Method Article

생리학적 크기의 미세유체 배양 장치에서 상피 세포 단층의 준비 및 구조 평가

DOI:

10.3791/64148

⸱

July 1st, 2022

 ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, School of Science and Engineering, Tulane University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

제시된 프로토콜은 미세유체 동적 배양 채널과 기존의 고정 웰 정적 배양 챔버에서 부착 세포층 구조를 시각화하기 위해 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경(CLSM)을 사용한 팔로이딘 기반 필라멘트-액틴 염색 기술의 개발 및 사용을 설명합니다. 이 접근법은 세포층 밀도, 단층 형성 및 층 두께 균일성을 평가하는 데 도움이 됩니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

시험관 내 미세유체 실험은 급성 호흡곤란 증후군(ARDS) 및 인공호흡기 유발 폐 손상(VILI)과 같은 상태에서 발생하는 미세생리학적 현상에 대한 많은 통찰력을 밝힐 수 있는 큰 잠재력을 가지고 있습니다. 그러나 인간 폐의 말단 세기관지와 생리학적으로 관련된 치수를 가진 미세유체 채널에 대한 연구는 현재 몇 가지 문제에 직면해 있으며, 특히 주어진 배양 환경 내에서 배지 유속을 포함한 적절한 세포 배양 조건을 설정하는 데 어려움이 있습니다. 제시된 프로토콜은 인간 폐의 말단 세기관지와 생리학적으로 관련된 치수를 갖는 산소 불투과성 미세유체 채널에서 배양된 NCI-H441 인간 폐 상피 세포의 구조를 평가하기 위한 이미지 기반 접근법을 설명합니다. 팔로이딘 기반 필라멘트-액틴 염색을 사용하여 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경으로 세포의 세포골격 구조를 밝혀 개별 세포와 층상 세포를 시각화할 수 있습니다. 후속 정량화는 사용되는 세포 배양 조건이 추가 실험에 적합한 균일한 단층을 생성하는지 여부를 결정합니다. 이 프로토콜은 미세유체 채널과 기존의 고정 웰 환경에서 세포 배양 및 층 평가 방법을 설명합니다. 여기에는 채널 구성, 세포 배양 및 필수 조건, 고정, 투과화 및 염색, 컨포칼 현미경 이미징, 이미지 처리 및 데이터 분석이 포함됩니다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

급성 호흡곤란 증후군(ARDS)은 폐 실질의 손상 및 손상의 전파로 인해 발생하는 급성 질환으로, 폐포의 폐부종, 부적절한 가스 교환 및 그에 따른 저산소혈증을 유발합니다1. 이는 전염증성 사이토카인 방출, 호중구 모집, 독성 매개체 방출 및 조직 손상의 주기를 시작하며, 그 자체로 추가적인 염증 반응을 일으킨다2. 또한, 기도를 안정시키고 반복적인 동원/폐위(R/D)로 인한 손상을 방지하는 폐 계면활성제는 ARDS 동안 발생하는 화학적 과정에 의해 비활성화되거나 기능 장애를 일으켜 주변 실질에 추가적인 스트레스와 손상을 초래할 수 있다3. 충분한 손상이 지속되면 적절한 전신 산소 공급을 보장하기 위해 기계적 환기가 필요할 수 있습니다4. 그러나 기계적 환기는 과팽창(volutrauma) 및/또는 체액 폐색 기도의 공기-액체 계면의 R/D(atelectrauma) 동안 부과된 기계적 스트레스로 인한 폐 실질 손상으로 특징지어지는 인공호흡기 유발 폐 손상(VILI)의 가능성을 포함하여 고유한 문제와 트라우마를 부과합니다.5. atelectrauma 모델에서 공기-액체 계면(유체 폐색 세기관지에서와 같이)에 노출된 상피 세포가 경험하는 압력 구배는 투과성 유래 폐쇄 반응(POOR)을 유발할 수 있으며, 이는 손상의 POOR-GET-POORer 선순환으로 이어질 수 있습니다 6,7,8.

체외 실험은 이러한 현상에 대한 미시적 통찰력을 제공할 수 있지만, 생리학적으로 관련된 차원을 가진 미세유체 채널 환경에 대한 현재 연구는 몇 가지 문제에 직면해 있습니다9. 첫째, 세포 배양 조건을 최적화하는 것은 배지 흐름 매개변수, 배양 기간 및 기타 배양 조건이 최적의 세포층 형성을 허용하는 좁은 교차점이 존재하기 때문에 미세유체 환경에서 세포 배양 연구에 상당한 진입 장벽이 됩니다. 여기에는 미세유체 배양 채널 인클로저의 산소 불투과성 특성에 의해 부과되는 확산 제한이 포함됩니다. 이를 위해서는 매체 흐름 매개변수를 신중하게 고려해야 하는데, 낮은 유속은 세포, 특히 입구에서 가장 멀리 떨어진 세포에서 산소를 박탈할 수 있기 때문입니다. 반면에 높은 유속은 세포를 배양 채널 밖으로 밀어내거나 부적절하거나 고르지 않은 층 발달을 초래할 수 있습니다. 확산 제한은 공기-액체 계면(ALI) 배양 장치에서 폴리디메틸실록산(PDMS)과 같은 산소 투과성 물질을 사용하여 해결할 수 있습니다. 그러나, 전기 세포-기질 임피던스 센싱(ECIS) 시스템의 것과 같은 많은 종래의 미세유체 배양 채널은 제조된 인클로저(10)의 특성을 고려할 때, 본질적으로 산소-불투과성이다. 이 프로토콜은 산소 불투과성 인클로저에서 배양된 세포층을 분석하는 기술을 제공하는 것을 목표로 합니다.

