뉴런 리소좀 근접 라벨링 단백질체학 프로토콜은 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 뉴런에서 동적 리소좀 미세 환경을 특성화하기 위해 여기에 설명되어 있습니다. 리소좀 막 단백질 및 리소좀과 (안정적으로 또는 일시적으로) 상호 작용하는 단백질은 살아있는 인간 뉴런에서 우수한 세포 내 공간 분해능으로이 방법으로 정확하게 정량화 할 수 있습니다.
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방법 논문
뉴런 리소좀 상호작용과 근접 라벨링 단백질체학의 특성 분석
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
리소좀은 분해 및 기타 다양한 세포 기능을 달성하기 위해 다양한 생체 분자와 자주 통신합니다. 리소좀은 인간의 뇌 기능에 매우 중요한데, 뉴런은 유사분열 후 세포성이고 세포 항상성을 유지하기 위해 자가포식-리소좀 경로에 크게 의존하기 때문입니다. 다양한 리소좀 기능에 대한 이해의 발전에도 불구하고 리소좀과 다른 세포 구성 요소 간의 매우 역동적인 통신을 캡처하는 것은 특히 고처리량 방식으로 기술적으로 어렵습니다. 여기서, 최근 발표된 인간 유도만능줄기세포(hiPSC) 유래 뉴런에서의 내인(knock-in) 리소좀 근접표지 단백질체에 대한 상세한 프로토콜이 제공된다.
리소좀 막 단백질과 반경 10-20nm 이내의 리소좀을 둘러싼 단백질은 살아있는 인간 뉴런에서 확실하게 식별하고 정확하게 정량화 할 수 있습니다. 프로토콜의 각 단계, 즉 hiPSC-뉴런 배양, 근접 라벨링, 뉴런 수확, 형광 현미경, 비오틴화 단백질 농축, 단백질 분해, LC-MS 분석 및 데이터 분석에 대해 자세히 설명합니다. 요약하면, 이 독특한 내인성 리소좀 근접 라벨링 단백질체학 방법은 살아있는 인간 뉴런에서 매우 역동적인 리소좀 활성을 연구하기 위한 고처리량의 강력한 분석 도구를 제공합니다.
서론
리소좀은 리소좀-자가포식 경로1을 통해 거대분자를 분해하는 이화작용 소기관입니다. 분해 외에도 리소좀은 신호 전달, 영양소 감지 및 분비 2,3,4와 같은 다양한 세포 기능에 관여합니다. 리소좀 기능의 섭동은 리소좀 저장 장애, 암, 노화 및 신경 퇴행과 관련이 있습니다 3,5,6,7. 유사분열 후 및 고도로 편광된 뉴런의 경우, 리소좀은 뉴런 세포 항상성, 신경 전달 물질 방출 및 축삭 8,9,10,11을 따른 장거리 수송에 중요한 역할을 합니다. 그러나 인간 뉴런에서 리소좀을 조사하는 것은 어려운 작업이었습니다. 유도 만능 줄기....
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프로토콜
모든 절차는 조지 워싱턴 대학교 생물 안전 및 윤리위원회의 승인을 받았습니다. 이 프로토콜에 사용된 배지 및 완충액의 조성은 표 1에 제공된다. 여기에 사용된 상업용 제품 정보는 재료 표에 나와 있습니다.
1. 인간 iPSC 유래 뉴런 배양
- 인간 iPSC 배양 및 LAMP1-APEX 프로브 통합(7일)
- Matrigel 원액을 4°C의 얼음 양동이에 밤새 해동하고, 용액 500μL를 차가운 멸균 튜브에 분취하고, 분취량을 -80°C에서 보관한다. 49.5mL의 차가운 DMEM/F12 배지에 500μL의 매트리겔 스톡을 추가하여 50mL의 코팅 용액을 준비합니다.
알림: Matrigel을 차갑게 유지하고 사전 냉각된 원추형 튜브와 피펫 팁을 사용하여 중합을 방지하십시오. 코팅 용액은 4°C에서 2주 동안 보관할 수 있습니다. - 10cm 세포 배양 접시를 37°C 인큐베이터에서 1시간 동안 코팅 용액 4mL로 코팅합니다.
참고: 비트로넥틴은 iPSC 배양을 위한 5μg/mL 농도 및 2시간 코팅에서 대체 코팅 용액이 될 수 있습니다. Vitronectin (단일 단백질 성분)은 Matrigel보다 ....
