 특정 영역에서 광범위한 새로운 혈관이 발생할 수 있습니다⁸. 현재, CAD의 임상 치료는 종종 약물 혈전 용해 또는 외과 적 기계적 혈전 용해 및 빈번한 약물 치료와 큰 외과 적 장애가있는 외인성 생체 공학 혈관 우회를 채택^{합니다 9}. 따라서, 관상동맥 생리활성의 기능적 조사는 심혈관 질환⁽¹⁰)에 대한 여전히 시급한 돌파구이다.

생체 내 관상 동맥 압력, 혈관 긴장, 혈중 산소 포화도 및 pH 값¹¹을 동적으로 기록 할 수있는 무선 원격 측정 시스템을 제외하고는 관상 동맥 생리 활성을 검출 할 수있는 기술적 수단이 없습니다. 따라서 관상 동맥의 텍스트 기밀성과 복잡성을 고려할 때 관상 동맥의 정확한 식별 및 분리는 의심 할 여지없이 시험관 내^CAD의 여러 메커니즘을 탐구하기위한 최선의 선택입니다.

시리즈 다중 근그래프 시스템, 특히 와이어 현미경 사진 미세혈관 장력 검출기 ( 재료 표 참조)는 고정밀 및 연속 동적 기록의 특성을 갖는 작은 혈관, 림프관 및 기관지 관의 시험관내 조직 장력 변화를 기록하기 위한 매우 성숙한 시장성 장치이다(¹²). 상기 시스템은 직경이 60 μm 내지 10 mm인 공동구조체의 시험관내 조직 장력 특성을 기록하기 위해 광범위하게 이용되었다. 와이어 현미경 사진의 플랫폼의 연속 가열 특징은 불리한 외부 환경의 자극을 크게 상쇄합니다. 한편, 가스 혼합물 및 pH 값의 일정한 입력은 유사한 생리학적 상태⁽¹³)에서 보다 정확한 혈관 긴장 데이터를 얻을 수 있게 한다. 그러나 쥐 관상 동맥의 해부학 적 국소화의 복잡성을 고려할 때 (그림 1), 그 분리는 다양한 심혈관 질환 및 약물 개발에 대한 메커니즘의 탐구를 혼란스럽게하고 제한하고 있습니다. 따라서, 본 프로토콜은 래트 관상동맥의 해부학적 위치 및 분리 과정을 상세히 소개하고, 이어서 와이어 현미경 사진(¹⁴)의 플랫폼 상에서 장력 측정을 한다.

Protocol

동물 프로토콜은 청두 전통 중국 의학 대학 (기록 번호 2021-11)의 관리위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다. 수컷 Sprague Dawley (SD) 래트 (260-300 g, 8-10주령)를 본 연구에 사용하였다. 래트를 동물 챔버에 보관하고 실험 중에 자유롭게 마시고 먹을 수 있었다.

1. 용액 준비

1. 118 mM의 NaCl, 4.7 mM의 K⁺, 2.5 mM의 CaCl2, 1.2 mM의_KH2PO4,_1.2mM의 MgCl2∙_6H2O,₂₅mM의 NaHCO3, 11 mM의 D-글루코스, 및 5 mM의 HEPES를 용해시켜 생리적 염 용액 (PSS)을 제조하였다 (물질의 표 참조).
2. 58 mM의 NaCl, 60 mM의 K+, 2.5 mM의 CaCl2, 1.2 mM의 KH2PO4, 1.2 mM의MgCl2∙_6H2O,₂₅ mM의 NaHCO3, 11 mM의 D-글루코스, 및 5 mM의 HEPES를 용해시켜 하이 K⁺ 염 용액을 제조하였다.
3. 상기 두 용액을 포화시키고 기포를 95% O2 및 5%_CO2 의 혼합 가스로 포화_시킨다. 한편, 용액의 pH 값을 2 mM NaOH로 7.38과 7.42 사이에서 유지하십시오.
   참고: 솔루션 준비에 대한 자세한 내용은 참조^15를 참조하십시오.