배양 조건의 생존 가능성을 비교할 때, 단층의 존재, 표면 토폴로지, 밀도 및 층 두께 균일성과 같은 특정 층 특성의 관찰은 특정 배양 조건 세트에 의해 생성된 세포층이 원하는 사양을 충족하는지 여부를 결정하는 데 필요하며 실제로 실험 설계와 관련이 있습니다. 제한된 평가는 유동 어레이 내의 금 전극에서 배양된 세포의 전기 절연막에 의해 부과된 고주파 교류(AC)(임피던스)에 대한 저항에 의해 생성된 전위(전압)의 측정을 활용하는 ECIS와 같은 방법으로 수행될 수 있습니다. 세포에 가해지는 AC의 주파수를 조절함으로써, 표면 부착 강도, 밀착 접합 형성, 세포 증식 또는 밀도와 같은 세포 및 세포층의 특정 주파수 의존적 세포 특성을 표적으로 삼고 검사할 수 있다11. 그러나 이러한 간접적인 형태의 측정은 실험 초기에 해석하기가 다소 어려우며 세포층의 모든 관련 측면을 정량화하지 못할 수 있습니다. 위상차 현미경으로 세포층을 관찰하는 것만으로도 밀도와 같은 특정 특성의 특성을 알 수 있습니다. 그러나, 단층의 존재 및 층-두께 균일성과 같은 많은 관련 특성들은 명시야, 위상차 또는 형광 현미경 이미징(12)으로는 불가능한 3차원(3D) 평가를 필요로 한다.

이 연구의 목적은 단층의 이미징 기반 검증과 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경(CLSM)을 사용하여 세포층 균일성을 평가할 수 있는 필라멘트-액틴 염색 기술을 개발하는 것이었습니다. 필라멘트-액틴(F-actin)은 부분적으로 F-액틴이 세포막을 밀접하게 따라가는 방식으로 인해 형광단 접합체에 대한 적절한 표적으로 간주되어 전체 세포 부피의 시각적 근사치를 허용합니다(13). F-액틴을 표적으로 하는 또 다른 중요한 이점은 F-액틴의 염색이 세포가 경험하는 스트레스와 변형에 의해 부과된 세포골격 파괴 또는 변경을 시각적으로 설명하는 방식입니다. 메탄올과 같은 탈수 고정제는 세포를 평평하게 하여 세포층을 심하게 왜곡하고 그 특성을 변경하는 경향이 있기 때문에 메탄올이 없는 포름알데히드를 사용한 가교 고정은 세포와 세포층의 형태를 보존하는 데 사용되었습니다14,15.

이러한 문제를 완화하기 위한 층 평가 기술의 능력을 결정하기 위해 세포를 기존의 8웰 배양 챔버와 미세유체 채널에서 배양하여 생산된 세포층의 차이(있는 경우)를 평가했습니다. 고정 배양 웰의 경우 8개의 웰 챔버 커버유리 장치가 사용되었습니다. 미세유체 배양을 위해, 유동 어레이(채널 길이 50 mm, 폭 5 mm, 깊이 0.6 mm)는 인간 폐의 호흡 영역에 존재하는 말단 세기관지와 생리학적으로 관련된 치수를 갖는 환경에서 불멸화된 인간 폐 상피(NCI-H441) 세포를 배양하도록 최적화되었다16. 이 프로토콜은 ECIS 플로우 어레이의 배양 환경을 염두에 두고 개발되었지만, 배양된 세포층 특성 또는 배양 조건의 평가가 필요한 모든 산소 불투과성 동적 배양 환경에 적용될 수 있습니다.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NCI-H441 인간 상피 폐 세포주를 본 연구에 사용하였다( 재료 표 참조).

