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방법 논문

In ovo 전기천공에 의한 청각회로에서 깨지기 쉬운 X 정신지체 단백질의 세포 자율 기능 해부

2K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/64187

⸱

2022년 7월 6일

 ,  ,  , 
1Division of Histology & Embryology, Key Laboratory for Regenerative Medicine of the Ministry of Education, College of Medicine, Jinan University, 2Department of Clinical Pathology, First Affiliated Hospital of Jinan University, 3Program in Neuroscience, Department of Biomedical Sciences, College of Medicine, Florida State University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

난자 전기천공을 사용하여 닭 배아의 청각 내이와 달팽이관 핵을 선택적으로 형질감염시켜 회로 조립의 개별 기간 동안 깨지기 쉬운 X 정신 지체 단백질의 세포 그룹 특이적 녹다운을 달성하는 방법을 고안했습니다.

초록

깨지기 쉬운 X 정신 지체 단백질 (FMRP)은 국소 단백질 번역을 조절하는 mRNA 결합 단백질입니다. FMRP 손실 또는 기능 장애는 지적 장애, 감각 이상 및 사회적 의사 소통 문제를 특징으로 하는 취약 X 증후군(FXS)에서 비정상적인 신경 및 시냅스 활동을 유발합니다. FMRP 기능 및 FXS 발병 기전에 대한 연구는 주로 형질 전환 동물에서 Fmr1 (FMRP를 코딩하는 유전자) 녹아웃으로 수행되었습니다. 여기에서 우리는 닭 배아를 사용하여 회로 조립 및 시냅스 형성 기간 동안 FMRP의 세포 자율 기능을 결정하는 생체 내 방법을 보고합니다. 이 방법은 Fmr1 소형 헤어핀 RNA(shRNA) 및 EGFP 리포터를 포함하는 약물 유도성 벡터 시스템의 단계, 부위 및 방향 특이적 전기천공을 사용합니다. 이 방법을 통해 우리는 청각 신경절 (AG)과 뇌간 표적 중 하나 인 핵 목장 세포 (NM)에서 선택적 FMRP 녹다운을 달성하여 AG-NM 회로 내에서 구성 요소 별 조작을 제공했습니다. 또한 형질주입의 모자이크 패턴은 동물 내 대조군과 이웃 뉴런/섬유 비교를 가능하게 하여 데이터 분석의 신뢰성과 민감도를 향상시킵니다. 유도성 벡터 시스템은 축적된 발달 효과를 최소화하기 위해 유전자 편집 발병의 시간적 제어를 제공합니다. 이러한 전략의 조합은 시냅스 및 회로 개발에서 FMRP의 세포 자율 기능을 해부하는 혁신적인 도구를 제공합니다.

서론

취약 X 증후군(FXS)은 지적 장애, 감각 이상 및 자폐 행동을 특징으로 하는 신경 발달 장애입니다. 대부분의 경우 FXS는 초기 배아 단계1에서 시작하여 취약한 X 정신 지체 단백질 (FMRP, Fmr1 유전자에 의해 암호화 됨)의 전반적인 손실로 인해 발생합니다. FMRP는 일반적으로 뇌의 대부분의 뉴런과 신경교 세포와 감각 기관 2,3,4에서 발현되는 RNA 결합 단백질입니다. 포유류의 뇌에서 FMRP는 다양한 신경 활동에 중요한 단백질을 암호화하는 수백 개의 mRNA와 관련이있을 수 있습니다5. 기존의 Fmr1 녹아웃 동물에 대한 연구는 FMRP 발현이 시냅스 신경 전달의 조립 및 가소성에 특히 중요하다는 것을 보여주었습니다6. 여러 조건부 및 모자이크 녹아웃 모델은 축삭 투영, 수지상 패턴 및 시냅스 가소성을 포함한 여러 발달 이벤트 동안 FMRP 작용 및 신호가 뇌 영역, 세포 유형 및 시냅스 부위에 따라 다양하다는 것을 추가로 입증했습니다. 7,8,9,10,11,12,13,14 . 시냅스 전달을 조절하는 FMRP의 급성 기능은 뇌 슬라이스 또는 배양 된 뉴런에서 억제 성 FMRP 항체 또는 FMRP 자체의 세포 내 전달에 의해 연구되었다 15,16,17,18. 그러나 이러한 방법은 개발 중 FMRP 오발현으로 인한 결과를 추적하는 기능을 제공하지 않습니다. 따라서, FMRP의 세포 자율 기능을 조사하기 위한 생체내 방법의 개발이 절실히 필요하며, FXS 환자에서 보고된 이상이 관련 뉴런 및 회로에서의 FMRP 손실의 직접적인 결과인지, 또는 발달 중 네트워크 전반의 변화로부터 유도된 이차적 결과인지를 결정하는 데 도움이 될 것으로 기대된다(19).