2. 쥐 관상 동맥 해부

1. 2 % 이소플루란을 흡입하여 쥐를 마취하십시오. 발가락 꼬집음으로 깊은 마취를 확인하고 필요한 경우 추가 마취제를 투여하십시오. 그런 다음 즉시 흉강을 열어 이전에 발표된 보고서⁽¹²)에 이어 휴대용 수술대에 심장을 노출시킨다.
2. 심장을 해리시키고 제거한 후, 의료용 플라스틱 포셉으로 가볍게 짜서 모든 심장 챔버에서 잔류 혈액을 배출하십시오. 전처리된 심장을 4°C에서 95%_O2 + 5%_CO2 포화 PSS를 함유하는 페트리 디쉬에 신속하게 넣고, 7.40의 pH 값을 갖는다.
3. 관상동맥의 해부학적 위치를 정확하게 식별하려면 개략도에 따라 광현미경으로 격리된 심장의 자세를 조정하십시오(그림 2A).
   참고 : 정면보기에서 오른쪽 귀와 폐동맥은 각각 왼쪽 상단과 오른쪽 상단에 있습니다.
   1. 수술 가위와 핀셋으로 폐동맥의 뿌리에서 심실 중격을 따라 좌우 심실 충치를 자릅니다 (그림 2B).
4. 왼쪽 및 오른쪽 관상 동맥을 심근 조직에서 분리하려면 광학 해부학 현미경으로 우심실을 해부하여 오른쪽 관상 동맥 가지를 철저히 노출시킵니다. 그런 다음 심장 조직을 시계 방향으로 45° 회전시켜 좌측 관상동맥의 위치를 확인합니다(그림 2D).
5. 주변의 끈적 끈적한 심근 조직을 제거한 후, 맥박 왼쪽 (약 5mm) 및 오른쪽 (약 5mm) 관상 동맥을 명시 적으로 식별하십시오. 중간에 있는 관상동맥을 즉시 분리하고 4°C에서 PSS에 완전히 침지시킨다. 분리된 동맥을 해부학적 가위로 수직으로 절단하여 약 2mm의 동맥 고리를 획득하여 상이한 자극 하에서 혈관 장력을 기록한다(도 2E).

3. 동맥 고리의 정지 및 고정

참고: 이 단계에 대한 자세한 내용은 참조^14를 참조하십시오.

1. 2cm 스테인레스 스틸 와이어 2개( 재료 표 참조)를 준비하고 95%_O2 + 5%_CO2로 포화된 4°C PSS 용액에 미리 담그십시오. 두 와이어를 광학 해부학 현미경으로 혈관의 방향과 함께 동맥 링을 통해 평행하게 통과시키고 혈관 공동의 양쪽 끝에 노출 된 동일한 길이의 와이어를 사용하십시오.
2. 95%_O2 + 5%_CO2로 버블링 PSS로 채워진 와이어 현미경 사진의 욕조에서 강철 와이어 앞뒤의 강철 링을 고정시킨다. 수평 나사 손잡이를 적절한 앞뒤 간격으로 돌려 두 와이어가 수평이 되고 동맥 링이 자연스럽게 이완되도록 합니다.
3. 온도 조절 장치에 DMT 배쓰를 설치한 후 데이터 수집 소프트웨어( 자료 표 참조)를 열어 해당 경로 신호가 기록되었는지 확인합니다. 다음 매개변수를 설정합니다: 아이피스 보정(mm/div): 0.36; 목표 압력 (kPa): 13.3; IC1 / IC100 : 0.9; 온라인 평균 시간 : 2 초; 지연 시간: 60 초. 동맥 고리 고정의 단계는 도 3에 도시되어 있다.

4. 쥐 동맥 고리에 있는 혈관 긴장의 표준화

참고: 상이한 캐비티 샘플의 경우, 혈관이 시험관 내에서 탁월한 활동을 유지하기 위해 최적의 초기 장력이 필요했습니다. 자세한 내용은¹⁵ 참조.

