꿀벌 조직의 조직학 기초 및 세포 사멸 검출

요약

면역 조직 화학적 방법은 꿀벌 연구에서 성인 꿀벌의 중추 및 하인두 땀샘에서 세포 사멸 및 괴사 수준을 감지하고 평가하는 데 유용합니다.

초록

꿀벌 (Apis mellifera L.) 벌집 내부 (간호사 및 기타 벌집 꿀벌)와 벌집 외부 (채집자)는 기후 및 날씨 변화, 다양한 살충제, 병원균 및 영양 실조에 노출되며 주로 입을 통해 들어가고 주로 성인 꿀벌의 소화관에 영향을 미칩니다. 꿀벌에 대한 이러한 외부 및 내부 스트레스 요인의 영향을 이해하고 예방하기 위해 유용한 연구 방법 중 하나는 면역 조직 화학적 방법입니다. 조직 학적 분석을 위해 성인 꿀벌의 중추 (심실) 및 하인두 땀샘 (HPG)을 준비하기위한 기본 프로토콜이 설명됩니다. 세포 손상 수준을 평가하고 조직 재생의 자연적인 과정으로서 괴사를 프로그램 된 세포 사멸 (세포 사멸)과 구별하기위한 상세한 방법론이 설명됩니다. 옥살산과 살충제 (살충제 및 살비제)로 성인 꿀벌을 치료하고 심실 및 HPG에서 세포 사멸을 측정 한 결과가 제시됩니다. 방법론의 장단점도 논의됩니다.

서론

꿀벌 (Apis mellifera L.)은 다른 야생 수분 매개자 중에서도 농업 식물의 가장 중요한 수분 매개자입니다. 수천 년에 걸쳐 변화하는 환경은 꿀벌이 형태, 생리학, 행동 및 여러 병원체와 기생충에 대한 내성을 적응시키는 데 영향을 미쳤습니다. 따라서 꿀벌은 전 세계적으로 매우 다양한 종과 아종을 개발했습니다¹. 이러한 결과는 꿀벌의 소화관 구조에 유전 적 변이가 있다는 이전 발견과 일치하지만 중추의 변화가 환경 요인 ^2,3에 기인 한 것임을 시사합니다.

꿀벌의 소화관에는 앞장, 중추 (심실) 및 뒷부⁴의 세 가지 주요 부분이 있습니다. 심실은 꽃가루와 꿀/꿀의 소화에 필수적인 기관입니다. 뒷다리에서 삼투압 조절은 물과 이온의 흡수를 통해 발생합니다². 꿀벌 작업자의 하인두 땀샘 (HPG)은 머리에 위치하며 로열 젤리 성분을 합성하고 분비하여 무리, 여왕 및 식민지 구성원에게 먹이를줍니다. 그들의 크기는 나이와 작업에 따라 변하고 적절한 영양 (품질 꽃가루)에 달려 있습니다. 6 일에서 ....

프로토콜

1. 꿀벌 연구를위한 기본 조직학

1. 꿀벌 조직의 해부
   알림: 일벌을 해부하려면 LED 광원이 있는 해부 현미경을 사용하십시오. 가장 유용한 배율은 ~ 20x입니다.
   1. 조작 및 해부
      1. 조심스럽게 집게로 일벌을 가져 와서 얼음 (또는 -20 ° C의 냉동실)에 2 분 동안 넣어^{고정시킵니다 22}. 페트리 접시에 꿀벌을 왼쪽에서 오른쪽으로, 오른쪽에서 왼쪽으로 두 번 흉부의 맨 위 뒤쪽 부분을 통해 대각선으로 고정합니다.
      2. 곤충 식염수를 부어 몸을 덮으십시오. 페트리 접시를 현미경 아래에 놓고 초점을 맞추고 조정합니다.
      3. 기기를 준비하십시오 ( 재료 표 참조).
   2. 중추의 해부
      1. 꿀벌 몸의 오른쪽 중앙에있는 tergite A5 (그림 1) 아래에 가위의 한 지점을 삽입하여 복부부터 시작하십시오. 테르 기트 A2로 자릅니다.
      2. 내부 장기가 손상되지 않도록 가위의 안쪽 날을 몸의 측면과 평행하게 유지하십시오. 가위를 왼쪽으로 돌려 한 번 자릅니다. 우회전하여 다시 자릅니다. 복부의 왼쪽 부분을 부드....