1. 미세유체 채널에서의 세포 배양

  1. 미세유체 채널을 제작하고 아래 단계에 따라 전처리를 수행합니다.
    1. 단일 채널 흐름 어레이 ( 재료 표 참조)를 얻고 폴리 카보네이트베이스 플레이트에서 상부를 분리하십시오.
    2. 60mm x 22mm 크기의 #1.5 직사각형 커버글라스(두께 0.17mm)를 구합니다. 초음파 수조에서 커버 글라스의 표면을 청소하고 실온에서 5 분 동안 폴리 -D- 라이신의 0.1 mg / mL 용액으로 한면을 처리한 후 60 °C에서 30 분 동안 건조시킵니다.
    3. 0.13mm 두께의 양면 접착제( 재료 표 참조)를 플로우 어레이 상단과 플로우 채널(길이 50mm, 너비 5mm)의 치수에 맞게 레이저 절단하여 플로우 어레이 상단에 부착하고 채널 컷아웃17을 정밀하게 정렬합니다.
    4. 0.1mm 두께의 마일라 스페이서( 재료 표 참조)를 부착하고 흐름 어레이 상단과 흐름 채널의 치수에 맞게 레이저 절단하여 채널 컷아웃을 정밀하게 정렬하도록 주의하면서 접착 스트립에 부착합니다.
    5. 원하는 채널 높이에 도달할 때까지 1.1.3 및 1.1.4단계를 반복합니다(예: 채널 높이가 0.6mm인 경우 스페이서 2개와 접착 스트립 3개 사용).
    6. 직사각형 커버 유리를 Poly-D-Lysine 처리된 면이 접착제를 향하도록 하여 가장 아래쪽 접착 스트립에 부착합니다. 조립이 완료되면 그림 1과 같이 구조물의 상단과 하단에 단단하고 동일한 압력을 가하고 1분 동안 유지합니다.
      알림: 커버 유리, 접착제, 스페이서 및 플로우 어레이 상단을 포함한 채널 인클로저의 구성이 완료되었습니다.
    7. 주사기를 사용하여 탈 이온수로 채널을 헹구고 동시에 누출 여부를 확인하십시오.
    8. 자외선(UV) 멸균기에서 채널 인클로저를 30분 동안 살균합니다18.
    9. 멸균 기술을 사용하여 인산염 완충 식염수(PBS)에서 2.0μg/mL 인간 피브로넥틴( 재료 표 참조)으로 채널을 처리하고 37°C에서 최소 30분 동안 배양합니다19.
  2. 아래 단계에 따라 미세유체 채널에서 세포 배양을 수행합니다.
    1. 멸균 층류 후드에서 마이크로피펫을 사용하여 RPMI 1640 배지에서 NCI-H441 세포의 균일한 현탁액을 10% 소 태아 혈청(FBS)( 재료 표 참조)으로 옮겨 각각 표면 밀도가 150,000 cells/cm2인 두 개의 미세유체 채널을 시딩합니다.
      1. 50mm x 5mm x 0.6mm 채널의 경우 0.25mL의 2.5 x 106 cells/mL 현탁액을 사용하여 각 채널과 포트의 일부를 채웁니다. 명시야 현미경을 사용하여 세포가 채널 내에 고르게 분포되어 있는지 확인합니다.
    2. 프로그래밍 가능한 주사기 펌프(재료 표 참조)를 사용하여 5%CO2로 37°C에서 각각 24시간 및 48시간 동안 두 채널을 배양하고, 파라핀 필름으로 덮인 컷-오픈 20mL 주사기로 구성된 채널 입구에 부착된 멸균 배지 저장소에서 채널로 폐 배지 및 신선한 배지를 끌어냅니다.
      1. 세포 파종 후 10분의 대기 기간 후, 0.2μL/min에서 시작하여 4시간 동안 최대 10μL/min의 가변 유속으로 채널을 통해 저장소에서 신선한 배지를 도입 및 펌핑하고 그 후20시간 동안 해당 속도를 유지합니다.
        참고: 이 가변 유속은 세포가 (1) 배양 표면에 중력적으로 침전하고, (2) 배양 표면에 부착되고, (3) 합류성 단층을 형성할 수 있는 배양 조건을 제공합니다.
  3. 포름알데히드 용액을 사용하여 미세유체 채널 내부에서 세포 고정을 수행합니다.
    주의 : 포름알데히드는 독성이 있으므로 적절한 화학 흄 후드21에서 취급해야 합니다.
    1. 화학 흄 후드에서 PBS(메탄올 프리)에 4% 포름알데히드를 사용하여 포름알데히드 용액을 준비하고(재료 표 참조) 두 개의 4mL 부분을 만들고 첫 번째는 1% 포름알데히드 농도로, 두 번째는 Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS, Ca 2+ 및 Mg2+)를 희석제로 사용합니다. 포름알데히드 용액을 5mL 주사기로 옮기고 그에 따라 라벨을 붙입니다. 별도의 20mL 주사기에 20mL의 DPBS를 넣습니다.
    2. 배양 장치에서 미세유체 채널을 제거하고 화학 흄 후드에 넣습니다.
    3. 고정 및 염색 장치를 조립합니다.
      1. 호스 바브 어댑터에 대한 수 루어 잠금 장치를 통해 10cm 세그먼트의 이송 튜브를 3방향 스톱콕의 측면 포트에 부착한 다음( 재료 표 참조) 스톱콕을 플로우 어레이의 입구 포트에 연결합니다.
      2. 그런 다음 동일한 유형의 호스 바브 어댑터를 사용하여 이송 튜브의 또 다른 10cm 세그먼트를 플로우 어레이의 출구 포트에 부착합니다.