닭 배아의 청각 뇌간은 회로 및 시냅스 발달에서 FMRP 조절에 대한 심층 기능 분석에 매우 유리한 모델을 제공합니다. 배아 닭의 뇌에 쉽게 접근 할 수 있고 유전자 조작을위한 난자 전기 천공 기술에 잘 정립 된 기술은 초기 배아 단계의 뇌 발달에 대한 우리의 이해에 크게 기여했습니다. 최근에 발표 된 연구에서이 기술은 FMRP 오발현20,21의 시간적 제어를 허용하는 고급 분자 도구와 결합되었습니다. 여기서, 방법론은 시냅스 전 뉴런과 시냅스 후 뉴런의 선택적 조작을 개별적으로 유도하기 위해 발전됩니다. 이 방법은 청각 뇌간 회로에서 개발되었습니다. 음향 신호는 청각 내이의 유모 세포에 의해 감지 된 다음 청각 신경절 (AG, 포유류에서는 나선형 신경절이라고도 함)으로 전달됩니다. AG의 양극성 뉴런은 말초 과정으로 유모 세포를 자극하고 차례로 중앙 투영 (청각 신경)을 뇌간으로 보내 두 개의 주요 달팽이관 핵 인 마그노 셀룰라 핵 (NM)과 각진 핵 (NA)에서 끝납니다. NM의 뉴런은 구조적으로나 기능적으로 포유류 전방 복부 달팽이관 핵의 구형 덤불 세포와 비슷합니다. NM 내에서 청각 신경 섬유(ANF) 시냅스는 헬드 말단22의 큰 말단을 통해 NM 뉴런의 체세포에 있습니다. 발달 동안, NM 뉴런은 후뇌23의 능형 5 및 6 (r5/6)에서 발생하는 반면, AG 뉴런은 이낭24에 존재하는 신경 모세포로부터 유래된다. 여기에서는 시냅스 전 AG 뉴런과 시냅스 후 NM 뉴런에서 FMRP 발현을 선택적으로 녹다운하는 절차를 별도로 설명합니다.

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프로토콜

계란과 닭 배아는 지난 대학 동물 관리 및 사용위원회에서 승인 한 동물 프로토콜에 따라주의와 존중으로 처리되었습니다.

