야생형 원숭이로부터 얻은 망막 외식편을 시험관 내에서 배양하였다. 망막 변성 및 cGMP-PKG 신호전달 경로는 PDE6 억제제 zaprinast를 사용하여 유도하였다. 상이한 자프리나스트 농도에서 외식편에서의 cGMP 축적은 면역형광법을 사용하여 검증하였다.
이 논문에서
요약
초록
유전성 망막 변성(RD)은 진행성 광수용체 세포 사멸을 특징으로 합니다. 광수용체 세포에서 고리형 구아노신 일인산(cGMP) 의존성 단백질 키나아제(PKG) 경로의 과활성화는 특히 포스포디에스테라제 6b(PDE6b) 돌연변이가 있는 모델에서 광수용체 세포 사멸을 유발합니다. RD에 대한 이전 연구에서는 주로 rd1 또는 rd10 마우스와 같은 쥐 모델을 사용했습니다. 생쥐와 인간의 유전 적, 생리 학적 차이를 감안할 때, 영장류와 설치류의 망막이 어느 정도 비슷한지를 이해하는 것이 중요합니다. 원숭이는 인간과 높은 수준의 유전적 유사성을 공유합니다. 따라서 망막-망막 색소 상피(RPE)-맥락막 복합체를 포함하는 망막 외식편의 시험관 내 배양을 위해 야생형 원숭이(1-3세)를 선택했습니다. 이들 외식편을 상이한 농도의 PDE6 억제제 자프리나스트로 처리하여 cGMP-PKG 신호전달 경로를 유도하고 RD 병인을 시뮬레이션하였다. 영장류 망막 외식편에서의 cGMP 축적 및 세포 사멸은 후속적으로 면역형광 및 TUNEL 분석을 사용하여 검증하였다. 이 연구에서 확립된 영장류 망막 모델은 cGMP-PKG 의존성 RD의 메커니즘에 대한 적절하고 효과적인 연구와 향후 치료 접근법 개발에 도움이 될 수 있습니다.
서론
유전성 망막 변성(RD)은 진행성 광수용체 세포 사멸을 특징으로 하며 다양한 병원성 유전자의 돌연변이에 의해 유발된다1. RD의 최종 결과는 시력 상실이며 대부분의 경우 질병은 오늘날까지 치료할 수 없습니다. 따라서, 인간의 질병 상태를 충실하게 나타내는 모델을 사용하여 광수용체 사멸로 이어지는 세포 메커니즘을 연구하는 것이 중요합니다. 여기서 영장류 기반 모델은 인간과의 친밀감 때문에 특히 중요합니다. 특히, 이러한 모델은 광수용체 세포 사멸을 중단시키거나 지연시킬 수 있는 적절한 치료 개입의 개발을 진전시킬 수 있습니다.
RD의 세포 사멸 메커니즘에 대한 이전 연구에서는 RD 유발 유전자 돌연변이로 인한 포스포디에스테라제 6(PDE6) 활성의 감소 또는 손실이 고리형 구아노신 일인산(cGMP)의 가수분해를 감소시킨다는 것을 입증했습니다.2,3. cGMP는 막대 바깥쪽 세그먼트(ROS)에 있는 고리형 뉴클레오티드 개폐 이온 채널(CNGCs)의 특이적 작용제이며, 척추동물 광수용체 세포에서 광 신호를 전기 신호로 변환하는 역할을 하는 핵심 분자이기도 하다
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프로토콜
동물 연구는 중국과학원 동물학 연구소 윤리 검토 위원회(IACUC-PE-2022-06-002)와 윈난대학교 동물 윤리 검토 및 동물 프로토콜(YNU20220149)의 검토 및 승인을 받았습니다.
1. 망막 체외이식편의 제조
- 1세에서 3세 사이의 야생형 원숭이에서 영장류 안구를 채취하여 조직 저장 용액에 보관하고 원숭이를 희생시킨 후 또는 자연사 후 적출 후 3시간 이내에 얼음 위에서 운반합니다.
- 프로테이나제 K 용액의 제조를 위해, 25 μL의 증류수에 25 μL의 프로테이나제 K를 용해시킨 후, 225 μL의 용액을 18.5 mL의 기초 배지 (R16)에 첨가한다.