      3. 마지막으로 두 이송 튜브의 자유 끝을 라벨이 붙은 빈 50mL 원뿔형 원뿔형 원심분리기 튜브와 같은 화학적 및 생물학적 위험에 적합한 폐기물 용기에 고정합니다.
    4. 스톱콕을 돌려 플로우 어레이 입구 포트를 차단하고 DPBS로 폐기물 라인을 세척합니다. 그런 다음 마개를 돌려 폐기물 라인을 차단하고 DPBS 2mL로 세포를 천천히 세척합니다. 매번 새 용액을 사용하여 세척 단계를 반복하십시오. 새로운 용액 (또는 용액의 농도)이 채널에 도입됩니다.
    5. 채널을 통해 2mL의 1% 고정 용액을 천천히 밀어 넣은 다음 5분22초 동안 그대로 두십시오.
    6. 채널을 통해 2% 고정 용액 2mL를 천천히 밀어 넣은 다음 15분 동안 그대로 둡니다.
    7. 2mL의 신선한 DPBS를 3개의 개별 인스턴스(각각 5분)로 채널에 천천히 도입하여 세포를 세척합니다.
    8. 두 미세유체 채널에 대해 1.3.3-1.3.7단계를 병렬로 완료합니다.
  4. 염색, 투과화 및 미세유체 채널의 세포에 장착 매체를 추가합니다.
    1. DPBS mL당 1mg의 사포닌( 재료 표 참조)을 첨가하여 0.1% 사포닌 용액을 준비하여 4mL의 용액을 생성하고 부드럽게 와동하여23을 혼합합니다. 8mL의 DPBS를 20mL 주사기에 넣습니다.
    2. 0.1% 사포닌 용액에 F-actin-staining phalloidin 시약과 nucleus-staining Hoechst 시약( 재료 표 참조)을 사포닌 용액 mL당 각 시약 2방울(0.1mL)씩 추가합니다. 준비된 염색/투과성 용액을 알루미늄 호일로 덮어 빛으로부터 멀리 보관하십시오24.
    3. 소량의 염색/투과화 용액(1.3.4단계에 설명된 대로)으로 라인을 세척한 다음 용액 2mL를 미세유체 채널에 도입하고 채널을 알루미늄 호일로 덮은 후 실온에서 30분 동안 그대로 둡니다.
    4. 염색/투과화 용액을 플러시당 5분 동안 DPBS 2mL로 두 번 플러시합니다.
    5. 더 나은 이미지 품질을 위해 적절한 마운팅 미디어(현미경 대물렌즈 오일 및 커버 유리와 거의 일치하는 굴절률 포함, 재료 표 참조)를 채널에 추가합니다.
      1. 마이크로피펫을 사용하여, 최소량의 연질-경화 방지 마운팅제를 마이크로유체 채널의 각 포트에 도입하여, 바닥면이 완전히 덮이고 기포가 원하는 이미징 영역(25) 내에 갇히지 않도록 한다. 채널의 끝을 밀봉하고 명시야 현미경으로 관찰하여 세포층 무결성을 확인합니다.
    6. 두 미세유체 채널에 대해 병렬로 1.4.3-1.4.5단계를 완료합니다.
      참고: 최대 이미지 품질을 위해 염색 후 가능한 한 빨리 이미지 셀을 확인하십시오. 광표백이 발생하거나 장기 보관이 필요한 경우 퇴색 방지 또는 샘플 보존 특성을 가진 다른 장착 매체를 사용할 수 있습니다. 경화 마운팅 미디어는 셀의 3D 구조를 왜곡하고 더 나아가 셀층을 왜곡합니다. 이러한 이유로, 소프트 세팅 마운팅 미디어가 바람직하다26.
  5. 아래 단계에 따라 미세유체 채널의 이미지 세포.
    1. 레이저 출력, 게인, 오프셋 및 스캔 매개변수(예: 스캔 속도, 스캔 영역, 스캔 형식, 해상도 및 핀홀 직경27)를 포함한 컨포칼 현미경(재료 표 참조) 설정을 조정합니다.
    2. 원하는 이미지 매개변수와 조건이 충족될 때까지 참조 스캔과 Z-스택을 수행하여 이미징 위치를 테스트합니다. 40x 오일 이멀젼 목표에 도달하고 최적화될 때까지 순차적으로 더 높은 배율의 대물렌즈에서 다이얼인 매개변수28.
    3. 플로우 어레이 베이스 플레이트를 기준으로 하여 입구 측의 첫 번째 전극이 될 위치, 중심과 이전 위치 사이의 중간, 중심, 마지막 전극의 중심과 위치 사이의 중간(출구 측) 및 마지막 전극의 5개 위치에 Z-스택을 구성하고, 그림 2에 표시된대로.
  6. 이미지 처리 및 데이터 분석을 수행합니다.
    1. 컨포칼 현미경 소프트웨어 패키지를 사용하여 XZ 및 YZ 단면을 내보냅니다( 재료 표 참조).
    2. 가장자리 검출 기능(임계값 15.0)이 있는 이미지 처리 소프트웨어(재료 표 참조)를 사용하여 이미지 외부의 Magic Wand 도구를 사용하여 전체 이미지 면적을 픽셀 단위로 측정한 다음, 이미지 외부 부분의 Magic Wand 도구를 사용하여 셀층의 전체 단면적을 제외한 영역을 픽셀 단위로 셀층(29)에 측정합니다.
    3. 데이터 처리 소프트웨어( 재료 표 참조)를 사용하여 전체 면적 픽셀 값에서 외부 영역 픽셀 값을 빼서 단면적 픽셀 값을 찾습니다.
    4. 특정 이미지에 대해 현미경 소프트웨어에 표시된 대로 픽셀 값에 μm/픽셀 값의 제곱을 곱하여 단면적 픽셀 값을 μm/2 값으로 변환합니다(40x 오일 이멀젼 렌즈에서 줌 없이 1024p 해상도로 촬영한 Z 스택의 경우 0.31μm/ 픽셀).
    5. 데이터 및 그래프 결과의 평균과 표준 편차를 계산합니다.