1. 계란 및 플라스미드 제제

  1. 계란 준비
    1. 화남농업대학교에서 신선한 닭고기 수정란(갈루스 갈루스)을 구해 배양 전 16°C에서 보관한다. 최적의 생존력을 위해 도착 후 일주일 이내에 배양을 위해 모든 알을 설정하십시오.
    2. 알을 수평으로 놓고 햄버거와 해밀턴(HH) 단계 12신경 관 형질감염이 될 때까지 46-48시간 동안 또는 이낭 형질감염에 대해 HH13까지 54-56시간 동안 38°C에서 배양합니다. 난자의 동물 극은 식물 기둥보다 가볍기 때문에 수평 배치는 쉽게 조작할 수 있도록 배아를 난자 상단에 배치합니다. 이 단계와 다음 모든 단계에서 계란을 수평으로 유지하도록주의하십시오.
    3. 배아의 위치는 손전등을 사용하여 난자 바닥에서 빛을 비출 때 달걀 껍질의 어두운 영역으로 나타납니다. 원하는 HH 단계에서이 손전등 방법을 사용하여 달걀 껍질에 배아의 위치를 연필로 표시하십시오.
    4. 75 % 에탄올이 함유 된 거즈로 계란을 닦으십시오. 가위 끝으로 계란의 뾰족한 끝에 구멍을 뚫고 18G 바늘 주사기로 알부민 2mL를 제거합니다. 구멍이 바늘 삽입이 가능할 만큼만 큰지 확인하십시오. 새는 알부민을 거즈로 닦아내고 투명 테이프로 구멍을 막으십시오.
    5. 균열을 최소화하고 창 작업 중에 떨어지는 껍질 파편을 방지하려면 연필로 표시된 어두운 부분을 중심으로 투명 테이프로 계란 상단을 덮으십시오.
  2. 플라스미드 DNA 추출
    1. 앞서 설명한 바와 같이 트랜스포존계 Tet-on 시스템을 사용하여 닭 Fmr1 shRNA를 클론화한다(20). 이 시스템은 pCAGGS-T2TP, pT2K-CAGGS-rtTA-M2 및 pT2K-BI-TRE-EGFP-Fmr1 shRNA의 세 가지 플라스미드를 포함하며, 형질감염 후 Fmr1 shRNA 및 EGFP의 발현이 침묵되고 독시사이클린(Dox) 유도에 의해 켜질 수 있는 약물 유도성 벡터 시스템을 제공합니다.
      참고: 이러한 플라스미드는 현재 저장소에서 사용할 수 없습니다. 저자는 합리적인 요청에 따라 플라스미드를 제공하는 데 동의합니다.
    2. 제조업체의 지침에 따라 내독소가 없는 준비 키트를 사용하여 플라스미드 DNA를 추출하고 1/15 부피의 7.5M 아세트산나트륨과 1부피의 100% 이소프로판올을 추가하여 침전시킵니다.
    3. 플라스미드를 -20°C에서 밤새 침전시키고 13,000 x g 에서 10분 동안 원심분리합니다. 키트에 제공된 Tris-EDTA 버퍼로 펠릿을 최종 농도 4-5μg/μL로 용해합니다. 플라스미드는 형질주입 효율 감소 없이 -20°C에서 12개월 동안 보관할 수 있습니다.
    4. 전기천공 당일, 피펫 팁을 사용하여 멸균 원심분리 튜브에 각 플라스미드 2μL를 완전히 혼합합니다. 생성 된 6 μL 부피의 플라스미드 혼합물은 3 개의 알을 전기 천공하기에 충분합니다. 전기천공 중에 플라스미드를 시각화하는 데 도움이 되도록 DNA 혼합물26의 6μL마다 0.1% 고속 녹색(멸균 ddH2O에서 준비)의 1μL를 추가하여 플라스미드 혼합물을 파란색으로 바꿉니다.