- Matrigel 원액을 4°C의 얼음 양동이에 밤새 해동하고, 용액 500μL를 차가운 멸균 튜브에 분취하고, 분취량을 -80°C에서 보관한다. 49.5mL의 차가운 DMEM/F12 배지에 500μL의 매트리겔 스톡을 추가하여 50mL의 코팅 용액을 준비합니다.
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결과
이 리소좀 근접 라벨링 단백질체학 연구는 살아있는 뉴 런에서 동적 리소좀 미세 환경을 포착하기 위해 인간 iPSC 유래 뉴런에서 수행되었습니다. 상이한 시점에서의 hiPSC 및 hiPSC-유래 뉴런의 세포 형태가 도 2A에 예시되어 있다. 인간 iPSC는 E8 배지의 콜로니에서 자랍니다. 분화는 iPSC를 독시사이클린 함유 뉴런 유도 배지로 도금함으로써 시작됩니다. 신경 돌기 확장은 3 일 분화 동안 매일 더 잘 보입니다. 뉴런 배지에서 PLO 코팅 플레이트로 전환 한 후 뉴런은 뉴런 사이에 네트워크를 형성하고 뉴런이 2 주 만에 성숙함에 따라 축삭 확장이 더 잘 보입니다. i3뉴런에서 APEX 프로브의 국소화는 빠른 APEX 활성화 후 형광 현미경으로 검증됩니다. 비오틴화 단백질은 스트렙타비딘(SA) 항체를 사용하여 염색하고, 리소좀은 항-LAMP1 항체를 사용하여 염색합니다. 병합된 이미지는 미끼 단백질에 대한 LAMP1-APEX의 올바.......
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토론
이 LAMP1-APEX 프로브를 사용하여 리소좀 막 위와 근처의 단백질이 비오틴화되고 농축됩니다. 100-1,200 nm의 일반적인 리소좀 직경을 감안할 때,이 방법은 10-20 nm 표지 반경으로 우수한 세포 내 분해능을 제공합니다. LAMP1은 풍부한 리소좀 막 단백질이자 리소좀의 고전적인 마커로, 내인성 발현 수준에서 리소좀 APEX 라벨링을 위한 우수한 미끼 단백질 역할을 합니다. 그러나, LAMP1이 후기 엔도솜 및 비분해성 리소좀(35)에도 존재하기 때문에, LAMP1을 리소좀을 표적화하기 위해 사용할 때 한계가 존재한다. 대부분의 리소좀 마커는 후기 엔도좀에서도 발현되며 결국 리소좀으로 성숙합니다. 리소좀을 표적으로 하는 대안적인 미끼 단백질은 LAMPTOR, LAMP2, 및 TMEM19235,36,37이다........
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공개 사항
저자는 경쟁하는 재정적 이익이 없다고 선언합니다.
감사의 글
이 연구는 NIH 보조금(R01NS121608)의 지원을 받습니다. AMF는 ARCS-Metro Washington Chapter 장학금과 Bourbon F. Scribner Endowment Fellowship을 인정합니다. 우리는 분자 생물학 지원과 i3뉴런 기술 개발에 대해 국립 신경 장애 및 뇌졸중 연구소 (NINDS)의 마이클 워드 연구소에 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 10%(w/v) 사포닌 용액 | Acros Organics | 419231000 | 형광 현미경 |
| Accutase | Life Technologies | A1110501 | 분리 용액, 세포 배양 |
| B27 보충제 | Fisher Scientific | 17504044 | 배양, 피질 뉴런 배지 |
| BDNF | PeproTech | 450-02 | 세포 배양, 피질 뉴런 배지 |
| 붕산 | Sigma-Aldrich | B6768 | 세포 배양, 붕산염 완충 |
| 소 혈청 알부민 | Millipore Sigma | A8806 | 총 단백질 농도를 측정하기 위한 표준 용액을 만들기 위해 |
| Brainphys neuronal medium | STEMCELL Technologies | 5790 | Cell Culture, cortical Neuron medium |
| CD45R (B220) 항체 Alexa Fluor 561 | Thermo Fisher Scientific | 505-0452-82 | 형광 현미경 |
| Chroman1 ROCK 억제제 | Tocris | 716310 | 세포 배양 |
| cOmplete mini 프로테아제 억제제 | Roche | 4693123001 | 칵테일 억제제 in Lysis Buffer |
| DC 단백질 분석 키트 II | Bio-Rad | 5000112 | 용해물의 총 단백질 농도를 측정하려면 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | 근접 라벨링 반응 |
| DMEM/F12 배지 | Thermo Fisher Scientific | 11320082 | 세포 배양, |
| HEPES를 사용한 디쉬 코팅 DMEM/F12 배지 | Thermo Fisher Scientific | 11330057 | 배양, 유도 배지 |
| 당나귀 혈청 | Sigma-Aldrich | D9663 | 형광 현미경 |
| Doxycycline hyclate, ≥ 98% (HPLC) | Sigma-Aldrich | D9891-1G | 세포 배양, 유도 매체 |
| 필수 8 매체 | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | 배양 |
