난자 전기천공을 사용하여 닭 배아의 청각 내이와 달팽이관 핵을 선택적으로 형질감염시켜 회로 조립의 개별 기간 동안 깨지기 쉬운 X 정신 지체 단백질의 세포 그룹 특이적 녹다운을 달성하는 방법을 고안했습니다.
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방법 논문
In ovo 전기천공에 의한 청각회로에서 깨지기 쉬운 X 정신지체 단백질의 세포 자율 기능 해부
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
깨지기 쉬운 X 정신 지체 단백질 (FMRP)은 국소 단백질 번역을 조절하는 mRNA 결합 단백질입니다. FMRP 손실 또는 기능 장애는 지적 장애, 감각 이상 및 사회적 의사 소통 문제를 특징으로 하는 취약 X 증후군(FXS)에서 비정상적인 신경 및 시냅스 활동을 유발합니다. FMRP 기능 및 FXS 발병 기전에 대한 연구는 주로 형질 전환 동물에서 Fmr1 (FMRP를 코딩하는 유전자) 녹아웃으로 수행되었습니다. 여기에서 우리는 닭 배아를 사용하여 회로 조립 및 시냅스 형성 기간 동안 FMRP의 세포 자율 기능을 결정하는 생체 내 방법을 보고합니다. 이 방법은 Fmr1 소형 헤어핀 RNA(shRNA) 및 EGFP 리포터를 포함하는 약물 유도성 벡터 시스템의 단계, 부위 및 방향 특이적 전기천공을 사용합니다. 이 방법을 통해 우리는 청각 신경절 (AG)과 뇌간 표적 중 하나 인 핵 목장 세포 (NM)에서 선택적 FMRP 녹다운을 달성하여 AG-NM 회로 내에서 구성 요소 별 조작을 제공했습니다. 또한 형질주입의 모자이크 패턴은 동물 내 대조군과 이웃 뉴런/섬유 비교를 가능하게 하여 데이터 분석의 신뢰성과 민감도를 향상시킵니다. 유도성 벡터 시스템은 축적된 발달 효과를 최소화하기 위해 유전자 편집 발병의 시간적 제어를 제공합니다. 이러한 전략의 조합은 시냅스 및 회로 개발에서 FMRP의 세포 자율 기능을 해부하는 혁신적인 도구를 제공합니다.
서론
취약 X 증후군(FXS)은 지적 장애, 감각 이상 및 자폐 행동을 특징으로 하는 신경 발달 장애입니다. 대부분의 경우 FXS는 초기 배아 단계1에서 시작하여 취약한 X 정신 지체 단백질 (FMRP, Fmr1 유전자에 의해 암호화 됨)의 전반적인 손실로 인해 발생합니다. FMRP는 일반적으로 뇌의 대부분의 뉴런과 신경교 세포와 감각 기관 2,3,4에서 발현되는 RNA 결합 단백질입니다. 포유류의 뇌에서 FMRP는 다양한 신경 활동에 중요한 단백질을 암호화하는 수백 개의 mRNA와 관련이있을 수 있습니다5. 기존의 Fmr1 녹아웃 동물에 대한 연구는 FMRP 발현이 시냅스 신경 전달의 조립 및 가소성에 특히 중요하다는 것을 보여주었습니다6. 여러 조건부 및 모자이크 녹아웃 모델은 축삭 투영, 수지상 패턴 및 시냅스 가소성을 포함한 여러 발달 이벤트 동안 FMRP 작용 및 신호가 뇌 영역, 세포 유형 및 시냅스 부위에 따라 다양하다는 것을 추가로 입증했습니다.
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프로토콜
계란과 닭 배아는 지난 대학 동물 관리 및 사용위원회에서 승인 한 동물 프로토콜에 따라주의와 존중으로 처리되었습니다.
1. 계란 및 플라스미드 제제
- 계란 준비
- 화남농업대학교에서 신선한 닭고기 수정란(갈루스 갈루스)을 구해 배양 전 16°C에서 보관한다. 최적의 생존력을 위해 도착 후 일주일 이내에 배양을 위해 모든 알을 설정하십시오.