2. 오보 전기 천공에서

  1. 계란 창 및 배아 식별
    1. 전기 천공 당일에 인큐베이터에서 알을 한 번에 12 개의 알을 제거하십시오. 알을 인큐베이터에서 1시간 이상 방치하면 발달 변화가 발생하고 생존력이 감소합니다.
    2. 75 % 에탄올이 함유 된 거즈로 모든 수술 도구를 닦으십시오.
    3. 각 계란을 맞춤형 폼 홀더에 넣으십시오. 테이프로 덮인 부분을 75 % 에탄올로 닦고 작은 가위를 사용하여 연필 자국 둘레의 창 (1-2cm2)을 자릅니다 (그림 1A). 절단 할 때 아래의 배아가 손상되지 않도록 가위를 평평하게 잡으십시오.
    4. 창문이 있는 난자를 10배 접안렌즈와 2배 줌이 있는 실체 현미경 아래에 놓고 배아를 식별합니다. 더 나은 시각화를 위해 광원의 각도와 밝기를 조정합니다.
      참고: 이 단계에서 배아를 시각화하고 신경관을 식별하려면 연습과 경험이 필요합니다.
      1. 초보자의 경우 배아 식별을 용이하게 하기 위해 다음 선택적 잉크 주입을 사용하십시오. 0.01M 인산염 완충 식염수(PBS)와 오토클레이브에 10% 인도 잉크 용액을 미리 준비합니다. 1mL 주사기에 잉크 용액을 채운 다음 27G 바늘을 맞춥니다. 집게로 바늘을 45° 각도로 구부립니다.
      2. 현미경으로 오파카 영역의 가장자리에서 조심스럽게 찌르고 배아 아래에 바늘을 삽입하십시오. ~50μL의 잉크를 주입하면 배아 시각화를 위해 펠루시다 영역 아래로 확산됩니다. 잉크는 배아의 명확한 시각화를 위해 어두운 배경을 형성합니다.
        알림: 삽입 및 주입하기 전에 주사기에서 공기를 배출하십시오. 시각화에 능숙한 경우 잉크 주입 단계는 생존율을 감소시키므로 피하십시오.
  2. 신경관 주입 및 전기 천공
    참고: 이 절차는 뇌간의 NM 뉴런을 형질주입하기 위해 HH12에서 수행됩니다.
    1. 피펫 풀러를 사용하여 유리 모세관(직경 ~1mm, 길이 100mm)을 피펫으로 당깁니다. 해부 현미경으로 모세관 바늘의 끝을 집게로 직경 10-20 μm로 조심스럽게 엽니 다. 사용할 때까지 피펫 (보통 한 번에 5-10 개)을 보관 상자에 보관하십시오.
    2. 피펫 끝에 있는 고무 튜브를 통해 음압을 가하여 0.5-1μL의 플라스미드 혼합물로 모세관 피펫을 채웁니다. 이것은 주사기 또는 공기 펌프로 달성 할 수 있습니다.
    3. 배아가 꼬리를 가까이에 두고 수직으로 향하도록 (또는 3축 조작기를 사용하여 모세관 피펫을 주입하기 위해 수평으로) 계란을 현미경 아래에 놓습니다. 한 손 또는 3축 매니퓰레이터로 모세관 피펫을 잡고 피펫 끝을 꼬리에서 머리 방향으로 r5/6으로 움직입니다.
      참고: 가장 앞쪽 뒷뇌 영역은 r1이고 신경관을 따라 각각의 후속 돌출부는 개별 마름모꼴입니다. R5/6은 쉽게 알아볼 수 있는 컵과 같은 구조인 이낭과 동일한 전후 수준에 있습니다(그림 1B-C).
