검은다리진드기의 유전자 편집을 위한 배아 주입 기술, Ixodes 견갑골

요약

본 프로토콜은 진드기 배아를 주입하는 방법을 기술한다. 배아 주입은 유전자 조작을 위해 트랜스제닉 라인을 생성하는 데 선호되는 기술입니다.

초록

진드기는 다양한 바이러스, 박테리아 및 원생동물 병원체를 전염시킬 수 있으므로 의학적 및 수의학적으로 중요한 벡터로 간주됩니다. 진드기 매개 질병의 부담이 커지고 있음에도 불구하고 진드기에 대한 연구는 진드기의 독특한 생물학에 기능 연구를 위한 유전자 변형 도구를 적용하는 데 어려움이 있기 때문에 곤충 질병 벡터에 뒤쳐져 있습니다. 모기 매개 질병을 줄이기 위해 유전 적 개입이 주목 받고 있습니다. 그러나 이러한 개입의 개발에는 배아 주입에 의한 안정적인 생식선 변형이 필요합니다. 이러한 배아 주입 기술은 진드기를 포함한 킬리 세레이트에 부족합니다. 진드기 배아의 외부 두꺼운 왁스 층, 단단한 융모막 및 높은 타원형 압력과 같은 몇 가지 요인은 이전에 진드기에서 배아 주입 프로토콜 개발을 방해했던 몇 가지 장애물입니다. 현재의 연구는 이러한 장애물을 극복했으며 검은 다리 진드기 인 Ixodes scapularis 에 대한 배아 주입 기술이 여기에 설명되어 있습니다. 이 기술은 안정적인 생식계열 변형을 위해 CRISPR/Cas9와 같은 구성 요소를 전달하는 데 사용할 수 있습니다.

서론

틱은 다양한 바이러스, 박테리아, 원생 동물 병원체 및 선충류 ^1,2를 전염시킬 수있는 의학적 및 수의학적으로 중요한 벡터입니다. 미국 동부에서 검은 다리 진드기 인 Ixodes scapularis는 라임 병 (LD) 병원체 인 스피로 헤테 보렐 리아 부르그 도르 페리의 중요한 매개체입니다. 미국에서 매년 400,000건 이상의 LD 사례가 보고^{되어 미국에서 가장} 많이 매개체 매개 전염병이 되었습니다1. B. burgdorferi 외에도 4 개의 박테리아 (Anaplasma phagocytophilum, B. mayonii, B. miyamotoi 및 Ehrlichia muris eauclarensis), 1 개의 원생 동물 기생충 (Babesia microti) 및 1 개의 바이러스 (Powassan 바이러스)를 포함하여 6 개의 다른 미생물이 견갑골에 의해 전염되어이 진드기 종을 주요 공중 보건 문제로 만듭니다³ . 최근 몇 년 동안 진드기 매개 질병이 더 널리 퍼지고 있지만 진드기에 대한 연구는 진드기의 독특한 생물학과 유전 및 기능 게놈 도구 ^4,5 적용과 관련된 문제로 인해 모기와 같은 다른 절지동물 벡터에 뒤쳐져 있습니다.

유전자 편집 기술, 특히 CRISPR / Cas9는 이제 비 모델 유기체에서 기능적 유전체학 연구를 실현 가능하게 만들었습니다. 유기체에서 유전성 돌연변이를 생성하기 위해, 배아 주입은 생식계열 ^6,7,8,9를 변경하기 위한 구축물을 전달하는 데 선호되는 방법으로 남아 있습니다. 그러나 최근까지⁴, 진드기 알은 배아^10,11을 죽이지 않고 주입하기가 너무 어렵거나 불가능한 것으로 간주되었습니다. 계란의 두꺼운 왁스 층, 단단한 융모막 및 높은 타원형 압력은 진드기에 배아 주입을 방해하는 주요 장애물 중 일부였습니다. 성인, 혈액 공급 I. 견갑골은 3-4 주 (약 100 알 / 일)에 걸쳐 최대 2,000 개의 알¹² 개로 구성된 단일 클러치를 침착시킵니다. 알은 단독으로 낳고, 각 알은 어머니의 선 Gené의 기관^13,14,15의 돌출부 또는 "뿔"에 의해 분비되는 왁스로 코팅됩니다. 이 왁스는 계란을 건조로부터 보호하고 항균 화합물¹⁵를 함유하고 있습니다. 진드기 알을 성공적으로 주입하려면 왁스 층을 제거하고 융모막을 부드럽게하고 난자를 건조시켜 타원 내 압력을 낮추어 주입이 난자를 돌이킬 수 없게 손상시키지 않도록하는 것이 중요합니다. 성공적인 생식계열 형질전환을 위한 배아 주입의 중요성을 이해하고, CRISPR/Cas9 구조를 전달하고 안정적인 생식계열 돌연변이를 생성하는 데 사용할 수 있는 I. 견갑골에 대한 프로토콜이 개발되었습니다4. I. scapularis 연구에 대한 기여 외에도이 프로토콜은 다른 진드기 종에도 최적화 될 수 있습니다.