- 알을 수평으로 놓고 햄버거와 해밀턴(HH) 단계 12신경 관 형질감염이 될 때까지 46-48시간 동안 또는 이낭 형질감염에 대해 HH13까지 54-56시간 동안 38°C에서 배양합니다. 난자의 동물 극은 식물 기둥보다 가볍기 때문에 수평 배치는 쉽게 조작할 수 있도록 배아를 난자 상단에 배치합니다. 이 단계와 다음 모든 단계에서 계란을 수평으로 유지하도록주의하십시오.
- 배아의 위치는 손전등을 사용하여 난자 바닥에서 빛을 비출 때 달걀 껍질의 어두운 영역으로 나타납니다. 원하는 HH 단계에서이 손전등 방법을 사용하여 달걀 껍질에 배아의 위치를 연필로 표시하십시오.
- 75 % 에탄올이 함유 된 거즈로 계란을 닦으십시오. 가위 끝으로 계란의 뾰족....
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결과
다른 부위와 다른 발달 단계에서 난자 전기 천공을 수행함으로써 우리는 청각 주변부 또는 청각 뇌간에서 선택적 FMRP 녹다운을 달성했습니다.
NM의 FMRP 녹다운
닭 Fmr1에 대한 작은 헤어핀 RNA (shRNA)를 앞서 기술된 바와 같이 Tet-On 벡터 시스템 내로 설계하고 클로닝하였다20. in ovo 전기천공을 위한 설정은 그림 1A에 나와 있습니다. 빠른 녹색으로 착색 된 플라스미드 DNA를 HH12에서 r5 / r6 수준으로 신경관에 주입했습니다 (그림 1B-C). 백금 양극성 전극을 r5/6 수준에서 신경관의 양쪽에 배치했습니다(그림 .......
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토론
FMRP의 세포 자율 기능을 결정하기 위해서는 개별 세포 그룹 또는 세포 유형에서 발현을 조작해야합니다. FMRP의 주요 기능 중 하나는 시냅스 형성과 가소성을 조절하는 것이므로 특정 회로의 각 시냅스 구성 요소를 선택적으로 조작하는 것은 시냅스 통신에서 FMRP 메커니즘을 완전히 이해하기 위한 전제 조건입니다. 닭 배아의 난자 전기천공을 사용하여 시냅스 전 AG 뉴런 또는 시냅스 후 NM 뉴런에서 AG-NM 회로에서 FMRP 발현을 표적으로 하는 방법을 시연했습니다. 이를 위해서는 전기 천공을위한 적절한 발달 단계를 선택하고 배아에 전기 천공 전극을 정확하게 배치하는 것이 중요한 단계입니다. NM 뉴런은 HH1223의 r5/6 수준에서 신경관의 신경 전구 세포에서 발생합니다. 같은 단계에서, 두개골 신경 볏 세포는 신경관의 등쪽 끝에서 달팽이관 전정 신경절로 이동하여 미래의 AG 뉴런
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 보조금 (No. 32000697); 광저우 과학 기술 프로그램 (202102080139); 광동 자연 과학 재단 (2019A1515110625, 2021A1515010619); 중앙 대학을위한 기초 연구 기금 (11620324); 지난 대학 교육부 재생 의학 핵심 실험실의 연구 보조금 (No. ZSYXM202107); 중국 중앙 대학 기초 연구 기금 (21621054); 그리고 중국 광동성 의료 과학 연구 재단 (20191118142729581). 지난 대학의 의료 실험 센터에 감사드립니다. 원고를 신중하게 편집해 주신 테라 브래들리 박사에게 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Egg incubation | |||
| 16 ° C 냉장고 | MAGAT | 수정란 저장에 사용됩니다. | |
| 난자 인큐베이터 | SHANGHAI BOXUN | GZX-9240MBE | |
| 란 | 농장 중국 남부 농업 대학 | 난자는 최적의 생존력을 위해 일주일 안에 사용해야 합니다. | |
| Plasmid preparation | |||
| Centrifuge | Sigma | 10016 | |
| Fast green | Solarbio | G1661 | 증류수와 오토클레이브에서 0.1% 작동 용액을 만듭니다. |
| Plasmid Maxi-prep kit | QIAGEN | 12162 | Tris-EDTA (TE) buffer에 플라스미드 DNA를 용해시킵니다. endotoxin-free 준비 키트 |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | 핵분해효소가 없는 물에서 7.5M 작업 용액을 만듭니다. |