    4. 팁을 유리막 막을 통해 등쪽 신경관으로 부드럽게 찌른 다음 피펫을 약간 빼서 팁이 신경관의 내강에 오도록 합니다. 착색된 플라스미드가 r5/6으로 완전히 확산되고 r3 및 r4로 확장될 때까지 공기 압력을 가하여 플라스미드 혼합물을 주입합니다.
      알림: 주입을 위해 vitelline 멤브레인에 슬롯을 만들 필요는 없습니다.
    5. 파란색 플라스미드 용액이 누출 없이 신경관 아래로 빠르게 확산될 때 성공적인 주입이 이루어지는지 확인합니다(그림 1B-C). 누출이 발생하면 파란색이 빠르게 사라집니다.
    6. 주입 직후 백금 양극성 전극을 신경관의 양쪽에 놓습니다(그림 1D). 전기 천공기로 12V 및 50ms 지속 시간의 두 가지 펄스를 제공합니다. 양극성 전극의 끝에서 기포를 관찰하고 음극에 더 많은 것을 관찰하십시오.
    7. 착색 된 플라스미드 혼합물이 전극의 양극 근처의 신경관 조직으로 들어갈 때 달성되는 성공적인 전기 천공을 확인하십시오. 전기 천공 후 바이폴라 전극을 조심스럽게 제거하십시오.
    8. 달걀 껍질의 창을 사각형으로 2 개로 미리 자르고 75 % 에탄올로 뿌린 투명 필름 조각으로 덮으십시오. 계란을 인큐베이터에 다시 넣으십시오.
    9. 다음 계란으로 진행하기 전에 식염수에서 12V 및 50ms 지속 시간의 10-20펄스를 전달하여 양극성 전극을 청소하십시오.
  3. 이주머니 주사 및 전기천공
    알림: 이 절차는 내이의 유모 세포와 AG 뉴런을 형질주입하기 위해 HH13에서 수행됩니다.
    1. HH13(~배아 2.5일)에 배아가 회전하여 머리의 오른쪽이 위를 향하게 합니다. 현미경으로 배아가 수직이되고 꼬리가 가까이에 있도록 알을 놓습니다. 모세관 피펫을 잡고 오른쪽 이낭을 등쪽 방향으로 부드럽게 찔러줍니다(그림 2A).
      알림: 이 단계에서 이낭은 r5/6과 동일한 전후 수준에서 신체 상단에 작은 원형 구조로 나타납니다.
    2. 이주머니가 청색 용액27로 채워질 때까지 플라스미드 혼합물을 공기 압력으로 주입한다. 파란색 플라스미드 혼합물이 이낭 내에 갇혀 누출되지 않을 때 달성되는 성공적인 주사를 확인하십시오.
    3. 주사 직후, 도 2B에 묘사된 바와 같이 이주머니에 양극성 전극을 놓는다. 양측과 음측을 각각 이염의 앞쪽과 뒤쪽에 위치시킵니다. 전기천공기로 12V 및 50ms 지속 시간의 두 가지 펄스를 제공합니다.
    4. 파란색 플라스미드 혼합물이 전극의 양극 근처의 이낭 조직에 들어갈 때 달성되는 성공적인 전기 천공을 확인하십시오. 전기 천공 후 바이폴라 전극을 조심스럽게 제거하십시오. 달걀 껍질의 창을 투명 필름으로 덮고 달걀을 인큐베이터로 되돌립니다.