1. 혈관의 직경을 따라 합리적인 장력을 가함으로써 동맥 고리의 최적의 초기 장력을 달성하십시오.
   참고: 이전 연구 16에 기초하여, 최대 작용제-유도된 장력은 1.16 내지 0.04 mN/mm의 초기 스트레치 장력으로 0.90의 인자 k 값±에서 달성되었다(상이한 용기 샘플에 대한 기준값: k 값, 0.90-0.95; 초기 장력, 1.16-1.52 mN/mm).
2. 이 시점에서 표시된 혈관 긴장 값을 0으로 설정합니다. 그 후, 욕조의 나선형 축을 회전시켜 동맥 링에 3mN 당김 자극을 적용하십시오.
3. 37°C, pH 7.40에서 산소 포화 PSS 완충액에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 와이어 현미경 사진의 장력 제어 패널 상에서 다시 장력 값을 0 mN으로 설정하였다. 동맥 고리의 초기 장력의 설정 과정은 도 4에 도시되어 있다.

5. 관상동맥 고리의 반응성 검출

1. 와이어 근그래프 기술(14)로 관상동맥 고리의 수축 활성을 수행하고, 각각¹⁰분 동안 60 mM의 K⁺ 용액으로 자극함으로써 세 개의 별개의 조작으로 검증한다.
2. 각 자극 후, 혈관 톤이 초기 상태로 돌아올 때까지 산소로 포화 된 PSS로 욕조를 씻어 내십시오.
   참고: 세 개의 병렬 측정치의 장력 변동이 10% 미만이고 각 수축의 진폭이 1mN/mm보다 큰 경우에만 자격을 갖춘 고활성 동맥 링을 추가 실험에 사용할 수 있습니다. 래트 관상동맥 고리의 활성 검증을 도 5에 나타내었다.

6. 수술 후 치료

1. 수술 후 제도적으로 승인 된 프로토콜에 따라 동물을 안락사시킵니다.
   주: 본 연구를 위해, 동물을 과량의 이소플루란을 흡입하여 안락사시켰다.

Representative Results

Discussion

CAD를 앓고있는 광범위한 환자를 포함하는 관상 동맥 미세 순환의 교란은 점차적으로 인식되어 적절한 심근 관류의 기초를 염려하고 있습니다. 갑작스런 관상 동맥 심장 질환 및 심혈관 질환의 심각한 합병증을 고려할 때시기 적절한 약물 예방 및 치료는 CAD¹⁷을 가진 임상 개인에게 매우 중요합니다. 필연적으로, 관상 동맥 해부학의 비밀과 생리 구조의 복잡성은 CAD ^{18,19,20,21,22,23,24,25}에 대한 약물 및 치료의 효과에 대한 합리적이고 과학적인 평가를 심각하게 제한했습니다. . 의심 할 여지없이, 활성 관상 동맥의 정확한 국소화 및 격리는 병리학 적 메커니즘의 탐구와 CAD 관련 질병의 예방 및 치료 조치의 평가를 촉진하기위한 전제 조건입니다. 와이어 현미경 사진의 플랫폼은 직경이 60 μm ~ 10 mm에 이르는 환형 및 공동 구조로 시험관 내 조직 장력을 끊임없이 기록하는 데 적합합니다. 관상 동맥 링은 일정한 온도 및 산소 제어와 함께 두 개의 와이어에 의해 챔버에 부착 될 수있다. 다른 약물을 첨가한 후의 혈관수축 및 이완의 데이터는 장력 센서를 통해 컴퓨터에 입력되며, 데이터는 지속적으로 수집되고 문서화된다⁽¹⁴).