결과

중추의 세포 사멸 감지
류블 랴나에있는 슬로베니아 농업 연구소의 실험 양봉장에서 새로 출현 한 일벌 (Apis mellifera carnica)은 3 % 옥살산 (OA)으로 개별적으로 처리되었습니다.²³. OA는 Varroa 소멸자 제어를 위해 양봉에 자주 사용됩니다. 처리 후, 일벌 (각 그룹에서 3 명)을 얼음 위에 고정시켰다. 중추를 해부하여 10 % 포르말린으로 고정시켰다. 그런 다음 조직을 일련의 알코올 용액에서 탈수시키고 최종적으로 파라핀 왁스에 매립했습니다. 마이크로톰으로 7 μm 얇은 절편으로 절단된 후, 조직 샘플을 분석을 위해 준비하였다. 광학 현미경을 사용하여 영향을받은 세포 (3 개의 중추 샘플 각각에서 70-100 개의 세포)의 백분율을 계산했습니다. 분석 B를 사용한 결과는 OA 처리가 중추의 세포에 상당한 영향을 미친다는 것을 나타냅니다(그림 3

토론

살아있는 유기체에서, 세포 사멸은 아폽토시스 또는 괴사(²⁵)로서 정의되고, 자가포식(autophagy)²⁶을 동반할 수 있다. 세포 사멸과 괴사 세포의 차이점은 세포 사멸은 프로그램 된 세포 사멸의 한 형태이며 정상 세포에서 나타나는 반면 괴사는 치명적인 상태 (예 : 사고, 질병)로 인해 발생한다는 것입니다 ^27,28. 아폽토시스는 TUNEL 기술(아폽토시스 동안 생성된 이중 가닥 DNA 절단에서 3'-하이드록실 말단을 표지하여 DNA 단편화 검출)을 기반으로 하는 분석 키트를 사용하여 검출할 수 있습니다. 다양한 키트는 세포 결실 검출에서 여러 수준의 감도를 제공합니다.

분석 중 하나 (분석 C)는 매우 민감하고 세포 사멸 및 괴사⁽²⁹) 모두.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
2-Propanol
ApopTag Peroxidase kit (ApopTag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection)	Sigma-Aldrich	S7100	Assay B, https://www.sigmaaldrich.com/SI/en/product/mm/s7100?gclid=CjwKCA jw7vuUBhBUEiwAEdu2pPanI9SE j81ZTl-nLHEoxXAv7ViKwPA_QRx H7fciMRNcYwR7lbPQbhoCqcQQA vD_BwE; S7101에 포함된 양성 대조군은
DeadEnd Colorimetric TUNEL 시스템	Promega	G7360	분석 A, https://worldwide.promega.com/products/cell-health-assays/apoptosis-assays/deadend-colorimetric-tunel-system/?catNum=G7360
. (꿀벌 해부용)	자이스
증류수
임베딩 카세트
EnVision 시스템 알칼리 인산가수분해효소 키트	Dako
Eosin Y 솔루션	시그마-알드리치		알코올
에탄올			95%(또는 그 이하), 90%, 80%
Faramount 장착 매체, 수성	Dako		마운팅 미디
엄 플래트닝 테이블	Leica	HI1220
펜치  (꿀벌 해부용)	세밀한 과학 도구	11294-00	표준 #4
포르말린 10%			포름알데히드
헤마톡실린	Sigma-Aldrich
HistoChoice 청산제	Sigma-Aldrich		청산제
수소 과산화효소 3%
인큐베이터	BioRad
곤충 핀  (꿀벌 해부용)	Entosphinx	44594	곤충 핀 스테인레스 스틸– 흰색, 크기 2
ISCDDK, AP (현장 세포 사망 감지 키트, 알칼리성 인산 분해 효소)	Roche	11684809910	Assay C, https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/362/737/11684809910b ul.pdf
KH2< / sub>PO4< / sub>
Lab 시계
광학 현미경	Leica
현미경 슬라이드			슬라이드가 있는 상자는 먼지를 방지하기 위해 플라스틱 랩에 보관해야 합니다.
마이크로톰	라이카
모듈식 조직 임베딩 스테이션	Leica
Na2HPO4
NaCl
파라포름알데히드 4%
파라플라스트	라이카
파스퇴르 피펫			1.5 mL; 3 mL
PBS
페트리 접시  (꿀벌 해부용)			응축 실리콘으로 채워져 있습니다  (Xantoprene L 블루 및 유니버설 리퀴드 플러스 액티베이터)
Proteinase K	Merck	21627
링거 솔루션  (꿀벌 해부용)			7.5 g NaCL, 2.38 g Na2HPO4, 2.72 g KH2PO4, 1 L 증류수
가위  (꿀벌 해부용)	고급 과학 도구	1406-09, 14061-09	직선 및 곡선, 9cm
유니버설 리퀴드 플러스 활성제  (꿀벌 해부용)	쿨처
워치메이커' S 펜치 (벌 해부용)	미세 과학 도구	91100-12
수조	Leica
수채화 브러시			2x
Xantoprene L 블루  (꿀벌 해부용)	쿨처

해 부 현미경을 다룹니다