3. 플라스미드 전사를 개시하고 유지하기 위한 Dox 투여

  1. Dox 용액의 제조
    1. 화학 후드 아래에서 Dox 분말 100mg을 측정하고 멸균 PBS 100mL에 용해시켜 1mg/mL의 작업 용액을 만듭니다. 0.22μm 필터로 용액을 여과하고 -20°C에서 1mL 분취량을 보관합니다. 빛으로부터 보호하십시오20,28.
  2. 독스 관리
    1. 완전한 강도의 유전자 편집을 위해, 원하는 나이 24시간 전에 얼음에서 Dox 분취액을 해동합니다. 투명 필름을 관통하는 주사기를 사용하여 50μL의 Dox를 계란의 융모막 막에 직접 떨어 뜨립니다. 주입 후 투명 필름이나 테이프로 바늘 구멍을 밀봉하십시오.
    2. 녹다운 효과를 유지하려면 원하는 발달 단계에서 조직이 수확될 때까지 격일로 Dox를 투여하십시오.

4. 조직 해부 및 절편

  1. 뇌간
    1. 배아 단계 3 (E3) 및 E6의 배아의 경우 달걀 껍질을 열고 가위로 관련 막을 자릅니다. 배아를 숟가락으로 떠서 0.1M 인산염 완충액의 4% 파라포름알데히드(PFA)에 담그십시오.
    2. E9 배아의 경우 달걀 껍질을 열고 가위로 배아를 참수하고 머리를 PBS로 채워진 실리콘 바닥 판으로 옮깁니다. 궤도를 통해 머리를 고정하고 두개골의 상단을 잘라냅니다. 집게를 양쪽에서 뇌 아래에 조심스럽게 놓고 집게의 어깨로 두개골에서 전체 뇌를 들어 올립니다. 뇌를 4 % PFA에 담그십시오.
    3. E15 및 E19 배아의 경우 달걀 껍질을 열고 가위로 배아를 참수하고 PBS로 채워진 실리콘 바닥 판에 머리를 놓습니다. 두개골을 노출시키기 위해 머리 위의 피부를 자릅니다.
    4. 면도기로 두개골을 수직으로 절개하여 전뇌와 꼬리 뇌를 분리합니다. 꼬리 블록을 PBS에 담그고 두개골의 상단을 제거한 다음 두개골에서 뇌를 제거합니다.
    5. 시엽을 통해 뇌를 고정하고 소뇌와 뇌간을 분리합니다. 소뇌 바로 아래에있는 청각 뇌간이 손상되지 않도록주의하십시오. 뇌간에서 가능한 한 많은 경막을 제거한 다음 4 % PFA에 담그십시오.
    6. 배아와 뇌 조직을 4 ° C에서 밤새 4 % PFA에 보관하고 E19 뇌간을 제외하고 24 시간 동안 동일한 조건으로 유지해야합니다.
    7. 고정 후 30 % 자당을 함유 한 PBS에서 조직을 침전 될 때까지 탈수하며, 일반적으로 연령에 따라 1-3 일이 걸립니다.
    8. 뇌간(E15 및 E19)을 슬라이딩 마이크로톰을 사용하여 코로나 평면에서 30 μm로 절편화하였다. PBS에서 절편을 수집하고 면역 염색 전에 4 ° C에서 보관하십시오.
    9. E3 및 E6 배아와 E9 뇌간의 경우 가로 방향으로 50μm로 절단됩니다. PBS에서 섹션을 수집하고 4 ° C에서 보관하십시오. 면역 염색 전에 젤라틴 코팅 현미경 슬라이드에 섹션을 장착하십시오. 이 연령대에 대해 더 두꺼운 부분을 수집하면 조직 처리가 용이합니다.
  2. 청각 덕트
    1. E9, E15 및 E19 배아에서 뇌간을 제거한 후 측두골에 박힌 청각 덕트는 두개골 아래에 쉽게 식별 할 수 있으며 측두골은 주변 두개골에서 쉽게 분리 할 수 있습니다. E9 배아의 경우 전체 측두골을 4 % PFA로 고정하십시오. 오래된 배아의 경우 측두골의 뼈 구조를 제거하여 청각 덕트를 분리하고 청각 덕트를 4 % PFA로 고정하십시오.
    2. 모든 측두골과 청각 덕트를 조직 삽입 전에 밤새 4 ° C에서 4 % PFA에 보관하십시오.
    3. 설명 된대로 조직 삽입을 수행하십시오. 다음과 같이 임베딩 용액을 준비하십시오 : 젤라틴 과립이 팽창하고 침전 될 때까지 찬물에 10 % 젤라틴 (소 피부에서)을 담그십시오 (약 30 분). 혼합물을 ~ 50 ° C로 가열하여 젤라틴을 용해시키고 젤라틴 용액에 20 % 자당을 첨가하고 저어 녹입니다. 젤라틴-자당 용액을 4°C에서 최대 한 달 동안 보관하십시오.
    4. 사용을 위해 젤라틴-자당 용액을 37°C에서 따뜻하게 합니다. 측두골/청각 덕트를 96웰 플레이트의 따뜻한 젤라틴-자당 용액에 37°C에서 가라앉을 때까지 보통 30-60분 동안 담그십시오.
    5. 12 웰 플레이트의 웰 바닥에 투명 필름 스트립을 깔아 놓습니다. 따뜻한 젤라틴 - 자당 용액 층을 추가하고 응고 될 때까지 기다리십시오. 측두골/청이관을 각 우물로 옮깁니다.
    6. 따뜻한 젤라틴 - 자당 용액의 두 번째 층으로 조직을 이식하십시오. 조직의 위치가 젤의 중앙에 있고 청각 덕트가 수평으로 향하도록 조정하십시오. 플레이트를 4°C 냉장고로 조심스럽게 옮기고 젤이 단단해질 때까지 기다립니다.
    7. 투명 필름 스트립을 당겨 젤 조직 블록을 웰 밖으로 옮깁니다. 여분의 젤을 정사각형 블록으로 자르고 블록의 모서리를 잘라 방향을 식별합니다. 젤라틴 블록을 호일 조각으로 감싸고 드라이 아이스에 얼린 다음 절편 될 때까지 -80 ° C에서 보관하십시오.
    8. 저온 유지 장치로 청각 덕트의 경도를 따라 20μm에서 블록을 단면화합니다. 젤라틴 코팅 현미경 슬라이드에 직접 섹션을 장착합니다. 면역염색 전에 슬라이드를 -80°C에서 보관한다.
    9. 면역염색 전에 슬라이드를 예열된 PBS(45°C)에 5분 동안 담가 젤라틴을 용해시킨 다음 슬라이드를 실온 PBS로 3배 세척하여 잔류 젤라틴을 제거합니다.

5. 면역 염색 및 현미경 이미징

참고: 섹션이 슬라이드에 장착되는지 또는 PBS에 자유 부동되는지에 따라 두 가지 유형의 면역 염색이 수행됩니다.