프로토콜

Ixodes 견갑골 성인은 오클라호마 주립 대학 (OSU)에서 구입하거나 네바다 리노 대학 (UNR) (IACUC 프로토콜 # 21-001-1118)에서 자랐습니다.

1. 배아 수집을위한 암컷 진드기의 준비

알림: 적절한 연령의 알을 수집하려면 알을 낳는 것을 동기화하는 것이 중요합니다. 진드기의 알을 낳는 단서는 불분명하지만 표준 곤충 조건 (27 ° C 온도 및 >90 % 상대 습도 (RH))에서 I. 견갑골 암컷은 숙주 분리 후 약 8 일 후에 알을 낳기 시작합니다. 이 타임 라인은 4 ° C에서 가득 찬 암컷을 저장함으로써 연장 될 수 있습니다. 우리는 알을 낳는 데 부정적인 영향 없이 4°C에서 최대 8주까지 혈액을 먹인 암컷을 보관했습니다. 이러한 조건은 각 곤충에 대해 수정해야 할 수도 있습니다.

1. 모든 암컷은 미세 주사에 사용될 때까지 축축한 여과지가 늘어선 6쿼트 플라스틱 상자에 >90% RH의 4°C에서 보관하십시오.
2. 주사 일주일 전에 암컷을 4 °C에서 27 °C 인큐베이터로 옮겨 알을 낳습니다.
3. 암컷이 알을 낳기 시작하면 (27 ° C로 옮긴 후 3-4 일) 끝이 가늘고 붓을 사용하여 알을 제거하고 Gené의 장기 (왁스 샘) 절제를 위해 암컷을 준비합니다.
   참고: Gené의 기관은 scutum과 capitulum 사이의 영역(입 부분의 등쪽 기저부)에서 확장되고, 입 부분은 복부 신체 표면(표면과 평행) 위로 구부러지며, 확장된 Gene의 기관은 알을 낳자마자 알을 코팅합니다(그림 1). Gené의 장기를 제거하거나 왁스를 비우기 전에 낳은 계란은 왁스 코팅이 되어 있으며 주사에 적합하지 않으므로 폐기해야 합니다.
4. Gené의 장기를 제거하거나 비우려면 점토를 사용하여 복부와 등쪽 모두에서 입 부분이 보이도록 지향된 현미경으로 유리 슬라이드에 충혈된 암컷을 배치합니다(그림 1B, C).
   1. 이전에 발표 된 프로토콜¹⁶ 에 따라 텅스텐 와이어를 사용하여 실험실에서 만든 미세한 집게와 텅스텐 바늘을 사용하여 scutum과 입 부분 사이의 영역을 조심스럽게 찌릅니다 (바늘은 상업적으로 구입할 수도 있으며 마이크로 해부 프로브에 부착 할 수 있습니다. 재료 표 참조).
   2. 텅스텐 바늘로 내부로 작업하면서 왁스 글 랜드를 당겨 빼냅니다 (그림 1D, E). 글 랜드를 제거하는 데 몇 분이 걸릴 수 있습니다. 실험실 물티슈를 사용하여 액체 왁스 분비물을 닦아냅니다.
      알림: 글 랜드는 입 부분 바로 아래의 복부 쪽에서도 제거 할 수 있습니다. 바늘과 집게로 scutum쪽으로 뒤쪽에 도달하여. 입 부분 주위에 실리콘 접착제를 바르면 Gene의 장기 외전을 차단하고 왁스를 제거하거나 비우는 대신 사용할 수 있습니다 (프랑스 INRAE의 Ladislav Simo 박사와의 개인적인 의사 소통). 충혈 된 진드기는 양면 테이프에 머 무르지 않습니다. 점토를 사용하여 진드기를 "싸는"것은 조작하는 동안 진드기를 제자리에 유지하는 데 도움이됩니다. 집게를 사용하여 진드기와 텅스텐 바늘을 잡고 해부를 유지하십시오. 복부 부분은 바늘로 뚫기가 더 쉽고 저자가 선호합니다.
5. 글 랜드를 비우려면 1.4 단계에서 언급 한대로 중력 진드기를 배열하십시오. 등쪽의 입 부분 뒤의 영역을 조심스럽게 뚫고 집게를 사용하여 복부 쪽에 압력을가하십시오.
   알림: 또는 왁스 글 랜드를 제거 할 필요가 없습니다. 왁스 샘을 비우는 것은 며칠 동안 지속됩니다. 알을 낳는 암컷은 입 부분 주위에 흰색 영역이있어 왁스 샘의 위치를 나타내며 참조로 사용할 수 있습니다.
   1. 보푸라기가 없는 실험실 물티슈의 가장자리를 놓고 펑크 부위에서 나오는 액체 왁스를 제거합니다. 약간 황색을 띠는 점성 왁스에 비해 투명한 액체 인 혈액 림프 분비를 피하십시오. 대부분의 왁스가 제거 될 때까지 5-10 분이 걸릴 수 있습니다.
6. 조작 후 암컷을 27 ° C (>90 % RH)의 인큐베이터에 넣고 1-2 일 동안 회복시킵니다.
   알림: 치료받은 암컷은 보통 회복하고 알을 다시 낳기 시작하는 데 1-2 일이 걸립니다.
7. 암컷이 다시 알을 낳기 시작하면 가는 붓을 사용하여 갓 쌓인 알을 모으고(알을 낳은 후 0-18시간) 1.5mL 미세 원심분리기 튜브에 넣습니다.
   참고 : 시간이 지남에 따라 동일한 암컷의 알을 사용하는 경우, 땀샘이 제거되지 않은 경우 알을 낳은 지 4-5 일 후에이 절차를 반복해야합니다.