figure-protocol-1
그림 1: 미세유체 채널 구성의 분해도 개략도. 상단 요소는 플로우 어레이의 상단 부분이고, 얇은 회색 요소는 접착 스트립이고, 얇은 파란색 요소는 마일라 스페이서이고, 하단 요소는 직사각형 커버 유리입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-protocol-2
그림 2: 미세유체 배양 채널의 일관되게 층 생성 영역을 따라 있는 5개의 이미징 위치. 이미징 위치는 다음과 같습니다: 입구 측, 첫 번째 전극이 손상되지 않은 유동 어레이 상에 있을 위치 근처; 입구 측 위치와 채널 중심 사이의 중간; 채널의 중심; 중앙과 출구 쪽 위치 사이의 중간, 그리고 마지막 전극이 손상되지 않은 흐름 어레이에 있을 위치 근처의 출구 쪽 위치. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

2. 8웰 챔버 커버글래스에서의 세포 배양

  1. 8웰 챔버 커버유리의 전처리를 수행합니다.
    1. #1.5 커버유리 및 셀 접착력 증가 표면 처리로 제조된 멸균 8웰 챔버 커버유리를 얻습니다(그림 3, 재료 표 참조).
    2. 멸균 기술을 사용하여 배양 웰의 표면을 PBS에서 2.0μg/mL 인간 피브로넥틴으로 처리하고 37°C에서 최소 30분 동안 배양합니다19.
  2. 아래 단계에 따라 챔버 커버 글래스에서 세포 배양을 수행하십시오.
    1. 멸균 층류 후드에서 RPMI 1640 배지에 고르게 현탁된 NCI-H441 세포 용액 0.5mL 부분을 81,000, 162,000 및 324,000 cells/mL의 부피 밀도로 10% FBS로 옮겨 각각 45,000, 90,000 및 180,000 cells/cm2의 표면 밀도로 배양 웰을 시딩합니다. 명시야 현미경을 사용하여 세포가 웰 내에 고르게 분포되어 있는지 확인합니다.
    2. 세포를 37°C에서 24시간, 48시간 및 96시간 동안 5%CO2로 배양하고, 배지를 매일 교체하였다.
  3. 8웰 챔버 커버글라스에서 포름알데히드 고정을 수행합니다.
    주의 : 포름알데히드는 독성이 있으므로 적절한 화학 흄 후드21에서 취급해야 합니다.
    1. 화학 흄 후드에서 PBS (메탄올이없는 상태)에 4 % 포름 알데히드의 두 부분을 만들고 Dulbecco의 인산염 완충 식염수 (DPBS, Ca 2+ 및 Mg2+)를 희석제로 사용하여 1 % 포름 알데히드 농도로 희석하고 다른 하나는 2 % 포름 알데히드로 희석하여 포름 알데히드 용액을 준비합니다.
    2. 인큐베이터에서 8웰 배양 챔버 커버글라스를 제거하고 화학 흄 후드에 넣습니다.
    3. 마이크로피펫을 사용하여 0.5mL의 DPBS로 세포를 부드럽게 세척하고, 각 웰의 모서리의 상부를 따라 액체를 천천히 주입한다.
    4. 마이크로피펫을 사용하여 웰 모서리에서 천천히 추출하여 각 웰의 기존 액체를 제거합니다. 액체 도입 방법(단계 2.3.3)을 사용하여 0.5mL의 1% 고정 용액을 각 웰에 넣고 5분22초 동안 그대로 두십시오.
    5. 2.3.4 단계에서 언급 한 액체 추출 방법을 사용하여 각 웰의 기존 액체를 제거하십시오. 2.3.3 단계에서 언급 된 액체 도입 방법을 사용하여 0.5mL의 2 % 고정 용액을 각 웰에 넣고 15 분 동안 그대로 두십시오.