  1. 슬라이드의 면역 염색
    1. PBS로 슬라이드를 각각 3분 동안 10번 세척합니다. 염색 중에 액체가 새는 것을 방지하기 위해 오일 펜으로 섹션이 포함 된 영역에 동그라미를 그립니다. PBS에 5 % 정상 염소 혈청을 함유 한 블로킹 용액으로 섹션을 덮고 실온에서 30 분 동안 배양하십시오.
    2. 1차 항체(사용된 최종 농도는 재료 표 참조)를 0.3% TritonX-100 및 5% 정상 염소 혈청을 포함하는 PBS에 희석합니다. 블로킹 용액을 제거한 다음 1차 항체 용액으로 섹션을 덮습니다. 슬라이드를 바닥에 증류수 층을 함유하는 상자에서 4°C에서 밤새 인큐베이션한다.
    3. PBS로 슬라이드를 3분 동안 10번 헹굽니다. 0.3% TritonX-100을 함유하는 PBS에 1:500으로 희석된 형광 2차 항체를 슬라이드에 도포합니다. 슬라이드를 실온에서 4시간 동안 배양하고 빛으로부터 보호합니다.
    4. PBS로 슬라이드를 3 번 씻으십시오. 슬라이드에 장착 매체 두 방울을 부드럽게 떨어뜨리고 커버 슬립으로 섹션을 덮습니다. 커버슬립과 슬라이드 사이에 기포가 발생하지 않도록 주의하십시오.
  2. 전체 마운트 배아 및 자유 부유 절편에 대한 면역 염색
    1. 배아/절편을 PBS 3x로 웰 플레이트에서 각각 10분 동안 세척합니다. 원심 튜브에서 0.3 % TritonX-100 및 5 % 정상 염소 혈청을 포함하는 PBS의 1 차 항체를 희석합니다. 각 배아/절편을 유리 후크가 있는 튜브에 옮기고 4°C에서 밤새 60rpm으로 셰이커에서 배양합니다.
    2. 배아/절편을 PBS로 3회 세척하여 웰 플레이트에서 각각 10분 동안 세척합니다. 각 배아/절편을 형광 2차 항체 용액으로 채워진 어두운 원심 튜브로 옮기고 셰이커에서 실온에서 4시간 동안 배양합니다.
    3. 배아/절편을 웰 플레이트에서 PBS로 3배 세척합니다. 브러시를 사용하여 PBS가 포함된 15cm 접시에 젤라틴 코팅 현미경 슬라이드에 섹션을 장착합니다. 슬라이드가 약간 건조된 후(~5분) 장착 매체를 두 방울 떨어뜨리고 커버슬립을 놓습니다. 커버슬립과 슬라이드 사이에 기포가 발생하지 않도록 주의하십시오. 이미징을 위해 전체 마운트 조직을 PBS에 보관하십시오.
  3. 이미징
    1. 검은색 배경을 제공하는 탄소 분말이 포함된 실리콘 바닥이 있는 접시에 PBS의 전체 마운트 조직을 이미지화합니다. 앞서 설명한 바와 같이, 상용 이미지 프로세싱 Olympus 소프트웨어 패키지를 사용하여 이미지를 캡처하고 처리한다29.
    2. 앞서 설명한 대로 컨포칼 현미경으로 슬라이드의 섹션을 이미지화합니다20. 10x, 20x 및 63x 대물렌즈가 있는 단일 초점면에서 단면을 이미지화합니다. 동일한 매개 변수를 사용하여 동일한 동물의 모든 이미지를 캡처합니다. 신호 포화를 피하기 위해 레이저 레벨과 이미징 획득 설정을 조정하도록 주의하십시오.
    3. 피지 소프트웨어를 사용하여 이미지 처리를 수행합니다. 설명을 위해 전문 이미지 편집 소프트웨어를 사용하여 이미지 밝기, 대비 및 감마를 조정하십시오.

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결과

다른 부위와 다른 발달 단계에서 난자 전기 천공을 수행함으로써 우리는 청각 주변부 또는 청각 뇌간에서 선택적 FMRP 녹다운을 달성했습니다.

NM의 FMRP 녹다운
닭 Fmr1에 대한 작은 헤어핀 RNA (shRNA)를 앞서 기술된 바와 같이 Tet-On 벡터 시스템 내로 설계하고 클로닝하였다20. in ovo 전기천공을 위한 설정은 그림 1A에 나와 있습니다. 빠른 녹색으로 착색 된 플라스미드 DNA를 HH12에서 r5 / r6 수준으로 신경관에 주입했습니다 (그림 1B-C). 백금 양극성 전극을 r5/6 수준에서 신경관의 양쪽에 배치했습니다(그림 ...

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토론

FMRP의 세포 자율 기능을 결정하기 위해서는 개별 세포 그룹 또는 세포 유형에서 발현을 조작해야합니다. FMRP의 주요 기능 중 하나는 시냅스 형성과 가소성을 조절하는 것이므로 특정 회로의 각 시냅스 구성 요소를 선택적으로 조작하는 것은 시냅스 통신에서 FMRP 메커니즘을 완전히 이해하기 위한 전제 조건입니다. 닭 배아의 난자 전기천공을 사용하여 시냅스 전 AG 뉴런 또는 시냅스 후 NM 뉴런에서 AG-NM 회로에서 FMRP 발현을 표적으로 하는 방법을 시연했습니다. 이를 위해서는 전기 천공을위한 적절한 발달 단계를 선택하고 배아에 전기 천공 전극을 정확하게 배치하는 것이 중요한 단계입니다. NM 뉴런은 HH1223의 r5/6 수준에서 신경관의 신경 전구 세포에서 발생합니다. 같은 단계에서, 두개골 신경 볏 세포는 신경관의 등쪽 끝에서 달팽이관 전정 신경절로 이동하여 미래의 AG 뉴런