2. 미세 주사를 위한 배아 치료

1. 200-0시간 된 계란이 들어 있는 튜브에 5%(무게/부피) 벤잘코늄 클로라이드/물( 재료 표 참조)의 ~0μL(또는 계란 수에 따라 계란을 덮기에 충분한 부피)를 추가합니다. 계란이 튜브 바닥에 가라앉지 않도록 붓으로 계란을 5분 동안 부드럽게 휘젓습니다(자세한 내용은 Sharma et ^al.4 참조). 마이크로 피펫을 사용하여 상청액을 제거하고 계란을 튜브에 남겨 둡니다.
   주의 : 염화 벤잘 코늄은 피부와 눈을 부식 시키므로 장갑과 보안경을 착용하십시오.
2. 계란이 들어있는 튜브에 ~ 200μL의 증류수 (DI)를 넣고 페인트 브러시로 소용돌이 치고 마이크로 피펫을 사용하여 마이크로 원심 분리 튜브에서 물을 제거합니다. DI 물로 한 번 더 세척을 반복하십시오.
3. DI 물로 세척 한 후 5 % (w / v) 염화나트륨 (NaCl)의 ~ 200μL를 넣고 5 분 동안 붓으로 부드럽게 소용돌이 치십시오. 5분 후에 튜브에서 용액을 제거하고 DI 물로 계란을 두 번 씻습니다.
4. 계란이 들어있는 미세 원심 분리 튜브에 ~ 100 μL의 1 % (w / v) NaCl 용액을 추가합니다. 계란이 주사에 사용될 때까지 1%(w/v) NaCl 용액에 보관하십시오.
5. 약 한 시간 후에 미세 주사를 시작하십시오. 이 타임 라인은 계란의 적절한 건조를 돕고 파열을 방지합니다.
   알림: 계란은 생존에 큰 영향을 미치지 않고 1%(w/v) NaCl 용액에 7-8시간 동안 보관할 수 있습니다. 계란이 주입하기 어렵거나 파열되면 계란이 충분히 건조되지 않고 추가로 5 분 동안 5 % (w / v) NaCl로 추가로 처리 할 수 있습니다.