    6. 액체 도입 및 추출 방법(단계 2.3.3 및 2.3.4)을 사용하여 각 웰에 0.5mL의 신선한 DPBS를 각각 5분 동안 3개의 개별 인스턴스에 도입하고 제거하여 세포를 세척합니다.
  4. 염색, 투과화 및 8웰 챔버 커버글라스에 매체 첨가를 수행합니다.
    1. DPBS mL당 1mg의 사포닌을 첨가하여 0.1% 사포닌 용액을 준비하고 부드럽게 vortex하여23을 혼합합니다.
    2. 0.1% 사포닌 용액에 사포닌 용액 mL당 F-액틴 염색 팔로이딘 시약과 핵 염색 Hoechst 시약을 각각 두 방울(0.1mL) 추가합니다. 준비된 용액을 알루미늄 호일(24)로 덮어 빛으로부터 멀리 두십시오.
    3. 각 웰에 0.2mL의 염색/투과화 용액을 주입하고 챔버 커버 유리를 알루미늄 호일로 덮은 후 실온에서 30분 동안 그대로 둡니다.
    4. 염색/투과화 용액을 0.5mL의 DPBS로 두 번 씻어냅니다.
    5. 더 나은 이미지 품질을 위해 적절한 장착 매체(현미경 대물렌즈 오일 및 커버 유리와 거의 일치하는 굴절률 포함)를 웰에 추가합니다.
      1. 마이크로피펫을 사용하여, 최소량의 연질-경화 안티페이드 마운타제를 각 웰에 도입하여, 바닥면이 완전히 덮이고 기포가 원하는 이미징 영역(25) 내에 갇히지 않도록 한다. 명시야 현미경으로 관찰하여 세포층 무결성을 확인합니다.
        참고: 최대 이미지 품질을 위해 염색 후 가능한 한 빨리 이미지 셀을 확인하십시오. 광표백이 발생하거나 장기 보관이 필요한 경우 퇴색 방지 또는 샘플 보존 특성을 가진 다른 장착 매체를 사용할 수 있습니다. 하드-경화 마운팅 매체는 셀의 3D 구조를 왜곡시키고, 더 나아가 셀층을 왜곡시키므로, 소프트-세팅 마운팅 매체가 바람직하다는 점에 유의하라26.
  5. 8웰 챔버 커버글라스에서 이미징을 수행합니다.
    1. 레이저 출력, 게인, 오프셋 및 스캔 매개변수(예: 스캔 속도, 스캔 영역, 스캔 형식, 해상도 및 핀홀 직경27)를 포함한 컨포칼 현미경 설정을 조정합니다.
    2. 원하는 이미지 매개변수와 조건이 충족될 때까지 참조 스캔과 Z-스택을 수행하여 이미징 위치를 테스트합니다. 40x 오일 이멀젼 목표에 도달하고 최적화될 때까지 순차적으로 더 높은 배율의 대물렌즈에서 다이얼인 매개변수28.
    3. 각 시드 밀도/배양 기간 매치업에서 세 개의 무작위 위치에 대한 Z-스택을 구성합니다.
  6. 이미지 처리 및 데이터 분석을 수행합니다.
    1. 컨포칼 현미경 소프트웨어 패키지를 사용하여 XZ 및 YZ 단면을 내보낼 수 있습니다.
    2. 가장자리 검출 기능(임계값 15.0)이 있는 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 이미지 외부의 Magic Wand 도구를 사용하여 전체 이미지 면적을 픽셀 단위로 측정한 다음 이미지 외부 부분의 Magic Wand 도구를 사용하여 셀층의 전체 단면적을 픽셀 단위로 제외한 영역을 셀층(29)으로 측정합니다 .
    3. 데이터 처리 소프트웨어를 사용하여 전체 면적 픽셀 값에서 외부 영역 픽셀 값을 빼서 단면적 픽셀 값을 찾습니다.
    4. 특정 이미지에 대해 현미경 소프트웨어에 표시된 대로 픽셀 값에 μm/픽셀 값의 제곱을 곱하여 단면적 픽셀 값을 μm2 값으로 변환합니다(40x 오일 이멀젼 렌즈에서 줌 없이 1024p 해상도로 촬영한 Z 스택의 경우 0.31μm/픽셀).
    5. 평균과 표준 편차를 계산하고 결과를 그래프로 표시합니다.