- 5% 포비돈 요오드(포비돈 요오드: 물 = 1:19) 10mL에 안구를 30초 동안 씻고 5% 페니실린/스트렙토마이신(PEN/STREP):p호스페이트 완충 식염수 = 1:19에 1분 동안 담가 박테리아 오염을 방지합니다. 그런 다음 10mL의 R16 배지에서 5분 동안 안구를 배양합니다.
- 프로테이나제 K 용액을 37°C 인큐베이터에서 예열한다. 그런 다음 안구를 10mL의 프로테이나제 K 용액에 담그고 2분 동안 배양합니다. 안구를 R16 + 소 태아 혈청(1:1) 용액 10mL....
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결과
이 연구에서는 망막-RPE-맥락막 복합체를 포함하는 외식편을 사용하여 원숭이 원숭이 망막 외식편 배양을 수행했습니다(그림 1, 보충 그림 S1). 부착된 RPE 및 맥락막이 없는 망막을 사용하는 망막 세포의 시험관 내 배양과 비교할 때, 당사의 체외이식편 배양은 더 나은 세포 생존을 촉진하고 따라서 광수용체 세포의 생존을 연장합니다.
우리는 PDE6 억제제 zaprinast(100 μM, 200 μM 및 400 μM; 보충 그림 S2) 광수용체에서 cGMP의 축적 및 시험관 내에서 PKG의 후속 활성화를 유도합니다. 각 농도 처리는 각각 4일 동안 주어졌다. 시험 관내 망막 모델을 400 μM 자프리나스트로로 처리한 결과, 가장 많은 수의 TUNEL 양성 세포, 상당한 cGMP 신호 및 내부 망막의 RPE 및 신경 세포.......
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토론
시각적 광변환은 눈의 망막 내에 있는 광수용체 세포에 의해 광 신호가 전기 신호로 변환되는 생물학적 과정을 말합니다. 광수용체 세포는 광변환이 가능한 편광 뉴런이며, 외부 세그먼트의 모양을 따서 간상체와 원뿔이라고 하는 두 가지 유형의 광수용체가 있습니다. 막대는 scotopic 시력을 담당하고 원뿔은 사진 및 고시력 시력을 담당합니다. 유전성 RD는 진행성 망막 광수용체 세포 사멸을 특징으로 하는 신경퇴행성 질환과 관련이 있다15.
RD에 대한 현재 연구는 주로 쥐 RD 모델에서 유래한 시험관 내 망막 체외이식편 배양을 포함하여 RD의 마우스 모델을 기반으로 하고 있다16. 그러나 생쥐와 인간 사이에는 특히 망막 구조에서 상당한 유전적, 생리학적 차이가 존재합니다. 대조적으로, NHP는 인간과 높은 수준의 유사성을 공유하므로 NHP 모델은 RD 병인 및 치료 개발 조사에 가장 .......
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공개 사항
모든 저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
감사의 글
이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (No. 81960180), Zinke 유산 재단, Charlotte and Tistou Kerstan Foundation, Yunnan Eye Disease Clinical Medical Center (ZX2019-02-01)의 보조금으로 지원되었습니다. 이 연구에 사용된 원숭이 안구를 공유해 주신 Longbao Lv 교수(중국 쿤밍 중국과학원 동물학 연구소)에게 감사드립니다.
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재료
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| 완전한 매체 DL- 토코페롤 | 시그마 | T1539 | 보충제 완전한 매체 |
| 당나귀 안티 양, Alxea Fluor 488 | Life technologies corporation | A11015 | cGMP |
| 의 2 차 항체에탄올-아세트산 용액 | Shyuanye | R20492 | 고정 액체 |
| 태아 소 혈청 | Gemini | 900-108 | 차단 용액 |
| 형광 현미경 | Carl Zeiss | Axio Imager.M2 | 면역 형광 이미징 |
| 글루타민 | 시그마 | G8540 | 완전한 매체 |
| 글루타티온 | 시그마 | G6013 | 의 보충제완전한 매체 |
| 현장 세포 사멸 검출 키트, TMR 레드 | Roche | 12156792910 | TUNEL 분석 |
| 인슐린 | 시그마 | 16634 | 보충제 완전한 매체 |
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참고문헌
- O'Neal, T. B., Luther, E. E. StatPearls. , StatPearls Publishing. Copyright 2022, StatPearls Publishing LLC (2022).
- Power, M., et al. Cellular mechanisms of hereditary photoreceptor degeneration - Focus on cGMP. Progress in Retinal and Eye Research. 74, 100772(2020).
- Paquet-Durand, F.,....
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