| 필수 8 보충제(50x) | Thermo Fisher Scientific | A1517101 | 배양 |
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| 포름산(FA) | 용Fisher Scientific | A11750 | LC-MS 분석 |
| GDNF | PeproTech | 450-10 | 세포 배양, 피질 뉴런 매체 |
| Hoechst 염료 | Thermo Fisher Scientific | 62239 | 형광 현미경 |
| HPLC 등급 메탄올 | Fisher Scientific | A452 | 펩타이드 탈염 |
| HPLC 등급 물 | Fisher Scientific | W5 | 펩타이드 탈염 |
| 인간 유도 만능 줄기 세포 | Corriell Institute | GM25256 | 세포 배양 |
| 과산화수소, ACS, 29-32% w/w aq. soln., stab. | Thermo Fisher Scientific | AA33323AD 근접 라벨링 반응 | |
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| 라미닌 | Fisher Scientific | 23017015 | 세포 배양, 피질 뉴런 매체 |
| LC-MS 등급 Acetonitrile | Fisher Scientific | A955 | LC-MS 분석용 |
| LC-MS 등급 물 | Fisher Scientific | W64 | LC-MS 분석용 |
| L-글루타민 | Fisher Scientific | 25-030-081 | 세포 배양, 유도 매체 |
| Matrigel | Thermo Fisher Scientific | 08-774-552 | 기저막 매트릭스, 세포 배양, 접시 코팅 |
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| 아스코르브산 나트륨 | 시그마-알드리치 | A4034 | 근접 라벨링 담금질 완충액, 용해 완충액 |
| 나트륨 아지드 | 시그마-알드리치 | S8032 | 근접 라벨링 담금질 완충액, 용해 완충액, 형광 현미경 검사 |
| , 염화나트륨 | Thermo Fisher Scientific | 세포 | 배양 S271500, 붕산염 완충액 |
| , 도데실황산나트륨(SDS), | Thermo Fisher Scientific | BP1311220 | 용해 완충액, 도트 블롯 분석 완충액, 비드 세척 완충액 |
| , 수산화나트륨 | , 시그마-알드리치 | 415413 | 세포 배양, 붕산염 완충 |
| , 사붕산나트륨 | , 시그마-알드리치 | , 221732 | 세포 배양, 붕산염 완충 |
| SpeedVac 농축기 | 진공 농축기 | ||
| 스트렙타비딘, 마그네틱 세파로스 비드, | Cytiva(공식 GE) | 28-9857-99 | 비오틴화 단백질 농축, |
| 스트렙타비딘, 알렉사 플루어, 680, 접합체 | Thermo Fisher Scientific | S32358 | 비드 적정을 위한 도트 블롯 분석 수행 |
| Thermomixer | 온도 제어 믹서 | ||
| 트리플루오아세트산(TFA) | 밀리포어 시그마 | 302031 | 펩타이드 탈염용 |
| 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 염산염(TCEP) | 단백질 분해용 | 밀리포어 시그마 | C4706 |
| Tris-HCl | Thermo Fisher Scientific | BP152500 | 용해 버퍼, 도트 블롯 분석 완충액, 비드 세척 완충액 |
| Triton-X | Thermo Fisher Scientific BP151500 | 비드 세척 완충액 | |
| TROLOX | Sigma-Aldrich | 648471 | 근접 라벨링 담금질 완충액, 용해 완충액 |
| 트립신/Lys-C 혼합물, 질량 분석기 등급 | Promega | V5073 | 단백질 소화용 |
| TWEEN 20 | Millipore Sigma | P1379 | 도트 블롯 분석 버퍼 |
| Urea | Thermo Fisher Scientific | BP169500 | Beads wash and On-Beads Digestion Buffer |
| Vitronectin | STEMCELL Technologies | 7180 | Cell Culture, Dish Coating |
| Y-27632 ROCK inhibitor | Selleck | S1049 | Cell Culture |
참고문헌
- De Duve, C., Wattiaux, R. Functions of lysosomes. Annual Review of Physiology. 28 (1), 435-492 (1966).
- Ballabio, A., Bonifacino, J. S. Lysosomes as dynamic regulators of cell and organismal homeostasis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (2), 101-118 (....
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