figure-protocol-3
그림 3: 초기 세포 파종 밀도와 배양 기간이 세포층 형성에 미치는 영향을 비교하는 고정 웰 배양, 염색 및 이미징 실험에 사용된 8웰 챔버 커버글라스의 다이어그램. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

제시된 방법은 미세유체 배양 채널에서 배양된 상피 세포층의 시각화를 가능하게 하고 검증을 위해 전통적인 고정 웰 세포 배양 환경에서의 시연을 사용합니다. 획득한 이미지는 품질, 신호 강도 및 세포 표적 특이성의 스펙트럼에 존재합니다. 성공적인 이미지는 높은 대비를 보여 주므로 후속 통계 평가를 위해 이미지 분석 및 데이터 정량화가 가능합니다. 실패한 이미지는 흐리거나, 흐릿하거나, 흐릿하거나, 주관적 또는 정량적 평가에 사용할 수 없습니다. 일부 이미지는 주관적인 층 특성 결정에 적합할 수 있지만 정량 분석에는 여전히 품질이 충분하지 않을 수 있습니다. 따라서 프로토콜을 따르는 정도와 주의는 통계 분석을 위한 데이터 소스 역할을 하는 주어진 이미지의 적합성에 직접적인 영향을 미칩니다.

그림 4는 미세유체 동적 배양 환경의 맥락에서 이 기술의 성공적인 사용을 나타내며 두 개의 미세유체 장치의 입구와 출구에서 이미지 획득을 보여줍...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

제시된 프로토콜은 단일 채널 미세유체 흐름 어레이의 동적 환경과 기존의 8웰 챔버 커버글라스의 정적 환경에서 NCI-H441 인간 폐 상피 세포의 배양, 가교 고정, 염색, 투과화 및 컨포칼 현미경 시각화를 설명합니다. 모든 미세유체 세포 배양 프로토콜에서 세포 배양 배지의 흐름 조건은 고속 흐름이 세포를 씻어내거나 세포 단층의 정상적인 조립을 방해할 가능성이 있기 때문에 가장 중요합니다. 한편, 저-유동은 유동 특성(30)뿐만 아니라 미세유체 채널의 불투과성 성질에 의해 부과된 확산 제한으로 인해 세포층을 "굶주리게" 또는 "질식시키는"(각각 불충분한 영양소 및 산소 이용가능성) 잠재성을 갖는다. 10분의 대기 기간(세포가 원래 채널을 채웠던 동일한 매체에 부유 상태로 유지됨)으로 시작하여 0.2μL/min의 유속으로 진행한 후 최종적으로 4시간 동안 최대 10μL/min까지 증가함으로써 이러한 경쟁 요구는 세포 부착과 생존을 모두 촉진하기 위해 균형을 이룹니다.