| Electroporation 및 Doxycycline 투여 | |||
| Electroporator | BTX ECM399 | ||
| 1 mL / 5 mL 주사기 | 광저우 KANGFULAI | ||
| 해부 현미경 | CNOPTEC | SZM-42 | |
| Doxcycline | Sigma-Aldrich | D9891 | 각 용량마다 신선한 분주액을 사용하고 -20 & deg;C입니다. |
| 유리 모세관 | BEIBOBOMEI | RD0910 | 0.9-1.1 mm * 100 mm |
| 실험실 파라 필름 | PARAFILM | PM996 | 투명 필름 |
| 피펫 풀러 | CHENGDU INSTRUMENT FACTORY | WD-2 | 당기는 조건 : 500 °; C 15s |
| 플래티넘 elctrodes | 홈 메이드 | 직경 0.5 mm, 1.5 mm 간격. | |
| 고무 튜브 | : Sigma-Aldrich | A5177 | |
| Tissue Dissection and Fixation | |||
| Forceps | RWD | F11020-11 | 팁 크기: 0.05*0.01 mm |
| 기타 수술 도구 | RWD | ||
| 파라포름알데히드 | Sigma-Aldrich | 158127 | 인산염 완충 식염수에 갓 만든 4% PFA 용액은 4°C에 보관할 수 있습니다. C는 최대 1주일 동안 사용할 수 있습니다. |
| SYLGARD 184 실리콘 엘라스토머 키트 | DOW | 01673921 | 검은색 배경판의 경우 식품 등급의 탄소 분말이 적용됩니다. |
| Sectioning | |||
| Cryostat | LEICA | CM1850 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | 소 가죽에서. |
| 슬라이딩 마이크로톰 | LEICA | SM2010 | |
| Immunostaining | |||
| Alexa Fluor 488 염소 안티 마우스 | Abcam | ab150113 | 1:500 희석, RRID: AB_2576208 |
| Alexa Fluor 555 염소 안티 토끼 | Abcam | ab150078 | 1:500 희석, RRID: AB_2722519 |
| DAPI | Abcam | ab285390 | 1: 1000 희석 |
| Fluoromount-G 장착 매체 | 남부 Biotech | Sb-0100-01 | |
| FMRP 항체 | Y. Wang, Florida State University | #8263 | 1:1000 희석, RRID: AB_2861242 |
| Islet-1 항체 | DSHB | 39.3F7 | 1:100 희석, RRID: AB_1157901 |
| Netwell plate | Corning | 3478 | |
| 신경필라멘트 항체 | Sigma-Aldrich | N4142 | 1:1000 희석, RRID: AB_477272 |
| Parvalbumin 항체 | Sigma-Aldrich | P3088 | 1:10000 희석, RRID: AB_477329 |
| SNAP25 항체 | Abcam | ab66066 | 1:1000 희석, RRID: |
| AB_2192052Imaging | |||
| Adobe photoshop | ADOBE | 이미지 편집 소프트웨어 | |
| 컨포칼 현미경 | LEICA | SP8 | |
| 형광 실체 현미경 | OLYMPUS | MVX10 | |
| Olympus Image-Pro Plus 7.0 | OlYMPUS | 상용 이미지 처리 소프트웨어 패키지 |
참고문헌
- Hagerman, R. J., et al. Fragile X syndrome. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17065(2017).
- Hinds, H. L., et al. Tissue specific expression of FMR-1 provides evidence for a functional role in fragile X syndrome. Nature Genetics. 3 (1....
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