이 기사는 주로 쥐 관상 동맥의 구체적인 위치와 분리 과정을 설명합니다. 그리고 랫트의 관상동맥 장력 변화의 동적 과정은 와이어 현미경 사진 시스템에 의해 측정되었다. 인간과 쥐 종의 이질성을 감안할 때, 우리는 쥐 관상 동맥을 찾고 격리 할 때 이러한 차이점을 인식해야합니다. 쥐 관상 동맥은 독립적 인 심실 중격 분지가있는 좌우 동맥으로 나뉩니다. 인간의 관상 동맥은 심장 표면에 있고 쥐 관상 동맥은 약간 더 깊습니다. 동맥 고리 장력을 측정할 때, 모든 완충된 용액은 37°C, pH = 7.40에서 95_{% O2} + 5%_CO2로 포화되고 버블링되었다. 두 개의 와이어에 의한 동맥 고리의 고정 과정을 상세히 소개하였다. 신체의 동맥은 완전한 이완 상태라기보다는 미세 수축 상태에 있습니다. 그리고 동맥의 수축 기능은 어느 정도 그들에게 가해지는 당김력과 밀접한 관련이 있습니다. 따라서, 후속 실험에서 우수한 혈관 생리 활성을 유지하기 위한 최적의 예비로딩 상태에 있도록 동맥 고리를 표준화할 필요가 있다. 높은 K+ 조건(60mM)은 세포막을 탈분극시키고 전압 게이팅된 Ca2+ 채널을 활성화시킬 수 있기 때문에, 이것은 세포외^Ca2+ 및 동맥 수축(²⁶)의 유입을 야기한다.

혈관 수축 및 팽창의 시험에서, 쥐 관상 동맥에 대한 K ⁺ 또는 U46619의 수축 효과를 조사하였다. 결과에서, K⁺ 또는 U46619는 이온 채널 또는 특정 수용체에 작용함으로써 농도 의존적인 방식으로 래트의 관상동맥을 꾸준히 수축시킬 수 있다. K⁺ 는 주로 세포막을 탈분극하고 L형^{Ca2+ 채널(27} )을 개방함으로써 혈관을 수축^시킨다. 한편 TXA2의 유사체 인 U46619는 주로 원형 뉴클레오티드 게이트 채널과 TXA2 수용체를 활성화하여 혈관을 수축시킵니다. 플라보노이드의 일종인 아피게닌은 과일, 채소 및 전통 중국 의약품(정액 플랑타기니스와 중국 스타재스민)²⁸에 널리 존재합니다. 결과는 아피제닌이 60 mM K⁺ 및 0.3 μM U46619 자극에 대해 관상동맥의 수축을 농도 의존적으로 확장시킬 수 있음을 선언했다. 실험의 끝에서, 유리한 활성을 갖는 관상동맥 고리는 60 mM K⁺를 첨가함으로써 다시 검증되었고, 원래의 자극과 유사한 혈관수축을 야기하였다. 이 연구는 주로 관상 동맥에 초점을 맞추었지만 와이어 현미경 사진 시스템은 다른 매우 작은 조직 혈관, 림프관 및 기관지에도 적용 할 수있었습니다. 결론적으로,이 기사는 주로 쥐 관상 동맥의 위치와 격리를 설명했습니다. 한편, 장력 변화는 와이어 현미경 사진 시스템 플랫폼을 사용하여 측정되어 CAD 탐사를위한 정확하고 재현 가능한 방법론을 제공했습니다.

Materials

Apigenin	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	150731
CaCl<sub>2</sub>	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A501330
D-glucose	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A610219
HEPES	Xiya Reagent Co., Ltd., Shandong, China	S3872
KCl	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A100395
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A100781
LabChart Professional version 8.3&nbsp;	ADInstruments, Australia	&mdash;
MgCl<sub>2</sub>&middot;6H<sub>2</sub>O	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A100288
Multi myograph system&nbsp;	Danish Myo Technology, Aarhus, Denmark	620M
NaCl	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A100241
NaHCO<sub>3</sub>	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A100865
Steel wires	Danish Myo Technology, Aarhus, Denmark	400447
U46619	Sigma, USA	D8174