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 미세유체 채널 구성에 사용되는 3M 접착제 및 마일라 시트의 절단 패턴을 설계하고 세포 배양 배지 유속 및 주사기 펌프 프로그래밍을 테스트한 Alan Shepardson에게 감사를 표합니다. 자금은 NIH R01 HL0142702, NSF CBET 1706801 및 Newcomb-Tulane College Dean's Grant에서 제공했습니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
A1R HD25 컨포칼 현미경 시스템NikonA1R HD25https://www.microscope.healthcare.nikon.
com/products/confocal-microscopes/a1hd25-a1rhd25/사양
ActinGreen 488 ReadyProbes 시약(AlexaFluor 488 팔로이딘)InvitrogenR37110https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R37110
접착 전사 테이프 이중 라이너3M468MPhttps://gizmodorks.com/3m-468mp-adhesive-transfer-tape-sheet-5-pack/
에어 타이트  HSW Soft-Ject 일회용 주사기Air-Tite RL514-817-53https://www.fishersci.com/shop/products/air-tite-hsw-soft-ject-disposable-syringes-6/1481753#?keyword=syringe%20leur%20locking%205ml
BAISDY 4 mil (0.1 mm) 두께의 Mylar 시트BAISDYAS022
https://www.amazon.ca/Stencil-Perfect-Silhouette-Machines-BAISDY/dp/B07RJJ9BNC Branson Ultrasonics  M 시리즈 초음파 세척 욕조Branson 초음파15-336-100https://www.fishersci.com/shop/products/m-series-ultrasonic-cleaning-bath/15336100
Corning  피브로넥틴, HumanFisher ScientificCB-40008https://www.fishersci.com/shop/products/corning-fibronectin-human-3/CB40008?keyword=true
DPBS, 칼슘, 마그네슘Gibco14040133
https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040133?SID=srch-srp-14040133 ECIS Cultureware 일회용 전극 어레이 8 x 10 ECIS 유동 어레이응용 생물물리학1F8x10E PChttps://www.biophysics.com/cultureware.php#1F8x10E
Enterprise Technology Solutions UV 살균기 캐비닛, 흰색Enterprise Technology Solutions50-211-1163https://www.fishersci.com/shop/products/uv-sterilizer-cabinet-white/502111163
소 태아 혈청(FBS)Gibco26140079https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/26140079
Finnpipette F2 가변 용량 피펫Thermo Scientific4642090https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4642090
Fisherbrand 50mL 이지 리더 플라스틱 원심분리기 튜브Fisher Scientific06-443-21https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-higher-speed-easy-reader-plastic-centrifuge-tubes-8/p-193269
Fisherbrand  커버 안경: 직사각형 (#1.5)Fisher Scientific12-544-GPhttps://www.fishersci.com/shop/products/cover-glasses-rectangles-promo-22/12544GP#coverglass
Fisherbrand  일회용 멸균 주사기Fisher Scientific14-955-458
https://www.fishersci.com/shop/products/sterile-syringes-single-use-12/14955458 Gibco RPMI 1640 배지Gibco11875093https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11875093
Image-iT 고정용액(4% 포름알데히드, 메탄올 무함유)InvitrogenFB002https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/FB002
ImageJ FijiImageJ ImageJFijihttps://imagej.net/downloads
Immersion Oil F 30 ccNikonMXA22168https://www.microscope.healthcare.nikon.
com/products/accessories/immersion-oil/specifications
대용량 리치인 CO2  인큐베이터, 821 L, 광택 스테인리스강Thermo Scientific3950https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/3950
Laxco LMC-3000 시리즈 명시야 복합 현미경 시스템LaxcoLMC3BF1https://www.fishersci.com/shop/products/lmc-3000-series-brightfield-compound-microscope-system-8/LMC3BF1
Masterflex 피팅, 나일론, 직선, 호스 바브 어댑터에 대한 수 Luer Lock, 1/16" ID; 25/PKMasterflexZY-45505-31https://www.masterflex.com/i/masterflex-fitting-nylon-straight-male-luer-lock-to-hose-barb-adapters-1-16-id-25-pk/4550531?PubID=ZY&persist=true&ip=no&
gclid=Cj0KCQiA3rKQBhCNARIsAC
UEW_Zb5yXy1em6bGs0a9KFOk5k
pdlkHCvAEslHumdqcnlwSN0MdR0
udmwaAuDHEALw_wcB
마이크로소프트 엑셀마이크로소프트0016https://www.microsoft.com/en-us/download/details.aspx?id=56547
National Target 모든 플라스틱 일회용 주사기Thermo Scientific03-377-24https://www.fishersci.com/shop/products/national-target-all-plastic-disposable-syringes/0337724#tab8
NCI-H441 인간 상피 폐 세포미국식 배양 컬렉션(ATCC)HTB-174https://www.atcc.org/products/htb-174
NE-1600 6채널 프로그래밍 가능한 주사기 펌프New Era 펌프 시스템NE-1600https://www.syringepump.com/NE-16001800.php
NIS 요소 ARNikonNIS 요소 ARhttps://www.microscope.healthcare.nikon.
com/products/software/nis-elements/nis-elements-advanced-research
NucBlue Live ReadyProbes 시약(Hoechst 33342)InvitrogenR37605https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R37605?SID=srch-srp-R37605
Nunc Lab-Tek 챔버 커버 글라스Thermo Scientific155411
https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/155361 Parafilm M 래핑 필름Fisher ScientificS37441https://www.fishersci.com/shop/products/parafilm-m-wrapping-film-3/S37441
PendoTech 3-Way Stopcock, Polysulfone, Male/ 암 루어 입구 x 암 루어 브랜치PendoTechZY-19406-49https://www.masterflex.com/i/pendotech-3-way-stopcock-polysulfone-male-female-luer-inlet-x-female-luer-branch/1940649
인산염 완충 용액(PBS), pH 7.4Gibco10010023https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10010023
Poly-D-LysineGibcoA3890401https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A3890401#/A3890401
Reynolds 알루미늄 랩 호일Reynolds458742928317https://www.amazon.com/Reynolds-Wrap-Aluminum-Foil-Square/dp/B00UNT0Y2M
SaponinMillipore Sigma (Sigma Aldrich)47036https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/47036
SlowFade Glass Soft-set Antifade MountantInvitrogenS36917-5X2MLhttps://www.thermofisher.com/order/catalog/product/S36917-5X2ML
Thermo Scientific 1300 시리즈 클래스 II, 유형 A2 생물 안전 캐비닛 패키지Thermo Scientific13-100-752PM
https://www.fishersci.com/shop/products/1300-series-class-ii-type-a2-biological-safety-cabinet-package-promo/p-9049003#?keyword=biosafety%20hood Tygon Transfer Tubing, BioPharm 백금 경화 실리콘, 1/16" ID x 1/8" OD; 50콜-파머EW-95702-01https://www.coleparmer.com/i/tygon-transfer-tubing-biopharm-platinum-cured-silicone-1-16-id-x-1-8-od-50-ft/9570201?searchterm=95702-01
피트

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