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공개 사항

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감사의 글

이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 보조금 (No. 32000697); 광저우 과학 기술 프로그램 (202102080139); 광동 자연 과학 재단 (2019A1515110625, 2021A1515010619); 중앙 대학을위한 기초 연구 기금 (11620324); 지난 대학 교육부 재생 의학 핵심 실험실의 연구 보조금 (No. ZSYXM202107); 중국 중앙 대학 기초 연구 기금 (21621054); 그리고 중국 광동성 의료 과학 연구 재단 (20191118142729581). 지난 대학의 의료 실험 센터에 감사드립니다. 원고를 신중하게 편집해 주신 테라 브래들리 박사에게 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Egg incubation
16 ° C 냉장고MAGAT수정란 저장에 사용됩니다.
난자 인큐베이터SHANGHAI BOXUNGZX-9240MBE
란농장 중국 남부 농업 대학난자는 최적의 생존력을 위해 일주일 안에 사용해야 합니다.
Plasmid preparation
CentrifugeSigma10016
Fast greenSolarbioG1661증류수와 오토클레이브에서 0.1% 작동 용액을 만듭니다.
Plasmid Maxi-prep kitQIAGEN12162Tris-EDTA (TE) buffer에 플라스미드 DNA를 용해시킵니다. endotoxin-free 준비 키트
Sodium AcetateSigma-AldrichS2889핵분해효소가 없는 물에서 7.5M 작업 용액을 만듭니다.
Electroporation 및 Doxycycline 투여
ElectroporatorBTX ECM399
1 mL / 5 mL 주사기광저우 KANGFULAI
해부 현미경CNOPTECSZM-42
DoxcyclineSigma-AldrichD9891각 용량마다 신선한 분주액을 사용하고 -20 & deg;C입니다.
유리 모세관BEIBOBOMEIRD09100.9-1.1 mm * 100 mm
실험실 파라 필름PARAFILMPM996투명 필름
피펫 풀러CHENGDU INSTRUMENT FACTORYWD-2당기는 조건 : 500 °; C 15s
플래티넘 elctrodes홈 메이드직경 0.5 mm, 1.5 mm 간격.
고무 튜브: Sigma-AldrichA5177
Tissue Dissection and Fixation
ForcepsRWDF11020-11팁 크기: 0.05*0.01 mm
기타 수술 도구RWD
파라포름알데히드Sigma-Aldrich158127인산염 완충 식염수에 갓 만든 4% PFA 용액은 4°C에 보관할 수 있습니다. C는 최대 1주일 동안 사용할 수 있습니다.
SYLGARD 184 실리콘 엘라스토머 키트DOW01673921검은색 배경판의 경우 식품 등급의 탄소 분말이 적용됩니다.
Sectioning
CryostatLEICACM1850
GelatinSigma-AldrichG9391소 가죽에서.
슬라이딩 마이크로톰LEICASM2010
Immunostaining
Alexa Fluor 488 염소 안티 마우스Abcamab1501131:500 희석, RRID: AB_2576208
Alexa Fluor 555 염소 안티 토끼Abcamab1500781:500 희석, RRID: AB_2722519
DAPIAbcamab2853901: 1000 희석
Fluoromount-G 장착 매체남부  BiotechSb-0100-01
FMRP 항체Y. Wang, Florida State University#82631:1000 희석, RRID: AB_2861242
Islet-1 항체DSHB39.3F71:100 희석, RRID: AB_1157901
Netwell plateCorning3478
신경필라멘트 항체Sigma-AldrichN41421:1000 희석, RRID: AB_477272
Parvalbumin 항체Sigma-AldrichP30881:10000 희석, RRID: AB_477329
SNAP25 항체Abcamab660661:1000 희석, RRID:
AB_2192052Imaging
Adobe photoshopADOBE이미지 편집 소프트웨어
컨포칼 현미경LEICASP8
형광 실체 현미경OLYMPUSMVX10
Olympus Image-Pro Plus 7.0OlYMPUS상용 이미지 처리 소프트웨어 패키지
수정

참고문헌

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