3. 주사 바늘의 제조

1. 알루미노실리케이트 모세관 유리(필라멘트 포함, 재료 표 참조)를 제조업체의 지침에 따라 바늘 풀러에 삽입합니다.
2. 니들 풀러를 열: 575, 당기기: 20, 속도: 50, 시간: 200 및 압력: 700 설정으로 조정합니다.
3. 바늘 풀러의 당김 기능을 활성화하고 추가 바늘에 대해 이 과정을 반복합니다.
4. 뽑은 바늘을 깨끗한 페트리 접시에 담아 모델러의 점토 선에 붙여서 보관하십시오.
5. 마이크로 로더 팁을 사용하여 주입 혼합물로 바늘을 적재하십시오 ( 재료 표 참조).
   참고: 진드기와 모기 배아 주입에 사용되는 바늘의 비교는 그림 2에 나와 있습니다.

4. 미세 주입을 위한 슬라이드 설정

1. 양면 테이프를 사용하여 두 개의 유리 현미경 슬라이드를 함께 접착하여 계란 정렬을 지원하고 주사 중에 넘어지지 않도록 약 0.5cm의 간격을 둡니다(그림 3A).
2. 슬라이드 사이의 틈새에 있는 양면 테이프에 투명 필름 드레싱( 재료 표 참조)을 바릅니다. 필름 드레싱을 간격에 완벽하게 맞추십시오.

5. 배아 미세 주사

1. 단발 붓을 사용하여 슬라이드 설정(위)에서 한 번에 8-10개의 계란을 정렬합니다.
   알림: 슬라이드 가장자리에 수직으로 긴 축(그림 3B)으로 정렬된 계란은 세로축이 가장자리에 평행하게 정렬된 계란(그림 3C)보다 주입하기 쉽습니다. 수직 방향의 계란(그림 3B)은 주사를 더 잘 견딜 수 있어 생존율이 높아집니다.
2. 계란이 정렬 된 슬라이드를 복합 현미경 스테이지에 놓습니다. 보풀이 없는 물티슈를 사용하여 보관된 1% NaCl 용액을 제거합니다.
3. 채워진 주사 바늘을 마이크로 매니퓰레이터에 연결된 마이크로 인젝터에 부착하십시오 ( 재료 표 참조).
4. 마이크로 인젝터의 고압 설정(>5,000hPa)을 사용하여 바늘을 계란 표면에 부드럽게 문질러 바늘을 엽니다.
5. 바늘을 연 후 바늘이 열리는 부분에 따라 미세 주사기의 압력(1,000-2,500hPa)을 줄입니다.
   알림: 작은 개구부는 비교적 높은 압력이 필요하고 더 큰 개구부는 더 낮은 압력이 필요합니다. 이것은 주입되는 구조물의 부피를 제어하기 위한 것이다. 바늘 개구부의 크기에 따라 주입량은 1-5 pL로 다양합니다.
6. 슬라이드의 모든 계란을 가능한 한 빨리 10°-15° 각도로 주입하고 즉시 젖은 종이가 깔린 페트리 접시에 슬라이드를 습도가 높은 조건으로 옮깁니다. 계란이 주입 되 자마자 건조되기 시작합니다.
   알림: 한 번에 적은 수의 계란을 주입하면 주입 성공률과 생존 확률이 높아집니다. 바늘은 배아 역류로 막히게됩니다. 팁이 여전히 날카 롭다면 막힌 바늘을 제거하려면 바늘을 슬라이드 가장자리에 첨가 된 1 % NaCl의 작은 물방울로 옮깁니다. 모세관 작용은 작은 막힘을 제거합니다. 바늘이 이미 둔한 경우 교체하십시오.

6. 배아의 주사 후 관리

1. 주입 된 배아가 들어있는 슬라이드를 축축한 여과지가 늘어선 큰 페트리 접시에 놓습니다.
   알림: 적어도 5-6 시간 동안 계란을 방해하지 않는 것이 중요합니다. 이렇게하면 주사 상처가 제대로 밀봉 될 수 있습니다. 교반하면 주사 상처가 열리고 세포질이 흘러 나오기 시작하여 난자가 사망 할 수 있습니다.
2. 5-6 시간 후, 주입 된 배아가 부착 된 투명 필름 드레싱에 소량의 DI 물을 첨가하십시오. 붓을 사용하여 계란을 부드럽게 옮깁니다. 계란을 작은 페트리 접시(10cm)에 옮기고 DI 물에 담그십시오.
   알림: 필름 드레싱을 사용하면 주사 후 계란을 쉽게 제거 할 수 있습니다. 필름 드레싱에 물방울이 추가되는 순간 계란이 물과 함께 움직이기 시작합니다.
3. 계란을 물에 담그고 페트리 접시를 6쿼트 플라스틱 상자에 넣고 27°C 및 >90% RH의 인큐베이터에 넣습니다.
4. 처음 며칠 동안은 매일, 그리고 애벌레가 부화하기 시작할 때까지 3-4 일마다 알을 정기적으로 확인하십시오.
   알림: 미세 주사 중에 많은 수의 알이 손상된 경우 일주일 후에 DI 물을 부드럽게 배수하면 죽은 알의 곰팡이 성장을 방지할 수 있습니다.
5. 유충이 주입 된 배아에서 부화하기 시작하면 (현재 실험실 설정을 위해 주입 후 21-25 일) 매일 확인하고 부화 한 유충을 스크린이있는 유리 병으로 옮깁니다. 유충은 수중에서 부화하여 ~ 1-2 주 동안 생존 할 수 있습니다.
6. 유충⁴ 를 선별하여 알이 눈에 보이는 표현형을 초래할 수 있는 작제물로 주입된 경우.

결과

I. 견갑골에 대한 성공적인 배아 주입 프로토콜은이 기사에서 설명합니다. 알을 낳는 암컷은 부분적으로 왁스 칠한 알의 건조를 피하기 위해 높은 습도에서 보관되었습니다. 왁스 층을 제거하여 중력 암컷의 유전자 기관(왁스 샘)을 절제하여 진드기 배아를 주입했습니다(그림 1A-E). 목이 짧은 알루미노실리케이트 유리 바늘을 사용했습니다(그림 2). 이 모양은 곤충 알 주사에 사용되는 긴 목(테이퍼진) 바늘보다 압력을 더 잘 견딜 수 있기 때문에 진드기 알 주입에 이상적이었습니다. 진드기 알의 구형은 바늘 삽입 중에 슬라이드에서 알을 굴리는 것을 방지하기 위해 무대 뒤의 슬라이드 플랫폼(그림 3A)이 필요합니다. I. 견갑골의 초기 배아 발달은 알려져 있지 않으므로 생식 세포 형성의시기...

토론

이것은 초기 진드기 배아를 성공적으로 주입하기 위해 개발 된 최초의 프로토콜입니다. ~4%-8%의 생존율이 달성되었으며, 이는 다른 잘 확립된^{곤충 모델의 배}아 주입과 비슷합니다5.

이것이 초기 프로토콜이기 때문에이 프로토콜은 개별 진드기 종에 대해 더욱 정제되고 전문화 될 것으로 예상됩니다. 특히, 주사시기는 종마다 다르며, 배아 발생, 특히 세포화시기의 경우에 따라 달라집니다. 예비 데이터에 따르면 I. 견갑골 알은 산란 후 처음 24 시간 동안 빠른 핵 분열을 거치지 않으며 며칠 후 세포화가 발생합니다 (미공개 데이터). 우리는 이미 플라스미드 전달⁴, CRISPR 매개 유전자 녹아웃⁴ 및 박테리아 전달 (Wolbachia)에 이 프로토콜을 사용했습니다(표 1). 이 배아 주입 프로토콜은 형질 전환 진드...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
알루미늄 규산 모세 혈관, 필라멘트	셔터 기구	AF100-64-10	배아 주입
벤잘 코늄 클로라이드 50% 중 물, 25g	TCI-America	B0414	배아 처리, 25g 약 25mL
여과지	Whatman	1001-090	주입 후 관리
겸자	Thomas Scientific	300-101	유전자 기관 조작
실험실 물티슈	Genesee Scientific	88-115
마이크로로더 팁	Eppendorf	930001007	당겨진 바늘 로드
Micromanipulator	셔터 기기	ROE-200	배아 주입
현미경 슬라이드 - 일반, 접지 가장자리	Genesee Scientific	29-100	배아 정렬, 접지 가장자리가 선호되며 비스듬한 가장자리는 난자를 보이지 않게 함
NaCl	Research Products International	S23020-500.0	배아 처리
바늘 풀러	셔터 기기	P-1000
영구 양면 테이프	스카치	34-8716-3417-5	배아 정렬
페트리 플레이트	Genesee Scientific	32-107G	주입 후 관리
Tegaderm/ 투명 필름 드레싱	3M 헬스케어	1628	배아 정렬
텅스텐 바늘	미세 과학 도구	10130-10	유전자의 장기 조작
텅스텐 와이어	아마존	B08DNT7ZK3	유전자의 장기 조작
XenoWorks 디지털 마이크로 인젝터	셔터 기기	MPC-200	배아 주입